SELECCIÓN DE BACTERIAS CON CAPACIDAD DEGRADADORA DE HIDROCARBUROS AISLADAS A PARTIR DE SEDIMENTOS DEL CARIBE COLOMBIANO

Silvia Narváez-Flórez¹, Martha L. Gómez² y María M. Martínez³

¹Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras (INVEMAR), Cerro Punta Betín, Santa Marta, Colombia.snarvaez@invemar.org.co
²Ministerio de Medio Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial, Desarrollo Sectorial Sostenible, Calle 37 # 8 -40. Piso 2 anexo Bogotá, Colombia. mgomez@minambiente.gov.co
³Pontificia Universidad Javeriana, Departamento de Microbiología, Cra 7ª # 43-82. Oficina 608 Bogotá, Colombia. mmmartin@javeriana.edu.co

RESUMEN

PALABRAS CLAVE: Biodegradación, Hidrocarburos, Bacterias, ACPM, Petróleo crudo.

ABSTRACT

Thirty one bacterial isolations in minimal salts supplemented medium with hydrocarbons (ACPM or crude oil) as sole carbon source were isolated from sediment samples from the Colombian Caribbean. Bacterial strains underwent selection tests in different concentrations of hydrocarbons; 11 tolerant crude oil and ACPM strains in a range of 1-8%v/v were chosen. A mixed bacterial culture was created and assessed its ability to degrade hydrocarbons in a laboratory-scale test, with a concentration of 2% v/v of ACPM over a period of 21 days. Measurements of biomass in Colony Forming Units (CFU)/mL were used to develop the growth curve of the mixed culture. Hydrocarbons remotion was measured by mass chromatography. The mixed culture was able to degrade the 68.6% of aliphatic hydrocarbons in preference of long chain n- alkanes (C₁₂- C₃₁), reaching a maximum growth of 3.13 x 10⁹ UFC / mL. Degradation of aromatic hydrocarbons was not evidenced under the observation time. Nine of the eleven strains were identified using the biochemical systems BBL and API 50 CHB/E; they belonged to the genus Klebsiella, Chromobacterium, Flavimonas, Enterobacter, Pseudomonas, and Bacillus. The evaluated strains have enzymatic potential to degrade hydrocarbons and it is necessary to characterize them at molecular level in order to develop and effective consortium for field application.

KEY WORDS: Biodegradation, Hydrocarbons, Bacteria, ACPM, Crude oil.

INTRODUCCIÓN

La contaminación por hidrocarburos del petróleo es una problemática de carácter mundial y amplia distribución geográfica, teniendo en cuenta que independiente de la zona afectada (lagos, suelos, zonas freáticas, ríos y playas) por procesos biológicos y físicos, los hidrocarburos tienen como destino final los mares y océanos (Shanidul y Tanaka, 2004). Colombia, único país de Sudamérica con costas en los dos océanos, se ha visto afectada en los últimos años por la contaminación de hidrocarburos producto de las actividades domésticas, industriales y marítimas. Así mismo, por procesos relacionados con la explotación, transporte, manejo del petróleo y sus derivados (Posada et al., 2005; Vallejo et al., 2005).

En la región Caribe existen problemas locales debido a derrames crónicos en los puertos, las refinerías de petróleo, terminales petroleros, por los buques de cabotaje o accidentes de buques de tráfico internacional (Marín et al., 2004). Las zonas costeras más afectadas son Santa Marta, Barranquilla, Cartagena, Golfo de Morrosquillo y Golfo de Urabá. Evaluaciones sobre la contaminación de hidrocarburos derivados del petróleo muestran que los contenidos de Hidrocarburos Disueltos y Dispersos (HDD) han alcanzado valores de 33μg/L (Marín et al., 2004), concentración que supera el valor límite de 10 μg/L establecido por la UNESCO para aguas marinas y costeras no contaminadas (INVEMAR, 2001).

En investigaciones realizadas por Christon et al. (1997), se logró una disminución de hidrocarburos cercana al 95% con la adición de microorganismos al área de tratamiento, mientras que en los campos no tratados la reducción fue del 14%. En el caso del buque petrolero Exxon Valdez, la adición de nutrientes a través de fertilizantes (INIPOL EAP 22 y Custombler) incrementó en una magnitud de tres veces la remoción de petróleo crudo. La adición de nutrientes promueve la biodegradación al aumentar las poblaciones microbianas y la formación de microemulsiones agua-aceite, que reducen la viscosidad y tensión superficial, lo cual a su vez aumenta la disponibilidad del sustrato (Swannell et al., 1996).

