Modelo molecular teórico dei receptor serotoninérgico 5HT_2A acoplado a proteína G

Theoretical molecular model of the G protein-coupled 5HT_2A serotonergic receptor

Modelo molecular teórico do receptor serotoninérgico 5-HT_2A acoplado à proteína G

Rafael Eduardo Malagón Bernal *, Manuel Alejandro Fernández Navas *, Orlando Emilio Acevedo Sarmiento ²

¹ Facultad de Ciencia y Tecnología, Departamento de Química Farmacéutica, Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales, Bogotá D.C., Colombia.
² Departamento de Física, Pontificia Universidad Javeriana, Bogota D.C., Colombia.

*ramalagon@udca.edu.co

Recibido: 29-03-2012; Aceptado: 12-08-2012

Resumen

Palabras clave: receptor proteína G, perfil hidrofobicidad, gráfico Ramachandran, enlace ortoestérico, modelaje molecular.

Abstract

Objective Build a theoretical molecular model of the tertiary structure of the Homo sapiens 5HT_2A receptor from experimentally obtained structures as templates. Materials and methods In the construction of the theoretical model we considered the protocol established by Ballesteros and Weinstein for the construction of the G-protein coupled receptor, by the alignment of the amino acid sequence, hydrophobicity profiles, refinement of loops by spatial restrictions and energy minimization with the force field OPLS_2005. Results The resulting model was validated by the Ramachandran plot with 91.7% of amino acids within the limits set for angles phi and psi and a RMSD of 0.95 A with respect to bovine rhodopsin. Conclusions We obtained a validated theoretical model useful in studies of ligand-receptor docking.

Key words: G protein receptor, hydrophobicity profile, Ramachandran plot, orthosteric site, molecular modelling.

Resumo

Objetivo Construir um modelo molecular teórico da estrutura terciária do receptor 5HT_2A de Homo Sapiens, com estruturas obtidas experimentalmente como moldes. Materiais e métodos. Para a elaboração do modelo teórico se utilizou o protocolo estabelecido por Ballesteros e Weinstein para a construção do receptor acoplado à proteína G, por intermédio de alinhamento da seqiiência de aminoácidos, perfis de hidrofobicidade, refinamento de bucles por restrições espaciais e minimização da energia com o campo de força OPLS_2005. Resultados. O modelo obtido foi validado pelo gráfico de Ramachandran com 91,7% dos aminoácidos dentro dos limites estabelecidos para os ângulos phi e psi, e um RMSD de 0,95 A com respeito à rodopsina de bovino. Conclusões. Obteve-se um modelo teórico validado, útil para a realização de estudos de acoplamento ligante-receptor.

Palavras-chave: receptor proteína G, perfil de hidrofobicidade, gráfico Ramachandran, união ortoestérica, modelo molecular.

Introducción

En la búsqueda constante por identificar nuevas moléculas de fuentes naturales o sintéticas, que generen actividad terapéutica, cumpliendo un papel agonista o antagonista frente a los procesos mediados por receptores, la identificación del blanco molecular se plantea como una de las primeras etapas en la terapia dirigida a blanco, además de la evaluación de su posible sitio de interacción, donde se generará el efecto y las características de unión de la nueva molécula con su blanco terapéutico.

En la determinación experimental de proteínas existen tres métodos para la elucidación de estructuras terciarias y cuaternarias con resoluciones que permiten identificar las posiciones de las moléculas que lo conforman tales como lo son la resonancia magnética nuclear (RMN), la difracción de rayos X y la criomicroscopia con difracción de electrones; sin embargo, éstos presentan problemas puntuales como: La técnica de RMN, que se focaliza en su baja resolución al determinar estructuras de proteínas mayores a 35 KDa; la cristalografía con difracción de rayos X, que requiere en primer lugar, cristales con un alto grado de ordenamiento lo cual implica una gran dificultad en el caso de proteínas de membrana, debido a las fuertes interacciones hidrofóbicas presentes en las proteínas y la necesidad de trabajar en medios con agentes tensoactivos; la criomicroscopia con difracción de electrones, produce imágenes que se obtienen de promediar varias imágenes independientes; para el caso de proteínas de membrana éste último se ha utilizado haciendo uso de cristales bidimensionales, el problema se define en su baja resolución (2).

