Selección de soportes magnéticos para la inmovilización de Ureasa

Magnetic supports selection for Urease inmobilization

Hugo A. Rojas
E-mail: hugo.rojas@uptc.edu.co

José J. Martínez
E-mail: jose.martinez@uptc.edu.co

Annie Y. Vargas
E-mail: annie.vargas@uptc.edu.co

Escuela de Ciencias Químicas. Facultad de Ciencias. Grupo de Catálisis (GC-UPTC). Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Tunja, Colombia.

Resumen

Sólidos magnéticos tipo Fe₃O₄, Fe₃O₄-NH₂, Fe₃O₄@SiO₂ y Fe₃O₄@SiO₂-NH se usaron como soportes en la inmovilización de la ureasa, estos sólidos fue caracterizados por análisis de fisisorción de N2 a 77K, curvas de magnetización y FTIR. La actividad enzimática se evaluó por descomposición de la urea. Los sólidos presentan características magnéticas que les permite fácilmente ser separados. La enzima inmovilizada mejoró notablemente su actividad enzimática comparada con la enzima libre. Para los sólidos Fe₃O₄-NH₂, y Fe₃O4@SiO₂-NH₂ se observó una mayor cantidad de enzima acoplada.

Palabras clave: APTES, inmovilización, magnetita, soportes, ureasa.

Abstract

Fe₃O₄, Fe₃O₄-NH₂, Fe₃O₄@SiO₂ y Fe₃O₄@SiO₂-NH₂ as magnetic supports were studied for the urease immobilization. The solids were characterized by N₂-physical adsorption at 77 K, magnetization curves and FTIR. Activity assays were evaluated by urea decomposition. The magnetic properties of solids allow an easy separation. The immobilized enzyme improved the enzymatic activity compared to the free enzyme. In Fe₃O₄-NH₂ and Fe₃O₄@SiO₂-NH₂ was observed allows a greater amount of enzyme coupled.

Keywords: APTES, immobilization, magnetite, supports, urease.

1. Introducción

A pesar de esto, las enzimas sufren de numerosos problemas al momento de la aplicación práctica, como pérdida de la estabilidad frente a pH, calor u otros factores, difícil recuperación y re-uso en un sistema de reacción, que ocasionan altos costos de operación. Estas deficiencias evitan la explotación eficaz de las ventajas técnicas y económicas de las enzimas, especialmente en una amplia variedad de reacciones de bio-transformación (Demir et al., 2011, Cao et al., 2012)). Hay técnicas que permiten mejorar la estabilidad de la enzima tales como la inmovilización, la modificación enzimática, ingeniería de proteínas, entre las cuales la inmovilización es el método más frecuentemente utilizado para mejorar las características de estas (Cao, et al., 2012).

En los últimos años, se han utilizado nanopartículas como soportes para la inmovilización de enzimas, puesto que proporcionan una gran área superficial, mejorando la eficiencia catalítica de las enzimas inmovilizadas, sin embargo la recuperación de la enzima inmovilizada en nano partículas es a menudo limitada (Hong et al., 2009, Ansari and Husain, 2012, Cao et al., 2012, Ashtari et al., 2012, Jiang et al., 2009). Recientemente, el uso de nanopartículas magnéticas ha tomado gran auge debido a sus interesantes propiedades químicas y físicas tales como la estabilidad, biocompatibilidad y superparamagnetismo, baja toxicidad, reducción de la auto agregación y fácil separabilidad de la mezcla de reacción mediante la aplicación de un campo magnético (Netto, C. G. C. M. et al., 2013). Poseen además una amplia gama de aplicaciones en la inmovilización de células y enzimas, sistemas de bioseparación, inmunoensayos, administración de fármacos y biosensores (Ashtari, K. et al., 2012).

Las nanopartículas magnéticas pueden ser funcionalizados por grupos especiales (por ejemplo -OH , -COOH , -NH₂ ) (Feng, B. et al., 2008) apto para otras modificaciones por la unión de varias moléculas bioactivas en distintas aplicaciones (Cao, M. et al., 2012, Zhao, G. et al., 2011).