En Colombia los procesos de biodegradación han sido enfocados principalmente al tratamiento de suelos. El Centro de Investigaciones Microbiológicas de la Universidad de los Andes ha desarrollado diferentes estudios encaminados al aislamiento y bioaumentación de bacterias nativas degradadoras de crudo en suelos impactados por derrames del oleoducto Caño Limon Coveñas. En otros estudios se han tratado suelos a través de biolabranza y adición de nutrientes, obteniendo porcentajes de degradación de hidrocarburos totales del petróleo entre el 35%-61% (Castro et al., 2004; Vallejo et al., 2005). En el ambiente marino costero se ha trabajado en el campo del aislamiento y caracterización de microorganismos degradadores de compuestos orgánicos en la Bahía de Cartagena (Salamanca, 1999). Bajo este marco de referencia, teniendo en cuenta que son pocas las investigaciones realizadas en Colombia a nivel de biorremediación en ambientes marino costeros, se desarrolló la presente investigación, que tuvo como objetivo seleccionar bacterias aisladas de sedimentos del Caribe colombiano en estaciones históricamente impactadas por hidrocarburos y evaluar su capacidad de degradación, con el fin de que posteriormente puedan ser aplicadas como una herramienta estratégica en la biorremediación de ecosistemas contaminados.

MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismos
Los microorganismos que se emplearon en el presente estudio hacen parte del Cepario de Bacterias Marinas (CBM) del INVEMAR y se aislaron de estaciones históricamente impactadas con hidrocarburos de los departamentos de Bolívar, Magdalena, Sucre y Córdoba (Marín et al., 2004; Figura 1). Se llevó a cabo la siguiente metodología: 50 g del sedimento recolectado con una draga metálica Ekman de 0.05 m³, a una profundidad no mayor a los 15 cm, fueron adicionados a 450 mL de agua de mar estéril, agitados por 15

minutos a 180 rpm a temperatura ambiente. Un mL del sobrenadante se inoculó en 9 mL de caldo de preenriquecimiento N y P (100 mg K₂HPO₄ y 100 mg NH₄ SO4) con crudo al 1% ó ACPM al 1%. Los caldos de preenriquecimiento se incubaron a 35°C con agitación de 180 rpm durante siete días. Transcurrido este tiempo, se transfirió 1 mL de los caldos de preenriquecimiento a 9 mL de caldo MMS (Medio Mínimo de Sales) fresco que contenía: Ca(NO₃)2 (60 mg/L), NaHCO₃ (125 mg/L), KNO₃ (70 mg/L), NH₄Cl (70 mg/L), KH₂PO₄ (100mg/L), FeSO₄ x 7H₂O (10 mg/L), MnCl2 x H2O (7 mg/L), ZnSO₄ (1.5 mg/L), crudo 1% v/v ó ACPM 1% v/v. Las sales empleadas para la preparación del medio fueron grado analítico. Se realizaron tres pases sucesivos a medio MMS fresco, cada siete días hasta completar un tiempo final de incubación de 21 días.

Selección de cepas para ensayo de degradación
Con el fin de elegir microorganismos capaces de degradar hidrocarburos competitivamente, se efectuaron las pruebas de selección horizontal y Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). En la prueba de selección horizontal cada cepa se reactivó en caldo nutritivo (Merck) y se incubó a 35oC por 24 horas. Posteriormente cada cultivo se ajustó al tubo No.1 del patrón de Mac Farland (3x108 células/mL) y se sembró de forma masiva en agar MMS suplementado con 1% de PC y agar MMS suplementado con 1% de ACPM. Las cajas fueron incubadas a 35oC durante siete días. Este procedimiento de presión selectiva se realizó en tres rondas sucesivas; al cabo de la última ronda se observó la capacidad de las cepas para crecer en presencia de ambos contaminantes.

Los ensayos de CMI se realizaron por triplicado y se evaluó un rango de concentraciones del 1%, 2%, 4%, 6%, 8% y 10% de ACPM. En cada tubo de MMS con su concentración determinada de ACPM se inoculó una alícuota de 0.5 mL de la cepa a evaluar proveniente de un caldo nutritivo de 24 horas de crecimiento, ajustado al tubo No.1 del patrón de MacFarland. Los cultivos se incubaron a 35oC y se realizaron observaciones diarias por 21 días. Se estableció como tubos positivos aquellos que presentaron crecimiento por turbidez y disgregación del ACPM (Brown y Braddock, 1990; Haines et al., 1996). Se consideró la CMI de ACPM como la concentración más baja de este compuesto, donde se presentó ausencia de crecimiento y disgregación del ACPM.