Hoy en día, las estructuras tridimensionales obtenidas experimentalmente y publicadas se pueden obtener de la base de datos de Brookhaven conocida como PDB (Protein Data Bank), donde diariamente surgen investigaciones con nuevas estructuras; en la actualidad poseen 79356 (Febrero de 2012) (3). No obstante, la gran mayoría de estructuras que se encuentran en la base de datos de PDB corresponden a proteínas inmersas en medios acuosos y tan solo una porción de ellas se refiere a proteínas que se encuentran dentro de una membrana, lo cual dificulta el estudio de interacciones de algunos principios activos con sus blancos terapéuticos. Es por ésto que, al no disponer de una estructura obtenida experimentalmente, se acude a técnicas de modelaje molecular con las cuales se pretende obtener un modelo teórico de la estructura de la proteína o receptor validado para el estudio de interacciones moleculares aplicado al diseño de nuevos fármacos, ésto conlleva a los métodos de predicción de proteínas como alternativa (4).

Hasta 2007 la estructura de rodopsina de bovino (1U19-1GZM), fue la única proteína disponible para la realización de modelos homólogos de receptores acoplados a proteína G (GPCR); hoy en día se dispone de más estructuras de GPCR, tales como el receptor p2 adrenérgico de humano (2RH1), rodopsina de calamar (2Z73), receptor β1 adrenérgico de pavo (2V74), opsina de bovino (3CAP) y receptor de adenosina A2_A de humano (3EML), las cuales dan amplia información de la estructura y diferencias entre rodopsina de bovino con respecto a las otras clases de GPCR subtipo A, particularmente en la orientación y posición de las hélices transmembranales y en la región de la estructura de los bucles (5). El uso de rodopsina de bovino fue planteado por Ballesteros y Weinstein en 1995, donde se contempla el uso del mapa de densidad electrónica de rodopsina de bovino como topología transmembranal, identificando aminoácidos conservados en la familia de GPCR subclase A (6).

El modelaje de proteínas G acopladas a receptor es un proceso incierto, por lo tanto, es importante evaluar la calidad del modelo obtenido para evitar errores en la conformación obtenida debidos a malos alineamientos, dificultad en el modelamiento de regiones de bucles, así como también en el proceso de refinamiento utilizado. La calidad estereoquímica del modelo puede ser evaluada mediante gráficos de Ramachandran, los cuales nos indican la correcta posición de los aminoácidos de acuerdo al estándar de los ángulos phi y psi de éstos para la formación de hélices alfa (a), hojas Beta (b) y bucles (7). Es así que el modelo es válido para estudios biomoleculares y/o aceptado con un 90 % de sus aminoácidos en regiones permitidas según el gráfico de Ramachandran (5, 7, 8).

Entre los receptores acoplados a proteínas G se encuentran los receptores de serotonina estudios realizados han identificado numerosos receptores de serotonina en el sistema nervioso central (SNC), desde el 5HT₁ hasta 5HT₇. Los receptores de serotonina difieren en su función, en su respuesta a diversos compuestos, en sus efectos sobre el sistema de segundo mensajero o en su capacidad excitatoria o inhibitoria; en especifico, los receptores 5HT_2A se expresan en grandes cantidades en diversas regiones corticales, estos receptores son esenciales para la acción de la serotonina 5HT en un gran número de procesos del SNC en donde se ven involucrados la regulación de la conducta, la agresión, estado de ánimo, la modulación de la percepción, el dolor y la ansiedad, entre otros procesos fisiológicos. Debido a que las drogas alteran la conducta, se ha pensado que dichas alteraciones son producto de una modificación en la comunicación intraneuronal; gran cantidad de psicofármacos, incluyendo antipsicóticos atípicos, antidepresivos y ansiolíticos, actúan sobre 5HT_2A, en ello radica la importancia de conocer el mecanismo por el cual se pueda generar un efecto agonista o antagonista para regular la expresión de dicho receptor con respecto a aminas biogénicas en enfermedades que involucran trastornos psiquiátricos; por tal motivo se hace relevante la investigación y diseño de nuevos fármacos con el fin de brindar ayuda a aquellos que padecen este tipo de patologías. (9, 10, 11). Basados en la información obtenida, el blanco terapéutico central a elucidar teóricamente en la presente investigación es la estructura terciaria del receptor 5HT_2A por medio de métodos computacionales validados.