Sin embargo, una de las desventajas principales de las nanopartículas magnéticas radica en que no son estables por lo cual son fácilmente oxidables y las hace vulnerables a perder el magnetismo. Otras de las desventajas es que son propensas a agregarse, muestran pobre dispersión en agua y en disolventes orgánicos. Así las estrategias de protección, y conservación de estas nanopartículas magnéticas durante y después de la síntesis, es la estabilización química a partir de recubrimientos en capas con compuestos orgánicos o inorgánicos. Para el caso de recubrimientos inorgánicos se utilizan por lo general sistemas porosos para estabilizar las partículas magnéticas, como la sílice. Las nanopartículas magnéticas recubiertas de sílice proporcionan muchos grupos reactivos en la superficie, a través de grupos silanoles los cuales son empleados directamente en la posterior funcionalización de la superficie.

Una enzima modelo para la inmovilización de enzimas es la ureasa, altamente eficaz para la hidrólisis de la úrea. La principal aplicación de la ureasa se encuentra en el análisis del contenido de úrea en sangre, tratamiento en bebidas alcohólicas y desarrollo de sensores (Luo and Fu, 2010, Sahoo et al., 2011, Krishna et al., 2011), entre otras. Sin embargo, la búsqueda de un medio sencillo para separar la enzima del proceso, permitiría el reuso de la enzima. En este sentido, el uso de nanopartículas magnéticas sería muy eficaz para inmovilizar la enzima y facilitar su separación por uso de un campo magnético externo (Tartaj et al., 2005). En cada una de las aplicaciones anteriores, la inmovilización de la enzima se constituye en un importante reto científico.

Algunos resultados muestran que es posible inmovilizar ureasa en nano-partículas magnéticas, obteniendo un aumento en el tiempo de almacenamiento por períodos más largos y en su estabilidad térmica, así mismo la actividad de la enzima inmovilizada no es afectada por el cambio en rangos amplios de pH, sin perder su actividad catalítica inicial (Sahoo et al., 2011). En este trabajo se pretendió evaluar la inmovilización de ureasa en partículas de Fe₃O₄ modificadas con APTES o sílice con el fin de seleccionar dentro de estos soportes magnéticos cual permitiría una mayor inmovilización de la enzima sin alterar su comportamiento catalítico.

2. Experimental

2.1 Materiales

La enzima utilizada es la ureasa de Canavalia ensiformis (Jack bean, EC 3.5.1.5, 5 UI). Los cloruros de hierro FeCl₃.6H₂O, FeCl2.4H₂O, aminopropiltrietoxisilano al 99% (APTES), tetraetilortosilicato (TEOS), purpura de bromocresol, son de Sigma aldrich, NaH2PO4 y Na₂HPO₄ de Mobs Labs , NaOH de Panreac , HCl de Riedel-de Haen, NH₄OH de E.M, etanol de J.T Baker y agua desionizada.

Las nanoparticulas magnéticas fueron sintetizadas mediante una co-precipitación alcalina de sales de hierro (Soo Y., 1996). El procedimiento de preparación inició con la disolución de FeCl₃•6H₂O y FeCl₂•4H₂O (Acros 99%) en una mezcla de agua (burbujeada previamente con N₂) y ácido clorhídrico, bajo agitación mecánica hasta total disolución, luego se adicionó hidróxido de sodio con agitación continua, y se dejó decantar, se le acercó un imán externo y se comprobó su carácter paramagnético, al precipitado obtenido se le adicionó HCl para neutralizar los cargas aniónicas de las nanopartículas. Se lavó repetidas veces con agua desionizada y se secó al vacío a 333 K.

2.3 Síntesis de Fe₃O₄@SiO₂

El procedimiento de encapsulación de las microesferas magnéticas con SiO₂ se realizó a través del método de Stöber (Luo et al., 2010). En el que se tomó las nanopartículas de Fe₃O₄ sintetizadas previamente y se dispersaron en una mezcla de etanol, agua desionizada y solución de amoniaco acuoso concentrado (28% en peso). Esta mezcla se llevó a ultrasonido por 1h. Posteriormente tetraetil ortosilicato (TEOS) como fuente de sílice fue adicionada gota a gota a la mezcla, dejando en agitación por 3h, bajo atmosfera de nitrógeno. Los productos fueron recogidos, lavados con agua desionizada y secados a vacío a 333 K. La relación entre las partículas magnéticas y la fuente de sílice se mantuvo 1:1.