Las cepas escogidas en las prueba de selección horizontal y CMI se caracterizaron macroscópica y microscópicamente teniendo en cuenta la morfología bacteriana, coloración de Gram, tamaño, bordes, cromogénesis, elevación y consistencia (Gómez et al., 2006). Las cepas se identificaron bioquímicamente mediante el sistema BBL Crystal y API 50 CHB/E (Biomerieux®).

Ensayos de degradación de ACPM
Los ensayos de degradación se evaluaron a partir de la actividad conjunta de las cepas seleccionadas. Inicialmente, cada cepa proveniente de las pruebas de selección se sembró en 125 mL de medio MMS suplementado con 2% v/v de ACPM. Los cultivos se incubaron por 24 horas a 30oC y 200 rpm (Agitador orbital BWR DS-500). Transcurridas 24 horas se realizó el recuento en cámara de Neubauer para determinar la concentración celular de los inóculos y conformar el cultivo bacteriano mixto, el cual estuvo conformado por cada cepa proveniente del inóculo en una concentración final de 105 células/mL (Palittapongarnpim et al., 1998; Márquez et al., 2001). El ensayo constó de un tratamiento y un control abiótico. En el tratamiento, la unidad experimental se conformó de medio MMS, ACPM al 2% v/v y el cultivo bacteriano mixto. El control abiótico lo conformó el medio MMS y ACPM al 2% v/v. Los cultivos se incubaron permanentemente a 30oC, con tiempos de agitación de 12 horas por día a 200 rpm; cada tratamiento se realizó por triplicado durante 21 días.

Determinaciones microbiológicas y químicas
Para las determinaciones microbiológicas, a partir de las botellas del tratamiento y el control abiótico se realizó el recuento de viables cada tres días por la técnica de dilución y recuento en placa de agar nutritivo (Palittapongarnpim et al., 1998). Con los resultados obtenidos se elaboró la curva de crecimiento.

El análisis de hidrocarburos se realizó los días 0, 10 y 21 siguiendo los métodos de extracción y medición de hidrocarburos descritos por Garay et al. (2003). Las muestras se extrajeron con hexano y se fraccionaron por cromatografía en columna de alúmina (Tamaño de partícula: 0.108 - 0.200 mm). Para el fraccionamiento se utilizaron como eluyentes las siguientes soluciones: n-hexano para la recuperación de los hidrocarburos alifáticos (F1); n-hexano: diclorometano (7:3) para hidrocarburos mono-aromáticos (F2); y diclorometano para hidrocarburos poli-aromáticos (F3). En el análisis se empleó un cromatógrafo de gases con detector selectivo de masas (GC/MSD) HP 6890/5973, equipado con una columna capilar HP5-MS de 30 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno y película de 0.25 μm. El cromatógrafo operó con las siguientes condiciones: programación de temperatura del horno desde 60 °C (1 min) hasta una temperatura final de 300 °C (8 min) a 8 °C/min, inyección Splitless (0.75 min) y temperatura del inyector 280 °C. Como gas de arrastre se utilizó helio a flujo constante de 1 mL/min. Los espectros de masa fueron adquiridos con un detector MSD (280 °C) en un ámbito de 35-450 unidades de masa atómica a 3.8 scan/s.

El porcentaje de degradación del cultivo mixto se estableció por medio de la diferencia de los porcentajes de remoción del tratamiento con el cultivo bacteriano mixto y el control abiótico en el tiempo 0 y 21 (Palittapongarnmin et al., 1998; Gómez, 2003). Los porcentajes de degradación de los alcanos ramificados persistentes, pristano y fitano, se emplearon como indicadores de transformación microbiana (Díaz et al., 2000; Seklemova et al., 2001; Wang y Fingas, 2003). % Remoción Hidrocarburos = (1) % Degradación = (2)

