ARTÍCULO DE REVISIÓN
Características de Trichoderma harzianum, como agente limitante en el cultivo de hongos comestibles
The characteristics of Trichoderma harzianum as a limiting agent in edible mushrooms
Omar Romero-Arenas 1 , Manuel Huerta Lara 2 , Miguel Angel Damián Huato 2 , Francisco Domínguez Hernández 1 , Daniel Alfonso Arellano Victoria3
1Profesor-Investigador, Escuela de Ingeniería Agroforestal campus Tetela BUAP. biol.ora@hotmail.com 2Profesor-Investigador, Departamento de Agroecología y Ambiente (DAGAM-BUAP)Recibido: Diciembre 15 de 2008 Aprobado: Octubre 9 de 2009
Resumen
El incremento dramático de incidencia y severidad de los “mohos verdes” en la producción de hongos comestibles se refleja en la aparición de formas altamente agresivas de éstos patógenos, como es el caso de los biotipos de Trichoderma harzianum (Th1, Th2., Th3 y Th4), que han sido encontrados en Europa y Norte América, donde la importancia de la patogenicidad de dicho “moho” se comprobó en 1995 con las pérdidas del 30-100% en las plantas de hongos comestibles en Chester, Pennsylvania. En México se han identificado diversos “mohos contaminantes”, entre los cuales Trichoderma spp., se encuentra frecuentemente en la producción de hongos comestibles (Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus y Lentinula edodes), en el 2004, un grupo de investigación detectó la presencia de cepas altamente agresivas de T. aggressivum f. aggressivum, identificadas con técnicas clásicas y moleculares, en muestras de substrato (compost) contaminado, proporcionado por la principal planta de hongos de México. Actualmente se desconoce la situación sobre la distribución de Trichoderma harzianum y los problemas de contaminación en la producción de hongos comestibles, tanto de zonas rurales, como de zonas industrializadas en México, puede causar serias disminuciones en la producción de hongos comestibles y presentar pérdidas económicas para los productores de la región.
Palabras Claves: T. harzianum, T. aggressivum, patogenicidad, producción de hongos comestibles.
]]> AbstractThe dramatic increase of green mould incidence and severity in edible mushroom production has been reflected in the emergence of highly aggressive forms of these pathogens, such as Trichoderma harzianum biotypes (Th1, Th2, Th3 and Th4). These have been found in Europe and North America where the importance of the mould’s pathogenicity was discovered in 1995 leading to 30%-100% losses from Th4 in edible mushrooms from farms in Chester, Pennsylvania. Several contaminating moulds have been identified in Mexico, Trichoderma spp. frequently occurring in edible mushroom production (Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus and Lentinula edodes). A research group detected the presence of highly aggressive strains of T. aggressivum f. aggressivum in 2004, identified by classical and molecular techniques on contaminated substrate (compost) samples provided by the main edible mushroom-growing farm in Mexico. The current situation regarding Trichoderma harzianum distribution and contamination problems in edible mushroom production in both rural and industrial areas in Mexico remains unknown. This can lead to a serious decrease in edible mushroom production lead to financial loss for the region’s producers.
Key words: T. harzianum, T. aggressivum, pathogenicity, edible mushroom production.
Aspectos generales de Trichoderma spp.
Dentro de los Ascomycetes, se incluyen organismos de gran importancia económica, algunos a manera de patógenos y otros como controladores biológicos (productores de antibióticos y micotoxinas). Dentro de este orden se incluye el género Hypocrea que generalmente se ha caracterizado como un agente de control biológico, que actúa sobre hongos patógenos de plantas e insectos (Hidalgo, 1989), además se ha visto que Trichoderma spp., ha demostrado tener gran agresividad contra diversos hongos cultivados, principalmente el champiñón, seguido del hongo seta (Domsch, et ál.; 1993; Rossman, 1996).
Las especies de Trichoderma spp, son hongos cosmopolitas y típicamente del suelo que pueden ser llevados a sustratos en el cultivo de hongos comestibles (Klein y Eveleigh, 1998). Se han descrito cerca de 40 taxones de Trichoderma spp., hasta la fecha. Sin embargo, basados en su morfología anamorfo del orden de los Hypocreales, el número real podría ser más de 200 taxones (Samuels, 1996). La mayoría de las especies de Trichoderma spp., se han descrito de Norteamérica y de Europa, aunque las nuevas investigaciones de otras áreas geográficas conducirán al reconocimiento de las nuevas especies y su interacción en el cultivo de hongos comestibles.
