Los resultados obtenidos por separado de halos de inhibición en las concentraciones utilizadas (Tabla 1) de los fungicidas 1 y 2 no sobrepasan los 5 y 6 mm de espesor, respectivamente; además, el crecimiento de A. chroococcum AC1 es óptimo dentro del área de la placa. La concentración del fungicida 2 al 10% presentó el mayor halo de inhibición seguido por el fungicida 1 al 30% pero sin ejercer un efecto significativo (P<0,05) sobre la viabilidad de la bacteria.
El medio de cultivo presentó un cambio de color, el cual se puede atribuir a la difusión de los agroquímicos en el medio de cultivo sintético, y posiblemente no es un efecto ocasionado por cada uno de ellos.
Por otra parte, la evaluación individual de los insecticidas Imidacloprid (10%, 20% y 30%) y Cipermetrina (40%, 50% y 60%) no presentaron ningún efecto significativo (P<0,05) sobre la viabilidad de A. chroococcum AC1 en las diferentes concentraciones utilizadas, lo cual permitió un óptimo desarrollo del microorganismo; sin embargo, se procedió a ratificar estos resultados utilizando la metodología de compatibilidad.
Las evaluaciones individuales o en conjunto de los herbicidas S-metolachloro, Fluometuron y Glifosato no mostraron un efecto negativo sobre la viabilidad de A. chroococcum AC1. Este resultado es importante debido a que normalmente en campo se utilizan estos tres herbicidas simultáneamente como sellantes en estados de preemergencia de la semilla de algodón, presentando un crecimiento adecuado de la bacteria sin ningún índice de inhibición en las diferentes concentraciones aplicadas, lo cual permite el uso del biofertilizante sin restricciones.
La mezcla de los herbicidas, fungicidas e insecticidas en la concentración aplicada normalmente en campo dió como resultado un efecto inhibitorio significativo (P<0,05) sobre la viabilidad de A. chroococcum AC1, siendo ésta combinación muy posiblemente la que ocasionó un mayor efecto sobre el crecimiento de la bacteria en comparación con los plaguicidas utilizados individualmente (figura 2).
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De acuerdo con ello, se podría pensar que los plaguicidas utilizados pudieron tener dificultad para difundirse en el agar en la prueba de Gauze por varios factores de interacción, así como por porosidad, procesos de adsorción, naturaleza del compuesto químico, solubilidad, viscosidad, reactividad química, componentes del medio agrícola, entre otros García y Ordoñez (2003); por esta razón, al entrar en contacto con A. chroococcum AC1, no se reflejó claramente un descenso en la biomasa del microorganismo. Además, es posible que durante el periodo de incubación los plaguicidas presentaran evaporación por la exposición continua a una temperatura de 30 ± 2° C al cabo de 48 horas, y su efecto sobre el crecimiento no fuera determinado.
Según González (2007), los plaguicidas con presiones de vapor menores a 1,0 x 10-8 mm/Hg tienen bajo potencial para volatilizarse, mientras que con una presión de vapor mayor a 1,0 x 10-3 tienen alto potencial para volatilizarse; por esta razón, la mayoría de los plaguicidas utilizados en la prueba de concentración mínima inhibitoria (CMI) presentaron valores aproximados al rango de volatilización en un porcentaje cercano al 50%.
Compatibilidad de los plaguicidas en el medio agrícola. Los resultados obtenidos demostraron el efecto causado en los dos tiempos de contacto de los plaguicidas sobre la bacteria A. chroococcum AC1. Cuando se utilizó el fungicida 1 al 20% de concentración sobre A. chroococcum AC1, el resultado demostró una disminución de la concentración celular durante las doce horas de contacto, obteniendo a la hora cero una concentración celular de 6 x 109 UFC/mL y a las doce horas una concentración de 6 x 108 UFC/mL; el efecto de este plaguicida produjo un descenso celular en una unidad logarítmica (figura 3); sin embargo, se podría inferir que el efecto inhibitorio del plaguicida sobre A. chroococcum AC1 no es tan relevante debido a que el microorganismo durante este tiempo pudo tolerarlo sin afectar completamente su biomasa; este resultado es similar al obtenido utilizando la metodología de Gauze, lo que confirma la resistencia del microorganismo al aplicar este agroquímico.