Análisis estadístico
Se determinó la normalidad de los datos de remoción de hidrocarburos aromáticos mediante la prueba de Shapiro Wilk y la homogeneidad de varianzas por medio del test de Bartlett. Cumplidos estos dos supuestos se realizó un análisis de varianza con un nivel de significancia del 5% para determinar si existían diferencias entre los tratamientos bióticos y abióticos en la degradación de ACPM a través del tiempo de muestreo. Para la evaluación de los datos se empleó el programa computarizado Statistic versión 8. El comportamiento de la curva de crecimiento fue descrito con base a los promedios y desviación estándar de los recuentos microbianos diarios.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Selección de cepas para ensayos
A partir de los sedimentos recolectados en la región Caribe se aislaron 31 cepas bacterianas con capacidad de tolerar hidrocarburos del petróleo. Las cepas se aislaron en medio MMS con PC/ACPM y posteriormente se conservaron en el CBM del INVEMAR y en el CIMIC de la Universidad de los Andes. De 31 cepas aisladas se logró la recuperación viable de 26, de las cuales, 12 provenían de medio MMS con ACPM y 14 de medio MMS con PC. Con el grupo de 26 cepas se inició el proceso de selección horizontal. Selección horizontal en petróleo crudo y ACPM De las 14 cepas bacterianas aisladas de PC y evaluadas en ACPM se obtuvo que el 100% fueron capaces de crecer en ACPM, mientras que sólo el 66.7% de las 12 cepas aisladas de ACPM tuvieron capacidad de crecer en PC. En total, el 84.6% (22) de las 26 cepas evaluadas crecieron en las dos mezclas de hidrocarburos. Estos microorganismos se encontraron expuestos al contaminante en su ambiente natural y fueron cultivados en la etapa de aislamiento en presencia de hidrocarburos, lo cual posiblemente, favorece la expresión de las enzimas involucradas en el metabolismo y selección de individuos tolerantes al compuesto. El PC actúa como agente selectivo de microorganismos (Wrenn y Venoza, 1996), al presentar una mezcla compleja de hidrocarburos con mayor concentración de aromáticos de alto peso molecular que el ACPM (Wang et al., 2001), compuestos tóxicos para algunos microorganismos y compuestos del tipo resinas y asfaltenos resistentes a la degradación (Venoza y Zhu, 2003).

De igual forma, el PC induce la selección de microorganismos con capacidades metabólicas para degradar productos refinados del petróleo, como el ACPM, ya que se involucran genes, complejos enzimáticos y vías metabólicas relacionadas. Este proceso es conocido como “aclimatación cruzada” y ha sido registrado por Leahy y Colwell (1990) y Álvarez y Vogel (1991). La capacidad de un microorganismo para asimilar diferentes mezclas de hidrocarburos como fuentes de carbono depende de la especificidad de sus enzimas. Algunas monooxigenasas, dioxigenasas y lipooxigenasas tienen el potencial para convertir el petróleo y sus derivados en enantiómeros que puedan ser asimilados, ampliándose de esta forma el ámbito de sustratos disponibles para el metabolismo (Mahajan et al., 1994; Smits et al., 2002; Van Hamme et al., 2003).

Caracterización e identificación microbiana
Las 11 cepas seleccionadas en las pruebas descritas anteriormente presentaron morfologías bacilares, ocho gram negativas y tres gram positivas, de las cuales ocho se identificaron dentro de la base de datos del BBL crystal y API 50 CHB/E como Klebsiella sp., Chromobacterium sp., Flavimonas orizihabitans, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus brevis, B. pumillus y B. cereus. Klebsiella sp. (Survery et al., 2004), F. orizihabitans (Lanfraconi et al., 2003; Van Hamme et al., 2003), E. cloacae (Saadoun, 2002) y Bacillus spp. (Díaz et al., 2000; Kazunga y Aitken, 2002; Márquez-Rocha et al., 2005) han sido aisladas frecuentemente de suelos contaminados con compuestos petrogénicos, los cuales utilizan como única fuente de carbono y energía. De igual manera ha sido registrado por otros autores el aislamiento de estas especies en ambiente marinos (Roy et al., 2002; Kawakami y Nishimura, 2006). Pseudomonas es el género que con mayor frecuencia se aísla de ambientes contaminados con hidrocarburos (Norman et al., 2002) y de la cual mayor información ha sido registrada; se conoce su capacidad para crecer sobre una amplia variedad de hidrocarburos del petróleo como benceno, naftaleno, tolueno (Haigler et al., 1992), gasolina, kerosene y diesel (Wongsa et al., 2004). También se han estudiado los complejos enzimáticos y los plásmidos relacionados en la asimilación y degradación del contaminante relacionado (Hamamura et al., 2001; Smits et al., 2002). En su gran mayoría las bacterias degradadoras de hidrocarburos se encuentran en el grupo de gram negativas (Ruberto et al., 2003), los lipopolisacáridos presentes en sus membranas ayudan a la formación y estabilización de emulsiones de hidrocarburos en sistemas acuosos y contribuyen al incremento en la superficie de ataque sobre el contaminante, para su posterior asimilación (Sikkema et al., 1995). Ensayos de degradación del ACPM Finalizado el período de incubación de los ensayos de degradación de ACPM se evidenció una disminución total de alifáticos en términos de n-alcanos del 92.15%, donde el cultivo bacteriano degradó el 68.61 % y por factores abióticos se removió el 23.54% (Tabla 1). En la figura 2 se muestra el perfil cromatográfico de masas del ACPM de los días cero y 21 del tratamiento y en la figura 3 se muestra el comportamiento individual de los n-alcanos en el tratamiento y el control abiótico de los días cero y 21 en términos de abundancia relativa, por lo cual la abundancia de cada compuesto se encuentra comparada y manifestada en relación con C-15, que fue el alcano más abundante en el día cero del ensayo (Abundancia relativa/C-15), de acuerdo con Guyomarch (2002). En ambas figuras