En este trabajo se ha construido un modelo teórico del receptor 5HT2A, utilizando múltiples alineamientos de la secuencia con estructuras α y β adrenérgicas obtenidas experimentalmente como plantillas, fusión de dos propuestas de modelos basados en su estructura y sometido a su respectiva validación.

Materiales y métodos

Para el modelo teórico se partió de la identificación de la secuencia de aminoácidos del receptor 5HT_2A de Homosapiens. (NCBI Reference Sequence: NP_000612.1 PUBMED http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), se abordó la técnica de topología de membrana debido a que ésta contempla la realización de modelos homólogos con un porcentaje de identidad inferior al 30% entre la secuencia en estudio con respecto a estructuras obtenidas experimentalmente (4, 5, 6, 8)

Alineamiento de la secuencia de aminoácidos

También en este protocolo se contempló el análisis de perfiles de hidrofobicidad para identificar regiones inmersas en la membrana y regiones expuestas a un medio hidrofílico. De los cinco modelos obtenidos por I-TASSER del receptor 5HT_2A los cuales provienen de alineamientos múltiples (Tabla 2), se evaluó su conformación estereoquímica por medio de gráficos de Ramachandran y se fusionaron los modelos 1 y 2 manteniendo en la fusión la estabilidad del puente disulfuro (Maestro, versión 9.1, Schrõdinger, LLC, New York, NY, 2010.), (18).

Refinamiento de bucles

Se consideró la predicción de los bucles (bucle del citoplasma CL, bucle Extracelular EL) debido a que sus posiciones conformacionales dentro del gráfico de Ramachandran se encontraban en regiones de alta energía en el medio siendo no permitidas para las posiciones estándar de los ángulos phi y psi (7), usando el método de restricciones espaciales propuesto por Andrei Fiser y colaboradores en el 2003, contenido en el programa ModLoop-MODELLER (http://modbase.compbio.ucsf.edu/modloop/ [Fecha de Cálculo: 15/03/2012]) (19), se refinaron bucles extracelulares (BE1 137-147, BE2 211-227A 227-235B, BE3 349-360) y bucles citoplasmáticos (BC1 101-108, BC2 177-189, BC3 256-315) con una longitud máxima de 12 aminoácidos por segmento a excepción del bucle extracelular No 2 el cual contiene 24 aminoácidos y la cisteína presente en este bucle es la que enlaza a la hélice transmembranal No 3 formando el puente disulfuro. Se adicionaron protones en la estructura utilizando la herramienta de MOLPROBITY previo análisis de gráficos de Ramachandran.

Minimización de energía

El proceso de minimización se llevó a cabo luego de haber obtenido una estructura con arreglos conformacionales y/o refinamiento de ésta, con el fin de disminuir los impedimentos estéricos de la estructura de la proteína obtenida. La minimización de energía del receptor se realizó por mecánica molecular, utilizando como campo de fuerza OPLS-2005 (20) en 100 pasos con radio de corte de 10 A para interacciones no enlazantes, el cual permite arreglar la proteína haciendo un reordenamiento espacial a su geometría disminuyendo así la energía en su conformación; lo que finalmente se busca es que más del 90% de los aminoácidos de la estructura se encuentren en regiones permitidas, en la evaluación por gráficos de Ramachandran (http://molprobity.biochem.duke.edu/ [Fecha de cálculo: 21/03/2011]) (5, 6, 7, 21).

