Implementación de dos metodologías diagnósticas para la determinación del viris de influenza porcina
Improvement of two diagnostics methods for detection of influenza swine virus
Recibido: 29-08-07 Aprobado: 28-02-08
Resumen
La influenza porcina, es una enfermedad respiratoria aguda viral altamente contagiosa, de morbilidad elevada y capaz de provocar complicaciones letales. Tiene gran importancia en la industria pecuaria debido a las cuantiosas pérdidas económicas que ocasiona su alta morbilidad. Por esta razón, en este trabajo se implementaron las pruebas de cultivo celular y RT-PCR para las proteínas M, H y N para la determinación del virus de influenza porcina.
En este trabajo, se procesaron y analizaron 82 muestras de hisopos nasales, 12 lavados broncoalveolares y 12 tejidos pulmonares, dando resultados negativos para la detección del virus de influenza. Al comparar la RT-PCR de la proteína M con la de cultivo celular como "Gold Standard" se obtuvo una sensibilidad y especificidad del 100% e índice Kappa de 1, indicando una concordancia muy buena entre las dos pruebas.
Palabras clave: hemaglutinina, influenza, MDCK, neuroaminidasa y RT-PCR.
Abstract
The swine influenza virus, is an acute disease that affects the respiratory tract of the pig, It is highly contagious and have a raised morbility ratio also could turn into a fatal end. This disease has a very important roll into the pig production farms since it is a cause of loses of funds. For that reason, this work implemented the cell culture technique and RT-PCR for M, H and N proteins segments for the fast and accurate diagnosis of this virus.
]]> On this work, were tested 82 nasal swabs, 12 broncoalveolars washes, and 12 lung tissues, given negative results for the swine influenza virus. During the compilation of RT-PCR for M protein segment with the cell culture as a gold standard, it attained a sensibility and specificity of 100% and Kappa index of 1 indicating a good concordance between the two probes.Key words: hemagglutinin, neuroaminidase, influenza, MDCK y RT-PCR.
Introducción
El virus de la Influenza porcina pertenece a la familia Orthomyxoviridae, posee un RNA segmentado de polaridad negativa. Con base en sus diferencias antigénicas existentes entre su nucleoproteína y la proteína de matriz, se dividen en los tipos A, B y C. Los virus de Influenza tipo A poseen distintos subtipos de acuerdo a las 16 hemaglutininas y 9 neuraminidasas. El virus influenza presenta variaciones genéticas frecuentes en los segmentos de RNA. Ellas originan cambios en la secuencia nucleotídica de la neuraminidasa y/o de la hemaglutinina, modificando su composición aminoacídica e identidad antigénica (Samson et al., 2006).
Todos los subtipos de influenza aviar se pueden replicar en cerdos y los porcinos pueden ser infectados por virus de influenza humana. En 1986 se demostró la evidencia que el virus de la Influenza porcina en cerdos de Europa tuvieron su origen en aves, se propagó al humano y ocasionó enfermedad (Kida et al., 1994).
Por esta razón, en este estudio se implementaron dos metodologías diagnósticas, para la detección del virus de la Influenza porcina, mediante el análisis de cepas de referencia y en muestras procedentes de granjas intensivas que fueron seropositivas por medio de la prueba de inhibición de la hemaglutinación.
Materiales y métodos
Virus de referencia
Los virus de Influenza porcina, que se utilizaron para la implementación de las técnicas de cultivo celular y RT-PCR fueron las cepas de referencia internacionales A/ Swine/Iowa/73/H1N1 (aislado del tejido de pulmón) y el virus A/SW/TX/4199/98/ H3N2 (aislado de cerdos clínicamente afectados en Texas). Estos virus fueron adquiridos por el ICA a través del National Veterinary Services Laboratories (NVSL) localizado en Estados Unidos.
Línea celular
]]> La línea celular MDCK que se utilizó para la replicación y producción de stock de los virus fue suministrada por el Laboratorio de Virología del Instituto Nacional de Salud.Muestras
Las muestras que se analizaron en este estudio fueron 86 hisopos nasales de dacrón, 12 tejidos pulmonares de cerdos que presentaron signos y síntomas compatibles con influenza y 12 lavados broncoalveolares.
Las muestras de hisopos nasales se recolectaron y se procesaron de acuerdo a lo descrito en el Manual de vigilancia y diagnóstico de la influenza en animales de la Organización Mundial de la Salud. El sobrenadante se utilizó para realizar el aislamiento viral, y el sedimento se sometió a la prueba de RT-PCR.