se observa la remoción de los alcanos de cadena larga (C₁₂- C₃₁), con porcentajes de degradación entre 75%- 85% por acción microbiana, mientras que los alcanos menores a doce átomos de carbono no fueron detectados en las muestras. Diferentes autores han señalado que los alifáticos de cadena corta, se volatilizan en las primeras horas después de un derrame y por sus propiedades tienden a ser tóxicos para las bacterias (Cookson, 1995; Solano et al., 2000).

El pristano y fitano, alcanos ramificados más resistentes a la degradación que los n-alcanos y empleados como indicadores de transformación biológica, fueron degradados en 30% y 73.8% respectivamente (Figura 3). En algunos casos, se ha registrado la no degradación de estos compuestos o valores inferiores a los hallados en este ensayo (Sharma y Pant, 2000; Ghazali et al., 2004; Penet et al., 2004).

Finalizado el ensayo no se observaron diferencias significativas en la remoción de hidrocarburos aromáticos (mono y poliaromáticos) entre el control abiótico (3.6%) y el tratamiento con bacterias (3.5%), obteniendo valores no relevantes de biodegradación (datos no mostrados). Resultados similares fueron obtenidos por Ruberto et al. (2003), quienes encontraron diferencias significativas en la degradación de aromáticos entre el control abiótico y el tratamiento sólo 20 días después de haber iniciado el ensayo, sugiriendo que las pérdidas por factores abióticos solapan el metabolismo microbiano y se hace necesario prolongar el tiempo de las mediciones para su detección.

Determinaciones microbiológicas
El comportamiento exhibido por el cultivo bacteriano mixto en la curva de crecimiento mostró una etapa de crecimiento exponencial entre los días cero y seis, con valores promedio de 2.98 x 10₆ y 1.33 x 10₉ UFC/mL respectivamente, seguido de un descenso poblacional en el día nueve y continuo ascenso en el día doce, punto donde inicia una etapa de declive que se extiende hasta el día 21, obteniendo un valor final de 1.29 x 10₈ UFC/mL. Se determinó que la población logró su máximo crecimiento durante los días seis y doce con valores de 1.33 x 10₉ UFC/ml y 3.13 x 10₉ UFC/ml, lo cual se correlacionó con la disminución de hidrocarburos alifáticos que las cepas emplearon como fuentes de carbono y energía (Figura 4).

Los valores poblacionales alcanzados obedecen a una oferta elevada de sustratos. El diesel o ACPM es una fuente rica de hidrocarburos alifáticos y estos son más susceptibles al ataque microbiano, seguidos por los hidrocarburos ramificados, aromáticos de bajo peso

molecular, y por último los aromáticos de alto peso molecular y cicloalcanos (Leahy y Colwell, 1990; Plohl y Leskovsek, 2002).

La curva de crecimiento del cultivo mixto mostró un descenso poblacional en los días 10 y 15, éstos cambios se llevaron a cabo como producto de las sucesiones bacterianas al interior del cultivo mixto, posiblemente cada cepa tuvo un papel fundamental en la transformación de los hidrocarburos, ya que generan compuestos intermediarios que pueden subsecuentemente ser empleados por otros microorganismos o beneficiar a otras cepas por remoción de compuestos tóxicos, estableciendo entre ellas relaciones sinérgicas que generan un proceso de degradación mayor (Venoza y Zhu, 2003;Ghazali et al., 2004). Kaplan y Kitts (2004) asocian los descensos poblacionales con cambios en las fases de degradación rápidalenta donde se presenta cambios en la dominancia y diversidad de determinadas especies, lo cual esta influido a su vez por la disponibilidad o no de un sustrato.