Resultados y discusión

La construcción del Modelo 3D Teórico de la estructura terciaria del receptor 5HT_2A contempla la topología de membrana de rodopsina de bovino y múltiples alineamientos. Los aminoácidos más conservados de la secuencia en estudio y de las plantillas son parte esencial para la identificación de las regiones biológicamente más conservadas y homólogas en las proteínas G acopladas a receptor. De acuerdo con los alineamientos propuestos por el servidor se observa la conservación de los aminoácidos establecidos según Ballesteros y Weinstein, incluyendo el puente disulfuro, indicando que las plantillas seleccionadas se acomodan para la construcción del esqueleto base utilizando estructuras experimentales de última generación las cuales han mejorado su resolución (Tabla 1).

De acuerdo con los alineamientos propuestos por el servidor, calculados con el algoritmo TM-ALIGN, se observa la conservación de los aminoácidos propuestos por Ballesteros y Weinstein incluyendo el puente disulfuro, indicando que las plantillas seleccionadas se acomodan para la construcción del esqueleto base utilizando estructuras experimentales de última generación diferentes de las usualmente utilizadas: las rodopsinas. Las identidades por debajo del 30 % y la cobertura que no supera el 85%, la gran mayoría se encuentran entre el 75% y 68%, sobre la secuencia 5HT_2A son muy pequeñas para hacer uso de una sola plantilla como estructura base, por tal razón se contemplan múltiples plantillas basadas en el parámetro Z-score, definiendo así la energía de separación entre el plegamiento nativo de la estructura experimental con respecto al conjunto de unidades calculadas del plegamiento de la secuencia 5HT_2A y usando como algoritmo TM-Align contemplando alineamientos globales y locales para el ensamble de la estructura base donde extraen de cada proteína experimental fragmentos altamente relacionados con la secuencia adaptando los plegamientos con mayor similitud estructural (Tabla 2), (Figura supl. A).

Una vez obtenidos los modelos se observa que el primero de ellos con C-score = -1.60, presenta una desviación estándar de 10,9±4,6A, debido a las características estructurales que conservan sus aminoácidos, los cuales originan orientaciones diferentes en los segmentos transmembranales modificando la posición de los bucles, que es la región donde es más notoria la desviación estándar con respecto a las estructuras experimentales (Figura 1). También, se debe tener en cuenta que la estructura 5HT_2A no tiene relación estructural cercana con las plantillas utilizadas a lo largo de toda la secuencia, éstas conservan el sitio de enlace ortoestérico que en su estado inactivo se encuentra enlazado formando el puente disulfuro v que su ruptura conlleva a cambios conformacionales activando el receptor desde los sitios alostéricos generando cascadas de señalización como segundos mensajeros, pero comparadas con rodopsina, el sitio de enlace es más grande y abierto al espacio extracelular. Por ésto se realiza una comparación con el mapa de densidad electrónica de la familia de rodopsina de bovino, se hace una comparación estructural con proteínas relacionadas disminuyendo el valor de RMSD (Raíz Media Cuadrática de la Desviación Estándar) a 1.2 A en promedio, acercándose el modelo a estructuras experimentales sin sobreponer sus plantillas como homólogos. (Figura supl. B)

Se plantea el análisis del perfil de hidrofobicidad, representado en el gráfico de Kyte & Doolittle, éste contempla las características fisicoquímicas de los aminoácidos que conforman la proteína dándole función o estructura y establecen los límites para la generación de estructura (hélices a y bucles) (Tabla 3), donde regiones por encima de cero son hidrofóbicas y regiones por debajo de cero son hidrofílicas, se observa la probabilidad propuesta por el perfil de hidrofobicidad que los aminoácidos de la secuencia poseen características fisicoquímicas que determinan la conformación estructural, confirmando que la secuencia estudiada (5HT_2A) contiene propiedades de proteína integral con 7 hélices identificadas por su carácter hidrofóbico, y los respectivos bucles citoplasmáticos y extracelulares por sus características hidrofílicas (Figura 2).