La temperatura óptima para su crecimiento linear en agar y producción de micelio está entre 20 y 28 °C, aunque crece bien entre 6 a 32 °C. El contenido mínimo de humedad para su crecimiento vegetativo es del 92% y para su esporulación es de 93 al 95%. Tiene cierta respuesta a la luz, especialmente azul y la violeta. La luz promueve la formación de esporas, el crecimiento de micelio y la coloración (Hidalgo, 1989; Domsch, et ál., 1993). La colonia de superficie blanca y reversa violeta, luego de 4 días de crecimiento en agar maltosa 4% a 25°C el diámetro de la colonia es de 7,1-8,3 cm. El micelio es escaso, de textura velutinosa. La escasa formación de micelio aéreo hace que la superficie sea levemente hirsuta, con el tiempo el centro de la colonia se torna algodonoso y se observa la esporulación en la zona periférica de la colonia en pústulas conidiógenas de color blanco, que luego se tornan verde grisáceo, el medio se torna a color vino tinto (Domsch, et ál., 1993).
Trichoderma spp., un moho que afecta el cultivo de hongos comestibles
El género Trichoderma spp., (Tabla 1 a) fue introducido a la literatura en 1794 por Persoon para clasificar cuatro especies que actualmente se consideran no relacionadas entre sí, éstas son: Trichoderma viride (Pers.: S.F. Gray), Xylohipha nigresce (Pers.), Sporotrichum aureum (Link), y Trichotecium roseum (Pers.). La primera delimitación genética de Trichoderma spp., la realizó Hartz en 1871, quien enfatizó la importancia y las características microscópicas en la delimitación del género, especialmente por la presencia de fiálides (Bisset, 1991; Chen et. ál., 1999). En 1916 Waksman describió seis cepas de Trichoderma spp., de acuerdo a la apariencia macroscópica, el tamaño, y la forma de las fiálides. Diez años después, Abbott en 1926 al estudiar siete aislamientos de Trichoderma spp., concluyó que son tres especies y fueron identificadas como T. lignorum (Harz), T. koningii (Qudem), y Trichoderma glaucum (Abbott). En 1969 Rifai realizó una revisión del género y describió 9 especies de Trichoderma spp., (Bisby, 1939; Rifal, 1969; Bisset, 1992).
A partir de la manifestación de Trichoderma harzianum (Rifai), como causante de las epidemias en plantas productoras de hongos comestibles en Norteamérica, Islas Británicas, India e Irlanda a principios de 1980, todas las investigaciones sobre este género se han dedicado a realizar pruebas de identificación basadas en las variaciones del polimorfismo del ADN ampliado al azar (Random Amplified Polimorfic DNA ó RAPD), utilizando técnicas de PCR (Polymerase Chain Reaction) (Bissett, 1992; Muthumeenakshi et ál., 1994; Chen et ál., 1999; Sharma et ál., 1999).
]]> Dentro del género T. harzianum (Rifai), se han diferenciado cuatro formas biológicas: Th1, Th2, Th3y Th4 (Seaby, 1996; Chen, et ál., 1999; Hermosa et ál., 2000; Castle et ál., 1998; Doyle, 1991). Esto es debido a que dentro de una especie, los principales criterios son el tamaño de la fiálide, forma y distribución pero éstos varían mucho en los agregados y entre las especies. Además, se complica porque en T. harzianum (Rifai), produce dos tipos de esporulación y las proporciones cambian de acuerdo al tiempo de incubación y las condiciones del cultivo (Rifai, 1969).Fisiología de Trichoderma harzianum (Rifai).
A T. harzianum (Rifai), se le puede encontrar en diferentes materiales orgánicos y suelos, están adaptados a diferentes condiciones ambientales lo que facilita su amplia distribución. Algunas especies prefieren localidades secas y templadas y otras templadas y frías. Estos hongos son ampliamente conocidos por su producción de toxinas y antibióticos. Se encuentran diferentes especies y cepas de T. harzianum (Rifai), en el cultivo de hongos comestibles, algunas son inofensivas y otras muy dañinas, por lo que su relación antagónica con los hongos cultivados todavía no está completamente conocida y varía entre especies y cepas (Seaby, 1996).