Las cepas seleccionadas en el cultivo mixto poseen capacidades metabólicas para tolerar altas concentraciones de hidrocarburos, asimilar y degradar los mismos. Estas características son el punto de partida para la investigación del metabolismo y de las interacciones microbianas intraespecíficas que se generan al interior del cultivo mixto, con el fin de conformar un consorcio microbiano de efectiva aplicación en campo.

AGRADECIMIENTOS

BIBLIOGRAFÍA

1 Álvarez, P. y T. Voguez. 1991. Substrate interactions of benzene, toluene, and para-xylene during microbial degradation by pure cultures and mixed culture Aquifer Slurries. Appl. Environ. Microbiol., 57: 2981-2985.        [ Links ]

2 Brown, E. y J. Braddock. 1990. Sheen screen, a miniaturized most-probable-number method for enumeration of oil-degrading microorganisms. Appl. Environ. Microbiol., 56: 3895-3896.         [ Links ]

3 Castro, L., M. Perdomo y J. Benavides. 2004. Efecto de la adición de fertilizantes inorgánicos compuestos en la degradación de hidrocarburos en suelos contaminados con petróleo. NOVA, 2(2): 39-49.        [ Links ]

4 Christon, J., G. Hurst y R. Knudeen. 1997. Manual of environmental microbiology. American Society for Microbiology. ASM Press., Washington. 1138 p.         [ Links ]

5 Cookson, J. 1995. Bioremediation engineering: Design and application. Mc Graw Hill INC, Nueva York. 524 p.         [ Links ]

6 Díaz, M., S. Grigson, C. Pepita y G. Burgués. 2000. Isolation and characterization of novel hydrocarbon-degradin euryhaline consortia form crude oil and mangrove sediments. Mar. Biotechnol., 2: 522-532.        [ Links ]

7 Garay, J., G. Ramírez, J. Betancourt, B. Marín, B. Cadavid, L. Panizzo, L. Lesmes, J. Sánchez, H. Lozano y A. Franco. 2003. Manual de técnicas analíticas para la determinación de parámetros fisicoquímicos y contaminantes marinos: aguas, sedimentos y organismos. INVEMAR, Santa Marta. 177 p.         [ Links ]

8 Ghazali, F., R. Salía, A. Sallehi y M. Basri. 2004. Biodegradation in soil by microbial consortium. Internat. Biodeter. Biodegr., 54: 61-67.         [ Links ]

9 Gómez, M. 2003. Selección de un consorcio bacteriano aeróbico de la Ciénaga Grande de Santa Marta con capacidad degradadora del plaguicida organoclorado (aldrín). Tesis M.Sc. en Microbiol., Univ. Nacional de Colombia, Santa Marta.121 p.         [ Links ]

10 Gómez, M., L. Vivas, R. Ruíz, V. Reyes y C. Hurtado. 2006. Bacterias marinas nativas degradadoras de compuestos orgánicos persistentes en Colombia. INVEMAR, Santa Marta. 32 p.         [ Links ]

11 Guyomarch, J. 2002. Identification du fuel du Prestige. Selon les protocoles et recommandations du groupe de travail européen CEN BT / TF 120 oil identification. Rapport No. GC. 02-15. CEDRE. Brest cedex- Francia. 22 p.         [ Links ]

12 Haigler, B., C. Pettigrew y J. Spain. 1992. Biodegradation of mixtures of substituted benzenes by Pseudomonas sp. strain JS150. Appl. Environ. Microbiol., 58: 2237-2244.         [ Links ]

13 Haines, J., B. Wrenn, E. Holder, K. Strohmeir, R. Herrongton y A. Venosa. 1996. Measurement of hydrocarbondegradading microbial populations by a 96-well plate most-number procedure. J. Ind. Microbiol., 16: 36-41.         [ Links ]

14 Hamamura, N., C. Yeager y D. Arp. 2001. Two distinct monooxygenases for alkane oxidation in Nocardioides sp. Strain CF8. Appl. Environ. Microbiol., 67: 4992-4998.         [ Links ]

15 INVEMAR. 2001. Informe del estado de los ambientes marinos y costeros en Colombia: 2000. INVEMAR, Santa Marta. 138 p.         [ Links ]