Por otro lado, del modelo obtenido con C-Score= -1.60, se obtuvo los limites transmembranales propuestos para cada hélice y para los respectivos bucles dentro de la conformación se encontraron 3 bucles citoplasmáticos y 3 bucles extracelulares enlazados a las hélices de transmembrana; uno de los bucles (BE 2), compuesto por 24 aminoácidos, el cual representa un reto en el modelaje, puesto que se enfrenta en modelar adecuadamente el bucle evitando impedimentos estéricos y en mantener el enlace puente disulfuro, uno de los más importantes en la conformación de la proteína, pues, es en éste donde se presenta el enlace propuesto para la formación de cistina (enlace ortoestérico) en los aminoácidos CYS 148 de la HTM 3 y la CYS 227 del bucle BE2ab que inicia en la HTM 4 y termina en la HTM 5; la importancia del enlace ortoestérico radica en que es un sitio activo estructural que enlazado se encuentra en su estado inactivo pero al estimular el receptor en regiones alostéricas sufre ruptura del puente disulfuro activando el receptor, modificando la orientación de las hélices transmembranales y generando alguna cascada de señalización para segundos mensajeros o apertura de canales iónicos. En otras investigaciones han contemplado el modelaje directo de los aminoácidos que conforman el puente desde la HTM 3 y el bucles BE2a Y BE2b construyendo un nuevo residuo CYS-S-S-CYS ensamblándolos con restricciones en las HTM para asegurar la conformación (22).

En este trabajo se planteó la fusión de dos modelos generados por I-TASSER (modelo 1 C-score =-1,60 y modelo 2=-1,66, ya que se encontraba en cada uno de ellos estructuras que mantenían el puente disulfuro formado entre las CYS 148 y CYS 227 a una distancia de 2.05 Å; uno de los hallazgos fue la identificación del puente sujetando la CYS227 sobre una hoja b en el modelo 2 ya que en el modelo 1 las hojas β se encontraban, pero eran más pequeñas y no mantenían la CYS sobre la hoja β. Es así que se observar una mayor estabilidad sobre la hoja β del modelo 2 que evita interacciones con los otros bucles debido a los arreglos conformacionales y la longitud de dicha hoja β, impidiendo así la ruptura del puente disulfuro que se puede generar en la minimización de energía. En simulaciones previas se encontraron estos inconvenientes pero fueron solucionados por la hoja β, (Tabla 3, Figura 3, Figura supl C).

Refinamiento estructural

Uno de los problemas que se presentó en el modelo 1 al realizarle arreglos conformacionales de los bucles fue la pérdida de estabilidad en el sitio ortoestérico (puente disulfuro), sufriendo ruptura. De su estabilidad depende su forma para ser sometido a estudio de acoplamiento a receptor ya que se requieren los sitios alostéricos identificados sin impedimentos estéricos que generen interferencia frente al ligando por errores de conformación. La fusión de los modelos 1 y 2 obtenidos por I-TASSER, se contempló debido a la presencia de estructuras definidas tales como hélices a (en mayor proporción), y que una de las hojas b se encontraba la CYS 227, la cual enlaza con la CYS 148, manteniendo el puente disulfuro. Esta fusión fue evaluada mediante gráficos de Ramachandran, obteniéndose 85,7% de los aminoácidos en regiones favorables, evidenciando mejora conformacional con respecto al modelo 1 o modelo preliminar (Figura Supl E). El refinamiento de los bucles se llevó mediante software MODELLER ModLoop, por método de restricciones espaciales en un número máximo de 12 aminoácidos por bucle, corrigiendo todos los impedimentos estéricos y errores de conformación.