En el estadio temprano de T. harzianum (Rifai), el color del micelio es blanco y eventualmente desarrolla un color verde oscuro después de la esporulación. Las colonias de T. harzianum (Rifai), crecen y maduran rápidamente a los cinco días de incubación en medio de cultivo agar de dextrosa y papa (PDA) a 25°C. Las especies de este género generalmente prefieren un pH ácido de 4.5-5 y, además se desarrolla en áreas con un excesivo contenido de humedad y un estancamiento del bióxido de carbono en la atmósfera. Varios factores genéticos asexuales como la recombinación parasexual, mutación y otros procesos contribuyen a la variación entre los núcleos en un solo organismo (talo). Así, los hongos son altamente adaptables y evolucionan rápidamente. Hay una gran diversidad en genotipos y fenotipos de cepas silvestres (Rifai, 1969; Przybylowicz y Donoghue, 1988; Stamets y Chilton, 1983; Vijay y Sohi, 1989; Pandey y Tewari, 1990). El ciclo de vida de T. harzianum (Rifai), inicia cuando el organismo crece y se ramifica como una hifa fúngica típica que mide de 5-10 µ de diámetro. La esporulación asexual ocurre cuando las esporas de 3-5 µ de diámetro son liberadas en un gran número. También se forman clamidospora intercaladas, de forma individual, aunque a veces dos o más clamidosporas se pueden fusionar. Como ya mencionamos anteriormente, dentro del género T. harzianum (Rifai), se diferenciaron cuatro biotipos (Th1, Th2, Th3 y Th4), que afectan al cultivo de hongos comestibles. Estos biotipos fueron diferenciados por el porcentaje del crecimiento micelial y la apariencia de la colonia, también por las características morfológicas a nivel microscópico, incluyendo las fiálides y fialósporas. Th2 Y Th4 son los biotipos más incidentes y altamente virulentos en las plantas de hongos comestibles, y los biotipos Th1 y Th3 pueden infestar la composta del hongo pero raras veces causan pérdidas (Seaby, 1987; Seaby, 1996; Doyle, 1991; y Rifai, 1969).
El tamaño de los conidióforos es de 62,5- 69 x 3-4,7 µm. Los conidióforos son de color verde, presentan diversas ramificaciones perpendiculares, en algunos casos se observa la formación de ramas laterales en grupos de dos a tres, ubicadas en un ángulo amplio. El sistema de ramificación tiene una apariencia piramidal (Fig. 1- a, b). Las fiálides son largas y delgadas, solitarias a lo largo del eje, asimétricas, con un tamaño de 6,3-15,6 x 2,7-3,4 µm., con verticilos terminales de hasta 4 conidios de un tamaño aproximado de 3,8-4 x 3,1-3,7 µm, con forma citriforme y subglobosos (Fig. 1- c, d). Sus Clamidosporas son intercalares y formadas por el micelio sumergido, subglobosas, de pared dentada, color verde suave y un tamaño de 12,5-10 µm. (Bissett, 1991; Hoog, 2000).
Estructuras y Características de T. harzianum (Rifai), en el cultivo de hongos comestibles
Algunas especies de Trichoderma spp., actúan como patógenas y otras como competidores del cultivo de hongos comestibles, de acuerdo a Fletcher en 1986, las especies encontradas en el cultivo de champiñón son: T. viride (Pers.: S.F. Gray), competidor, T. koningií (Qudem), patógeno, y T. harzianum (Rifai), patógeno. Entre las especies citadas en sustrato de Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) Kumm, se encuentran: T. viride (Pers.: S.F. Gray), T. harzianum (Rifai), T. hamatum (Bonord: Bainier) y T. pseudokoningii (Rifai). Recientemente, se ha encontrado la subespecie Th4 de T. harzianum (Rifai), las cuales han originado pérdidas superiores al 77% durante la producción de las cosechas de Pleurotus spp. Esta subespecie es la causante de la epidemia de Trichoderma spp., aparecida en los cultivos de champiñón de Norteamérica (Seaby, 1987; Seaby, 1996; Doyle, 1991 y Rifai, 1969).
T. harzianum (Rifai), invade rápidamente el sustrato y obstaculiza el crecimiento del micelio de Pleurotus spp., mediante la producción de toxinas y antibióticos, al tiempo que ocasiona un descenso del nivel de pH hasta valores de 4-5, que son más favorables para su desarrollo. Inicialmente se puede observar en el sustrato un moho de color blanco que vira a verde, adquiriendo posteriormente color gris verde-azulado debido a la abundante producción de conidios. Los propágulos (conidios, clamidosporas o fragmentos de micelio) pueden ser esparcidos por corrientes de aire, aerosoles, insectos, ácaros, herramientas, ropas, etc. (Seaby, 1996).