Las muestras de tejidos pulmonares se obtuvieron durante la necropsia de cerdos sospechosos de estar infectados con el virus de influenza. Y las muestras de lavados broncoalveolares se obtuvieron de cerdos sacrificados en mataderos, los pulmones mostraron microscópicamente compatibilidad con neumonía intersticial, y fueron analizados mediante la técnica de RT-PCR.
Sensibilidad de la prueba de cultivo celular y RT-PCR
Se realizó inicialmente una prueba para determinar la sensibilidad de las células MDCK para el aislamiento del virus de influenza, con las cepas de referencia siguiendo la técnica descrita en el manual de la OIE (OIE, 2004). Se tomaron las cepas de referencia correspondientes a los virus H1N1 y H3N2 que tuvieran títulos hemaglutinantes por la técnica HI de: 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512 y 1:1024 (0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.1, 2.4, 2.7 y 3.0 log virus) y se inoculó cada virus en frascos de cultivos celulares de 25 cm3 con monocapas de células MDCK de 24 horas de cultivo, a razón de 1 ml del virus por frasco.
Cuando se observó la presencia de efecto citopático, se congelaron los frascos a -70°C por 24 horas y luego se realizó la prueba RT-PCR, utilizando una muestra de células suspendidas.
Procesamiento de las muestras
Los sobrenadantes de las muestras de hisopos nasales procedentes de la centrifugación, se inocularon por duplicado en frascos de cultivos celulares de 25 cm3 con células MDCK en monocapa de 24 horas de acuerdo a lo descrito en el manual de la OIE. (OIE, 2004). Las muestras que no presentaron efecto citopático, se congelaron a -70°C durante 24 horas y luego se centrifugaron a 3000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se inoculó en un nuevo frasco de células MDCK utilizando el mismo procedimiento. Las muestras que no presentaron efecto citopático se sometieron a un tercer pasaje en forma similar. Las muestras del tercer pasaje que no presentaron efecto citopático se analizaron mediante la técnica de RT-PCR.
]]> Extracción de RNA viralLa extracción viral de las muestras de hisopos nasales, tejido pulmonar y lavado broncoalveolar se realizó por el método del Trizol (Gibco BRL), que es una modificación del método del tiocianato de Guanidina descrito por Chomczynski y Sachi, 1987.
Transcripción reversa (RT)
Inicialmente se realizó la transcripción reversa (RT) de la siguiente manera: 5 µl de RNA fueron mezclados con 1.5 µl de random hexamers (Promega, Estados Unidos) de 70 ng/µl y 1.5 µl del primer Uni 12 (Invitrogen life, Technologies) de 25 µM. Esta mezcla se denaturó a 65°C durante 3 minutos en el termociclador (Perkin Elmer Gene PCR system 2400). Luego se agregó la mezcla que contenía los siguientes reactivos con las siguientes concentraciones: Buffer RT (Promega) 1X, dNTPs (Promega) 0.5 mM, RNaseout (Invitrogen) 1U/µl, RT M-MLV (Invitrogen) 5U/µl y agua DEPC hasta completar un volumen final de 25 µl. Esta mezcla se llevó al termociclador a 42°C por 20 minutos y 94°C por 3 minutos. El cDNA que se obtuvo por esta técnica se utilizó para el montaje de la PCR para las proteínas M, H y N.
PCR para la proteína M
Para la PCR, se tomó 3 µL del cDNA obtenido en la RT y se le agregó una mezcla que contenía: MgCl2 (Promega) 1.5 mM, Buffer de PCR (Promega,) 1X, dNTPs (Promega) 0.2 mM, primer MWSN-5 (I) y M1023R (II) (Invitrogen, Life Technologies) 0.6 µM de cada uno, Taq polimerasa (Promega) 0.025U/µl y se agregó agua hasta completar un volumen de 25 µL. Se llevó al termociclador con las siguientes condiciones: denaturalización inicial a 94°C por 2 minutos, 30 ciclos a: 94°C por 1 minuto, 50°C por 1 minuto y 72°C por 3 minutos; y una extensión final a 72°C por 8 minutos.
Las secuencias de los primers utilizados Webster et al., 2002 fueron las siguientes:
MWSN-8: 5' GAA GGT AGA TAT TGA AAG ATG 3'
M1023R: 5'GAA ACA AGG TAG TTT TTT ACT C 3'
Uni 12: 5' AGC AAA AGC AGG 3'
]]> PCR para la H1 y H3Para la PCR, se tomó 2 µl del cDNA obtenido en la RT y se adicionó una mezcla que contenía: MgCl2 (Promega) 1.5 mM, Buffer de PCR (Promega) 1X, dNTPs (Promega) 0.2mM, primers 0.2 µM de cada uno, Taq polimerasa (Promega) 0.02U/µl y se agregó agua DEPC hasta completar un volumen de 25 µl. Se llevó al termociclador con las siguientes condiciones: denaturalización inicial a 95°C por 10 minutos, 40 ciclos a: 95°C por 1 minuto, 50°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto; y una extensión final a 72°C por 7 minutos.