2.4 Funcionalización con APTES de Fe3O4 y Fe3O4@SiO2

Los sólidos Fe₃O₄ y Fe₃O₄@SiO₂ se funcionalizaron con APTES siguiendo el método propuesto por Diez, et al., (Díez et al., 2012) en donde las nanopartículas magnetitas se dispersaron por sonicación en una mezcla de etanol y agua, posteriormente se le adiciona 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES), y se agitó mecánicamente por 7h en atmosfera de nitrógeno, luego se decantaron magnéticamente, se lavaron con una mezcla de agua-etanol, y secaron con una a temperatura ambiente, para la obtención de Fe₃O₄-NH2 y Fe3O4@SiO₂-NH₂, respectivamente.

2.5 Inmovilización de ureasa

Para la inmovilización de la ureasa, la enzima se disolvió en una solución de buffer fosfatos manteniendo el pH en 5,8, a la cual se le adicionó una proporción de cada soporte magnético manejando una relación 1:2, se agitó por 24 h y se mantuvo el sistema a 4 °C, para lograr esta temperatura el agitador orbital se mantuvo en un refrigerador convencional. En este proceso se espera que la enzima se impregne en el soporte. Posteriormente, se centrifugó y se lavó varias veces el soporte con solución buffer fosfatos, para retirar la enzima residual.

2.6 Evaluación de la proteína acoplada

El primer sobrenadante obtenido, se utilizó para la determinación de proteína por el método de Bradford utilizando azul de Coomassie G250 a 595nm en un espectrofotómetro UV-VIS GBC-911.

Se evaluó la actividad enzimática por el método colorimétrico basado en la hidrólisis de la urea, monitoreando el cambio de pH con tinte púrpura de bromocresol (Zong, J. et al., 2011). La reacción enzimática se monitorizó siguiendo la absorción de colorante a 588 nm en un espectrofotómetro UV-VIS GBC-911.

2.8 Caracterización de los sólidos

La evaluación magnética de los sólidos se realizó a temperatura ambiente (19 °C) en un magnetómetro Versalab. La superficie específica, el diámetro de poro y el volumen de poro de los sólidos preparados fueron determinados desde las isotermas de adsorción - desorción de N2 a 77K obtenidas en un Micromeritics ASAP 2020. Análisis por Infrarrojo (FTIR) fueron realizados en un Nicolet 6300.

3. Resultados y discusión

3.1 Caracterización de los sólidos

Las isotermas de adsorción-desorción se muestran en la figura 1 y los resultados de superficie específica, tamaño y volumen de poro se pueden observar en la tabla 1. Las isotermas obtenidas de adsorción son de tipo IV, características de sólidos mesoporosos, sin embargo los distintos ciclo de histéresis sugieren que la incorporación del APTES y de la sílice a las partículas de Fe₃O₄ modifican las propiedades texturales. Las partículas magnéticas de Fe₃O₄ presentan una baja área superficial y la superficie aumenta a medida que se funcionaliza con APTES o se incorpora sílice. El incremento del valor de área superficial (SBET) en Fe₃O_4-NH₂ puede explicarse debido a que el APTES sirve de agente dispersante de las partículas de Fe₃O₄, lo que ocasiona un cambio de la distribución de poros como se observa en la figura 1b. El aumento de la superficie específica y la distribución de poros bimodal en SiO₂@Fe₃O₄ (figura 1c) se explica por un recubrimiento parcial de las partículas de Fe₃O₄ con sílice. Al incorporar el APTES a la superficie de SiO₂@Fe₃O₄ (Fe₃O₄@SiO₂-NH₂: figura 1d), es posible que se dispersen las partículas de Fe₃O₄ o se ocluyan algunos poros de la sílice. En consecuencia, el modo de actuar del APTES dependerá de la superficie donde se ancla.