La infección del sustrato tiene lugar generalmente en el curso de las operaciones de siembra y embolsado, sobre todo cuando no se siguen escrupulosas normas de higiene. Los daños son proporcionales al número de sacos afectados y a la precocidad de la infección. Si la infección es temprana, el patógeno se multiplica rápidamente y coloniza una mayor cantidad de sustrato, lo que supone una severa reducción de la cosecha (Fletcher, 1986).
Por el contrario, con infecciones más tardías y ante un micelio de Pleurotus spp., vigoroso, el hongo verde se manifiesta en la incubación y durante la primera cosecha, aunque puede aparecer también en el inoculo o “semilla”. Hay que tener en cuenta que los procesos de infección se pueden ver afectados por la temperatura interna del sustrato, ya que se ha observado una correlación directa entre el desarrollo temprano de T. harzianum (Rifai) y una temperatura excesiva durante la incubación que debilita al micelio de Pleurotus spp., (Doyle, 1991). Además, T. harzianum (Rifai), produce enzimas hidrolíticas que degradan componentes de la pared celular de muchos microorganismos, que luego pueden ser utilizados como fuente de nutrientes. Recientemente, los biotipos de T. harzianum (Rifai), descritos por Rifai originalmente fueron aislados en plantas comerciales de champiñón (Agaricus bisporu J.E. Langes). El biotipo agresivo en Norte América fue originalmente conocido como “Th4”, pero ha sido recientemente cambiado de nombre de Trichoderma aggressivum f. aggressivum (Samuels & W. Gams). En cambio, biotipos de T. harzianum (Rifai) “no agresivos” se encuentran comúnmente en las granjas de setas. El mecanismo de establecimiento de la enfermedad es desconocida (Oliver, et ál., 2003).
]]> En 2004, un grupo de investigación del Colegio de Potsgraduados detectó la presencia de cepas agresivas micoparásitas de T. aggressivum f. aggressivum (Samuels & W. Gams), identificada con técnicas clásicas y moleculares, usando la técnica ITS 1 y ITS 4 en muestras de substrato (compost) contaminado proporcionado por la principal planta de Hongos de México, S.A. Esta empresa, cuyos volúmenes de producción ascienden a 55 toneladas de champiñones por día, ha llegado a tener disminuciones hasta del 50% en su producción y pérdidas económicas millonarias debido al ataque de T. aggressivum f. aggressivum (Samuels & W. Gams). Actualmente, dicha cepa está depositada en el Cepario de Hongos Comestibles del Centro de Recursos Genéticos del Colegio de Postgraduados, Campus Puebla (Bonilla- Quintero, 2006; Sobal, 2007).Conclusión
T. harzianum (Rifai), es un hongo que se ha venido estudiando desde principios del siglo pasado y se ha avanzado en el conocimiento de su morfología, diversidad patogénica y comportamiento en asociación al cultivo de hongos comestibles, a la fecha todavía hay dificultad de su manejo y clasificación, aun se desconoce mucho de su fisiología y de los factores asociados a la virulencia en plantas productoras en México, así como los mecanismos asociados a la resistencia por parte de los hongos comestibles.
Es relevante continuar con estudios que permitan un mayor conocimiento de este patógeno dada la importancia económica que representa el cultivo de hongos comestibles en países en vía de desarrollo, el cual se presenta como una alternativa económica para las zonas rurales del país debido a que la producción de hongos comestibles permite obtener grandes producciones en relativamente poco espacio, tiene una amplia capacidad de aceptación a nivel urbano y rural por sus propiedades alimenticias y nutricionales, utiliza racionalmente los subproductos agrícolas que se generan en la región, el sustrato es reciclando para ser utilizado como abono orgánico; además, arraiga la fuerza de mano de obra en sus propias localidades.
En los últimos años la biotecnología de producción de hongos comestibles ha tenido una importancia relevante en la alimentación en el medio rural mexicano, el desarrollo reciente de técnicas en biología molecular se muestra como una herramienta sólida para la generación rápida de conocimiento no solamente del parasito, también de su hospedero así como la interacción entre ambos que permitiría un manejo, prevención y control del principal agente contaminante del cultivo de hongos comestibles.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Porfirio Morales Almora, su apoyo técnico en diferentes etapas del trabajo de investigación durante el curso “Los hongos y su contribución al desarrollo”. Este trabajo fue realizado gracias al apoyo financiero de las autoridades del Conacyt.
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