Las secuencias de los primers utilizados (Chiapponi et al., 2003) fueron las siguientes:
H1-550F: 5' AAC AAY AAR GRG AAA GAA GT 3'
H1-1016R: 5' GGG ACD TTY CTT ART CCT GT 3'
H3-175F: 5' CAR ATT GAR GTG ACH AAT GC 3'
H3-896R: 5'GGT GCA TCT GAY CTC ATT A 3'
N1-617F: 5'TGA AAT ACA ATG GCA TAA TAA C 3'
N1-1130R: 5'GGA TCC CAA ATC ATC TCA AA 3'
N2-575F: 5'GGA AAA GCA TGG CTG CAT 3'
]]> N2-1365R: 5'GTG CCA CAA AAC ACA ACA AT 3'Electroforesis
La detección de los productos de PCR se realizó en gel de agarosa al 1,5%, éste se coloreó con bromuro de etidio 1 µl por cada 50 ml de agarosa. Se dispensó 2 µl de loading buffer y 10 µl del producto de PCR en el gel. Se utilizó un patrón de talla molecular de 100 bp (Promega). La electroforesis se corrió a 80 voltios. Los productos visualizados fueron de 1015bp para la PCR de la proteína M y de 467bp para H1y 722bp para H3. Para N1 514bp y N2 791bp. Estos productos fueron visualizados y fotografiados bajo luz ultravioleta con una cámara Polaroid.
Análisis de datos
Se determinaron las características operativas: sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo con sus intervalos de confianza del 95% para la prueba de RT-PCR de la proteína M, teniendo como "Gold Standard" la prueba de cultivo celular. Los resultados obtenidos se analizaron en el programa Epi-info 6.0d.
Resultados y discusión
Aislamiento de cultivo celular
Las cepas de referencia H1N1 y H3N2 con títulos hemaglutinantes 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512 y 1:1024 presentaron efecto citopático en todas las diluciones en un período de tiempo de 18 a 24 horas posinfección (Figuras 1 y 1b).
La línea celular MDCK se seleccionó teniendo en cuenta que es la que presenta mayor sensibilidad para la replicación del virus de influenza. En estudios realizados por Youil et al. determinaron la sensibilidad de las células MDCK y VERO, utilizando la cepa de Influenza H2N2 y observaron que ambas líneas celulares replicaron eficientemente el virus, obteniendo títulos infecciosos hasta de 1011 DICC50/ml, siendo la línea MDCK más eficiente en la replicación viral con una diferencia de 2 Log comparada con las células VERO.
Estos resultados, también fueron reportados y sustentados por Govorkova et al. y Merten et al., en 1999 y 1996 respectivamente. Igualmente, Reina et al., en un estudio comparativo utilizaron células de las líneas MDCK, VERO y MRC-5 en pruebas de aislamiento del virus de influenza a partir de muestras de aspirados nasofaríngeos de humanos y encontraron que las células MDCK tenían 100% de sensibilidad comparada con un 71,4% de las células VERO y un 57,1% de las MRC-5.
Muestras de campo
Las muestras de los sobrenadantes de los hisopos nasales inoculados en las células MDCK en los 3 pases sucesivos no presentaron efecto citopático cuando se observaron al microscopio invertido.
Estas muestras son adecuadas para el aislamiento del virus de influenza y éste se detecta con relativa facilidad en la fase aguda de la enfermedad, es decir, entre 1-3 días posinfección (Webster et al., 2002, Richt et al., 2003, Heikkinen et al., 2002; Brown, 1999).
La negatividad de las muestras de los hisopos nasales al virus de Influenza porcino, podría atribuirse a que los cerdos no se encontraban en la fase aguda de la influenza, o no fueron tomadas en el momento preciso de la máxima liberación del virus, o que este cuadro clínico pudo ser producido por otros agentes virales o bacterianos presentes en el país como PRRS, Mycoplasma, Pasterella, Bordetella, APP entre otros.
Reacción en cadena de la polimerasa
Sensibilidad de los primers
]]> En el análisis de la RT-PCR de los virus de referencia H1N1 y H3N2 utilizando los primers correspondientes y sus respectivos marcadores de peso molecular de las proteínas M, H y N, se obtuvieron bandas en todas las diluciones del virus, así como en los controles positivos.La visualización de las bandas correspondientes a las proteínas M, N y H de las diluciones del virus ensayadas, muestran la gran sensibilidad de esta técnica para detectar bajos títulos virales, lo cual asegura la detección de virus en caso de que las muestras seleccionadas en este estudio presenten baja carga viral. Hecho sustentado en el Manual de Diagnóstico y Vigilancia de la OMS (Webster et al., 2002).