En la figura 2 se observan las curvas de magnetización en función del campo magnético de los sólidos estudiados. La dependencia del campo magnético aplicado para estos sistemas confirma la respuesta ferromagnética de estos materiales. Se observa que todas las curvas pasan por el origen, lo que se traduce en que se pueden volver a dispersar fácilmente cuando el campo magnético aplicado es retirado. Por tanto explica la razón por la cual en los sólidos de Fe₃O₄@SiO₂ y Fe₃O₄@SiO₂-NH₂ donde existe un posible recubrimiento de sílice de las partículas magnéticas, esta respuesta magnética permanece, pudiendo ser fácilmente separadas con un imán. La respuesta magnética de la magnetita funcionalizada con APTES (Fe₃O₄-NH₂) no cae tan bruscamente como las magnetitas recubiertas con sílice, dado que la funcionalización afecta solamente la superficie de estas partículas.

La figura 3 muestra los espectros para los soportes obtenidos. La banda de absorción en 590 cm^-1 en la figura 3a ha sido asociada al enlace Fe-O de la magnetita (Waldron, 1955, Ma et al., 2003) Las señales observadas en 1625 cm1, se atribuyen a las vibraciones de los enlaces N-H (Ma et al., 2003) lo que permite afirmar que se obtuvo partículas magnéticas funcionalizadas con APTES (Fig. 3 (b) y 3 (c)). El encapsulamiento de la magnetita con SiO₂ (Fig. 3c) se presenta con la absorción de los grupos silanoles en la superficie de las partículas magnéticas y se observa en las bandas entre 1111 y 1049 cm^-1 que corresponden a los grupos SiO-H y Si-O-Si. Las bandas de absorción entre 750 y 900 cm^-1, corresponden a las bandas de estiramiento de los grupos Si-O-H y vibraciones de los grupos -OH de la superficie de la magnetita.

3.2. Evaluación de la proteína acoplada

Se determinó el nivel de proteína acoplado (PA), por medio de la diferencia entre la proteína del sobrenadante y de la enzima libre (238 µg/mL). En la tabla 2, se comparan la cantidad de proteína acoplada en los soportes evaluados, siendo los soportes modificados con APTES, los que mayor cantidad de proteína acoplaron, hecho que se atribuye a que la modificación con APTES asegura una mayor densidad de grupos amino que permite una mayor interacción con los grupos carboxílicos de la proteína. De igual manera, se calculo la proteína acoplada por cantidad de soporte utilizado (PAS), este dato corrobora que la cantidad de soporte no influye en la cantidad de proteína adherida y que esta depende solamente de la cantidad de grupos superficiales del soporte que permiten la adsorción de esta. Frente a los soportes que no se funcionalizaron con APTES, los valores bajos de cantidad proteína acoplada se debe a la lixiviación por las débiles fuerzas electroestáticas que unen a la enzima con el soporte, ocasionando que toda la proteína quedara en el sobrenadante.

3.3 Evaluación de la actividad enzimática

Para la actividad enzimática, se evaluó la producción de amoniaco en la hidrolisis de urea catalizada por la enzima por seguimiento colorimétrico a 588 nm. La tabla 2, resume los resultados de actividad enzimática expresada en unidades internacionales (UI) de la enzima inmovilizada y UI/mg de soporte. Estos valores se comparan con el valor de actividad obtenido de la ureasa libre. Puede observarse que no hay relación directa entre proteína acoplada y actividad enzimática, dado que pequeñas cantidades de enzima inmovilizada hidrolizan en un rango similar la urea. Los valores son comparables a la enzima libre (130 µM NH₄OH/min) y la funcionalización con APTES que permite una mayor adsorción de enzima, no necesariamente se refleja en una elevada actividad catalítica. Una explicación del porque no hay una relación directa entre proteína acoplada y actividad catalítica, se explica en términos de la conformación adoptada por la enzima al momento de inmovilizarse. En todos los casos, la inmovilización mejora notablemente la actividad enzimática y los soportes empleados resultan promisorios para la inmovilización de enzimas, lo que permitiría estudiar la cinética y evaluar su aplicabilidad en un proceso industrial.

4. Conclusiones

En todos los soportes magnéticos empleados, la inmovilización de la ureasa mejoró notablemente su actividad enzimática. Con una muy pequeña cantidad de ureasa inmovilizada es posible lograr una actividad similar a la de la enzima libre. El comportamiento magnético de los sólidos ofrece una clara posibilidad de fácil separación una vez sean empleados.

Se agradece el soporte financiero de la Dirección de investigaciones de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, bajo el proyecto SGI Nº 1125.

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