16 Kaplan, C., y C. Kitts. 2004. Bacterial succession in a petroleum land treatment unit. Appl. Environ. Microbiol., 70 (3): 1777-1786.         [ Links ]

17 Kawakami, Y. y H. Nishimura. 2006. Degradation of lubricating oils by marine bacteria observed by quantitative mass spectrometry. J. Ocean., 37 (1): 1-7.         [ Links ]

18 Kazunga, C. y M. Aitken. 2000. Products from the incomplete metabolism of pyrene by polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 66: 1917-1922.         [ Links ]

19 LaGrega, M., P. Buckingham y J. Evans. 1996. Gestión de residuos tóxicos. Tratamiento, eliminación y recuperación de suelos. Vol. I y II. McGraw-Hill, Nueva York. 1316 p.         [ Links ]
20 Lanfranconi, M., H. Álvarez y C. Studdert. 2003. A strain isolated from gas oil-contaminated soil displays chemotaxis towards gas oil and hexadecane. Environ. Microbiol., 5: 1002-1008.         [ Links ]

21 Leahy, J. y R. Colwell. 1990. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. Microbiol. Rev., 54 (3): 305-315.         [ Links ]

22 Mahajan, M., P. Phale y C. Vaidyananthan. 1994. Evidence for the involvement of multiple pathways in the biodegradation of 1- and 2-methylnaphthalene by Pseudomonas putida CSV86. Arch. Microbiol., 161: 425-433.         [ Links ]

23 Marín, B., J. Garay, G. Ramírez, J. Betancourt, W. Troncoso, M. Gómez, J. Sánchez, B. Cadavid, J. Acosta, J. Vivas, M. Casas, P. Lozano y L. Arias. 2004. Diagnóstico y evaluación de la calidad ambiental marina en el Caribe y Pacífico colombiano. Red de vigilancia para la conservación de ambientes marinos y costeros de Colombia. INVEMAR, Santa Marta. 298 p.         [ Links ]

24 Márquez, F., V. Hernández y T. Lamela. 2001. Biodegradation of diesel oil in soil by a microbial consortium. Water Air Soil Pollut., 128: 313-320.         [ Links ]

25 Márquez-Rocha, F., J. Olmos, M. Rosano y M. Muriel. 2005. Determination of the hydrocarbon-degrading metabolic capabilities of tropical bacterial isolates. Int. Biodeterior. Biodegrad., 55: 13-23.         [ Links ]

26 Norman, R., R. Frontera-Suau y P. Morris. 2002. Variability in Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide expression during crude oil degradation. Appl. Environ. Microbiol., 68: 5096-5103.         [ Links ]

27 Núñez, R. 2003. Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la biorremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de doctorado. Universidad de la Habana, La Habana. 65 p.         [ Links ]

28 Palittapongarnpim, M., L. Pokethitiyook, E. Suchart. y M. Tangbanluekal. 1998. Biodegradation of crude oil by soil microorganisms in the tropic. Biodegradation, 9: 83-90.         [ Links ]

29 Penet, S., R. Marchal, A. Sghir y F. Monot. 2004. Biodegradation of hydrocarbon cuts for diesel oil formulation. Appl. Environ. Microbiol., 66: 40-47.         [ Links ]

30 Plohl, K. y H. Leskovsek. 2002. Biological degradation of motor oil water. Acta Chim. Slov., 49: 279-289.         [ Links ]

31 Posada, B., B. Marín, W. Troncoso, L. Vivas y M. Gómez. 2005. Estado del medio ambiente abiótico. 11-68. En: INVEMAR. Informe del estado de los ambientes marinos y costeros en Colombia. INVEMAR, Santa Marta. 360 p.         [ Links ]

32 Ramos, J., E. Duque, J. Rodríguez-Herva, P. Godoy, A. Haïdour, F. Reyest. y A. Fernández. 1997. Mechanisms for solvent tolerance in bacteria. J. Biol. Chem., 272: 3887-3890.         [ Links ]

33 Rojas, A., E. Duque, G. Mosqueda, G. Golden, A. Hurtado, J. Ramos y A. Segura. 2001. Three efflux pumps are required to provide efficient tolerance to toluene in Pseudomonas putrida DOT-T1E. J. Bacteriol., 183: 3967-3973.         [ Links ]

34 Rojas-Avelizapa, N., R. Rodríguez, E. Villanueva, J. Martínez y H. Poggi. 1999. Transformer oil degradation by an indigenous microflora isolated from a contaminated soil. Resour. Conserv. Recycl., 27: 15-26.         [ Links ]