Minimización de energía

Una vez ubicados todos los aminoácidos dentro de regiones permitidas del gráfico Ramachandran, se realiza minimización de energía utilizando el campo de fuerza OPLS_2005, el cual está definido por parametrizaciones de interacciones no enlazantes por simulaciones de Monte Carlo, debido a que en el proceso de refinamiento se producen movimientos en los bucles y hélices transmembranales generando cambios conformacionales representados en energía libre alrededor del modelo. En las minimizaciones de energía no es recomendable hacer uso excesivo del campo de fuerza ya que éste conlleva a las estructuras a un reordenamiento y posterior empaquetamiento, esto se ve representando en las posiciones tomadas por los aminoacidos en el gráfico de Ramachandran, encontrandose por fuera de las regiones favorables. La elección del campo de fuerza se atribuye a los arreglos geométricos leves de forma que no inducen al modelo construido al empaquetamiento, ya que el uso de otros campos de fuerza tales como AMBER y CHARMM modifican significativamente la estructura del modelo obtenido rompiendo el puente disulfuro generando así cambios conformacionales sobre el gráfico de Ramachandran, induciendo al modelo a un empaquetamiento; en los estudios experimentales estos rompimientos no se presentan (excepto cuando se ligan los agonistas), es decir, que si en los modelos construidos no existe el puente disulfuro en el estado inactivo de la proteína se impide hacer uso del modelo propuesto en ensayos de acoplamiento (docking)

Durante los diversos procesos de modelaje tales como, la generación de estructuras por el servidor I-TASSER, la fusión de los modelos 1 - 2, el refinamiento y minimización de energia de la estructura, todos fueron sometidos a evaluación de geometría conformacional por medio de graficos de Ramachandran como indicador mediante la herramienta MOLPROBITY.

Del modelo final minimizado se obtuvo en la validación 91,7 % de los aminoácidos ubicados en regiones favorables de su geometría conformacional (Figura supl F). EL RMSD del modelo final minimizado, comparado con estructuras cristalinas relacionadas con el receptor 5HT_2A fue en promedio 0,95 A. Otro aspecto relevante en la validación, durante toda la construcción del modelo se enfatizó en la conservación del sitio ortoesterico (puente disulfuro) en una distancia inferior a 2,8 A que es la distancia requerida para un enlace S-S, ya que éste brinda características estructurales y funcionales a esta clase de proteínas, después de minimizada la energía se verificó la conservación del puente disulfuro de las CYS 148- CYS 227 (Figura 3). Estos resultados demuestran que la estructura terciara del modelo molecular teorico del receptor 5HT_2A de Homo Sapiens fue construido y mantiene las características propias de este tipo de receptores acoplados a proteina G (Figura 4).

Conclusiones

En el presente trabajo se ha seguido el protocolo planteado por Ballesteros y Wenstein en el año de 1995 establecido para la construcción de modelos teóricos de receptores acoplados a proteína G, enfocados en: aminoácidos específicos que son conservados en cada una de las hélices que atraviesan la membrana; perfiles de hidrofobicidad que demuestran las características químicas de los aminoácidos dando posibilidades de los límites transmembranales; asegurar la correcta conformación de la estructura por medio de la evaluación geométrica (Gráfico Ramachandran). Cumplir con los parámetros planteados, el uso de algoritmos, estructuras p adrenérgicas obtenidas experimentalmente y el uso de un campo de fuerza más preciso y adecuado para este tipo de proteínas, permitió construir el modelo del receptor 5HT_2A de Homo sapiens, demostrando la vigencia de dicho protocolo utilizándolo con planteamientos teóricos de última generación aplicados a herramientas computacionales que permiten generar un modelo teórico 3D propuesto para el estudio de acoplamiento de ligando a receptor.

Agradecimientos

Financiación

Este trabajo fue financiado por los autores, como parte del proyecto de grado para la obtención del titulo de químico farmacéutico de la Universidad de ciencias aplicadas y ambientales (U.D.C.A.).

Conflicto de intereses

Los autores manifiestan no tener conflicto de intereses.

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