Al utilizar el fungicida 2 al 10%, se observó que durante las primeras horas de contacto el microorganismo no sufre un descenso en su viabilidad de forma significativa; mientras que, a las doce horas de contacto, la bacteria disminuye su concentración celular en una unidad logarítmica lo cual es muy similar al resultado obtenido con el fungicida 1 permitiendo inferir que probablemente los ingredientes activos presentes en estos dos fungicidas son los responsables de generar un efecto negativo mínimo en la concentración celular de A. chroococcum AC1, en el caldo agrícola (figura 3). Al adicionar S-metolachlor (0,75%) en contacto con A. chroococcum AC1, a la hora cero se reporta una concentración celular de 9 x 107 UFC/mL, lo cual demuestra que en este tiempo el microorganismo sufre un descenso de dos unidades logarítmicas en la concentración en comparación con el recuento inicial; sin embargo, la biomasa de A. chroococcum AC1, es constante a lo largo de las doce horas, permitiendo inferir la adaptación o posible resistencia de este microorganismo al herbicida en contacto sin ocasionar un efecto drástico sobre la viabilidad de la bacteria (figura 3). Este resultado es similar al reportado por González-López et al. (1999), quienes afirman que al agregar S-metolachlor en una dosis entre 5-50 µg/mL A. chroococcum no sufre un efecto negativo significativo en su concentración, sin causar alteraciones en la producción de aminoácidos por este microorganismo. Estudios realizados por González-López et al. (1999) registraron la influencia de herbicidas tales como: alachlor, 2,4-D, 2,4,5-T y 2,3,6- TBA alrededor del 95% sobre la inhibición de A. chroococcum, afectando la producción de aminoácidos y su actividad biológica. Por otra parte, los agroquímicos Imidacloprid, Fluometurom y Glifosato no influyeron en la viabilidad de A. chroococcum AC1, en los dos tiempos de contacto evaluados, manteniendo una óptima concentración del microorganismo bajo la dosis aplicada en campo (figura 3). El Glifosato, tanto en el ensayo de Gauze como en la evaluación de la compatibilidad con el medio agrícola al emplear diferentes dosis (0,5%, 1% y 1,5%), presentó un crecimiento masivo sin afectar la biomasa de la bacteria. Estos resultados son similares a los reportados por Giesy et al. (2000), que registran un bajo efecto del Glifosato sobre la población de los microorganismos del suelo. Por otra parte, la molécula del plaguicida no permanece intacta por tiempo indefinido en el medioambiente, debido a que con el tiempo sufre una degradación influenciada por microorganismos, actividad química, pH, temperatura y contenido de materia orgánica del suelo, entre otros (Giesy et al., 2000). De acuerdo con lo anterior, se podría pensar que existe la posibilidad de que el herbicida fue degradado por A. chroococcum AC1, sin causar ningún efecto inhibitorio sobre su crecimiento, lo cual confirmaría los resultados obtenidos por Santos y Flores (1995), sobre el posible efecto del Glifosato en el crecimiento, la respiración y la fijación de nitrógeno de A. chroococcum y A. vinelandii siendo demostrado el efecto tóxico en A. vinelandii; mientras que no hubo efecto en la tasa de crecimiento de A. chroococcum al utilizar altas dosis de este herbicida (20 kg ha-1 y 28 kg ha-1 de Glifosato) se produjo un efecto significativo sobre A. vinelandii y A. chroococcum, afectando la respiración en 60% y la fijación biológica de nitrógeno en el orden del 80% y 98%, respectivamente; por esta razón, la dosis manejada en el presente estudio (1 kg ha-1), permitió garantizar que el Glifosato no produjera ningún efecto sobre la viabilidad de la bacteria, la cual corresponde a la dosis aplicada en los cultivos de algodón.
La Cipermetrina demostró un efecto inhibitorio sobre la concentración celular de A. chroococcum AC1, a la hora cero 70 x 105 UFC/mL utilizando dosis al 40%, 50% y 60%. No obstante, a las doce horas de haber agregado este insecticida, la concentración celular del microorganismo presentó un ascenso en una unidad logarítmica, debido posiblemente a la degradación de este compuesto por A. chroococcum AC1. La Cipermetrina presentó influencia negativa sobre la biomasa de este microorganismo en el momento de ser agregada (figura 3).
La mezcla 1 de los agroquímicos (fungi cidas+insecticidas+herbicidas) en las dosis aplicadas en campo presenta, a la hora cero de contacto, un efecto inhibitorio significativo de los agroquímicos en su conjunto sobre A. chroococcum AC1, lo que permite inferir que posiblemente existe sinergia de todos o algunos de los componentes agregados en la mezcla con Cipermetrina generando un efecto que al cabo del tiempo impide el desarrollo normal del microorganismo (figura 3).
Debido a que la Cipermetrina presentó un efecto negativo individualmente sobre A. chroococcum AC1, a la hora de contacto, disminuyendo en cuatro unidades logarítmicas la viabilidad del microorganismo, se procedió a evaluar una nueva mezcla sin la adición de Cipermetrina (mezcla 2), la cual presentó a las doce horas de contacto un efecto mínimo sobre la viabilidad del microorganismo; este resultado permitió establecer que no hubo un efecto significativo (P<0,05) sobre A. chroococcum AC1, cuando no se agregó la Cipermetrina (figura 3).
Los resultados revelan que A. chroococcum AC1 es susceptible al contacto con el insecticida Cipermetrina en la dosis normalmente aplicada en campo, tanto de forma individual o en mezcla de los agroquímicos, induciendo de esta manera a los demás plaguicidas a una expresión más fuerte a través del tiempo (figura 3). Contrario a este resultado, al utilizar la metodología de Gauze (concentración mínima inhibitoria) no se presentó inhibición de A. chroococcum AC1 por parte de la Cipermetrina, lo cual posiblemente se puede atribuir al proceso de precipitación en el medio sólido evitando que se pudiese observar la respuesta de dicho plaguicida frente al microorganismo, en comparación con el medio líquido donde fue visible el efecto.
Conclusiones
El efecto de compatibilidad de la bacteria con los herbicidas (S-metolachloro y Fluometuron) demostró que A. chroococcum AC1, puede ser usado con los plaguicidas conjuntamente, sin alterar su concentración.
La utilización de la Cipermetrina sola, o en mezcla con los otros agroquímicos, causa un descenso drástico sobre la población de A. chroococcum AC1.
Carboxim, Thiram, Imidacloprid individuales o en mezcla, sin Cipermetrina, no afectan significativamente el crecimiento de A. chroococcum AC1.
Este estudio preliminar contribuye a la comprensión de los efectos de agroquímicos sobre Azotobacter chroococcum AC1 in vitro, por lo que se sugiere adelantar investigaciones más profundas en la búsqueda de microorganismos con potencial de degradación de sustancias químicas en el suelo y su uso compatible en cultivos de interés agrícola.
]]> Agradecimientos