35 Roy, S., H. Dipak., D. Biswas y R. Kumar. 2002. Survey of petroleum-degrading bacteria in coastal waters of Sunderban Biosphere Reserve. World J. Microbiol. Biotechnol., 18 (6): 575-581.         [ Links ]

36 Ruberto, L., S. Vázquez y W. Mac Cormack. 2003. Effectiveness of the natural bacterial flora. Biostimulation and bioaugmentation on the bioremediation of a hydrocarbon contaminated Antartic soil. Internat. Biodeter. Biodegr., 52: 115-125.         [ Links ]

37 Saadoun, I. 2002. Isolation and characterization of bacteria from crude petroleum oil contaminated soil and their potential to degrade diesel fuel. J. Basic Microbiol., 42: 422-430.         [ Links ]

38 Salamanca-Pinzón, S. 1999. Degradación de hidrocarburos por bacterias aisladas de la Bahía de Cartagena. Tesis Microbiol. Industrial. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá.         [ Links ]

39 Seklemova, E., A. Pavlova y K. Kovacheva. 2001. Biostimulation-based bioremediation of diesel fuel: field demostration. Biodegradation, 12: 311-316.         [ Links ]

40 Sharma, S. y A. Pant. 2000. Biodegradation and conversión of alkanes and crude oil by marine Rhodococcus sp. Biodegradation, 11: 289-294.         [ Links ]

41 Shanidul, I. y M. Tanaka. 2004. Impacts of pollution on coastal and marine ecosystems including coastal and marine fisheries approach for management: a review and synthesis. Mar. Pollut. Bull., 48: 624-649.         [ Links ]

42 Sikkema, J., J. Bont y B. Poolman. 1995. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons. Microbiol. Rev., 59 (2): 201-222.         [ Links ]

43 Smits, T., S. Balada, B. Witholt y J. Beilen. 2002. Functional analysis of alkane hydroxylases from Gram-negative and Gram-positive bacteria. J. Bacteriol., 184: 1733-1742.         [ Links ]

44 Solano, F., R. Marchal, S. Casarégola, C. Vasnier, J. Lebeault y J. Vandecasteele. 2000. A mycobacterium strain with extended capacities for degradation of gasoline hydrocarbons. Appl. Environ. Microbiol., 66 (6): 2392-2399.         [ Links ]

45 Survery, S., S. Ahmad, S. Subhan, M. Ajaz y S. Ajaz-Rasool. 2004. Hydrocarbon degrading bacteria from Pakistani soil: Isolation, identification, screening and genetical studies. Pakistan J. Biol. Sci., 7: 1518-1522.         [ Links ]

46 Swannell, R., K. Lee y M. McDonagh. 1996. Field evaluations of marine oil spill bioremediation. Microbiol. Rev., 60 (2): 342-365.         [ Links ]

47 Vallejo, V., L. Salgado y F. Roldán. 2005. Evaluación de la bioestimulación en la biodegradación de TPHs en suelos contaminados con petróleo. Rev. Col. Biotec., 2 (2): 67-78.         [ Links ]

48 Van Hamme, J., A. Singh y O. Ward. 2003. Recent advances in petroleum microbiology. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67: 503-549.         [ Links ]

49 Venosa, A. y X. Zhu. 2003. Biodegradation of crude oil contaminating marine shorelines and freshwater wetlands. Spill Sci. Technol. Bull., 8: 163-178.         [ Links ]

50 Wang, Z. y M. Fingas. 2003. Development of oil hydrocarbon fingerprinting and identification techniques. Mar. Pollut. Bull., 47: 423-52.         [ Links ]

51 Wang, Z., M. Fingas y L. Sigouin. 2001. Characterization and identification of a "mistery" oil spil from Québec (1999). J. Chromatogr., 909: 155-169.         [ Links ]

52 Wongsa, P., M. Tanaka, A. Ueno, M. Hasanuzzaman, I. Yumoto y H. Okuyama. 2004. Isolation and characterization of novel strains of Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens possessing high efficiency to degrade gasoline, kerosene, diesel oil, and lubricating oil. Curr. Microbiol., 49: 415-422.         [ Links ]

53 Wrenn, B. y A. Venosa. 1996. Selective enumeration of aromatic and aliphatic hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable-number method. Can. J. Microbiol., 42: 252-258.        [ Links ]

FECHA DE RECEPCIÓN: 02/09/05             FECHA DE ACEPTACIÓN: 10/04/08