De la misma manera, Ellis et al. en 1997 probaron la sensibilidad de los primers H1, H3, N1 y N2 para el virus de Influenza A, por medio diluciones seriadas de los virus de referencia y en todas las diluciones visualizaron banda, lo que demuestra que la RT-PCR es un método sensible para detectar pequeñas cantidades de virus, además permite realizar la subtipificación del virus.
Muestras de campo
Todas las muestras de hisopos nasales, lavado broncoalveolar y tejido pulmonar evaluadas dieron resultados negativos cuando se analizaron por la técnica de RTPCR empleando primers para la proteína M (Figura 2). La sensibilidad de esta técnica, para detectar genoma de virus de influenza ha sido sustentado por varios autores Ellis et al., 1997, Carman et al., 2000, Plakokefalos et al., 2000. Pachucki et al., 2004, Zhang et al., 1991, y Boivin et al., 2001. En un estudio donde se analizaron 1298 muestras de hisopos nasofaríngeos de pacientes humanos con síntomas compatibles con Influenza el 42.4% de las muestras fueron positivas por RT-PCR comparados con 30.9% en cultivos celulares.
Boivin et al. en 2001 compararon las técnicas de inmunoensayo, cultivo celular y RT-PCR con muestras de hisopos nasofaríngeos y obtuvieron resultados muy similares entre la RT-PCR y el cultivo celular. Estos hallazgos soportan los resultados obtenidos en este estudio descartándose la posibilidad de infección con virus de influenza en los animales seleccionados en el trabajo.
Chiapponi et al. en 2003, realizaron un estudio donde tipificaron los virus de influenza porcina H1N1, H1N2 y H3N2 por medio de la técnica de RT-PCR utilizando 12 cepas de referencia que fueron cultivadas previamente en la línea celular MDCK, las cuales mostraron efecto citopático y a partir de las suspensiones de estos cultivos realizaron la extracción del RNA viral. Los primers utilizados en la RT-PCR, por estos autores, mostraron las proteínas específicas virales y una sensibilidad del 95%, razón por la cual se seleccionaron éstos para la presente investigación.
Con respecto al análisis estadístico, la técnica de cultivo celular y RT-PCR con un intervalo de confianza de 95% demostraron una sensibilidad del 100% y especificidad del 100% e índice Kappa de 1. Lo que indica que hay una concordancia muy buena entre las dos técnicas indicando que con RT-PCR se obtienen los mismos resultados que con la prueba de cultivo celular.
]]> Igualmente, Atmar et al. en 1996 compararon la técnica de cultivo celular como "Gold Standard" "versus" la RT-PCR y kits comerciales de ELISA para el diagnóstico de Influenza A. Obtuvieron una sensibilidad del 95%, una especificidad del 98% y una eficiencia del 97% con la técnica de RTPCR. Esta técnica fue la que presentó mejores resultados al compararla con el aislamiento, lo que permitió aplicar la prueba para el diagnóstico de Influenza A.Finalmente, a pesar de que en las muestras analizadas no se encontró el virus de la Influenza porcina, se logró la implementación de técnicas para un diagnóstico eficiente y oportuno de la influenza porcina. Teniendo en cuenta, que en Colombia hay evidencias clínicas y serológicas de la enfermedad se requieren confirmar los estudios sobre todo a nivel de granjas porcinas, para aislar y detectar el agente, pues no sólo puede presentar repercusiones económicas a nivel de las explotaciones porcinas, sino también implicaciones en la salud humana.
Conclusiones
La técnica de RT-PCR evaluada para el diagnóstico de la Influenza porcina mostró gran sensibilidad, ya que se detectó banda en todas las diluciones a partir de 1:4 del virus de referencia.
La técnica de RT-PCR para la Proteína M presentó una sensibilidad del 100% y especificidad del 100% comparada con la de cultivo celular como Gold Standard.
El índice de concordancia fue de 1 entre las dos técnicas, esto indica que con RTPCR se obtienen los mismos resultados que con la prueba de cultivo celular.
Todas las muestras tomadas y analizadas en este estudio, resultaron negativas por medio de las técnicas de RT-PCR y cultivo celular, esto se pudo deber a que no fueron tomadas en la fase aguda de la enfermedad o por infecciones subclínicas.
Agradecimientos
Al Instituto Colombiano Agropecuario ICACEISA, a la Asociación Colombiana de Porcicultores (ACP) y al Fondo Nacional de la Porcicultura, por hacer posible la realización de este trabajo.
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