Plegamiento y aminoácidos catalíticos
La lipasas presentan un dominio estructural canónico compuesto por ocho cadenas Β que forman una hoja Β. Estas cadenas están conectadas por hélices α, que quedan empaquetadas a ambos lados de la hoja Β. Este núcleo central es el responsable directo de la actividad catalítica y define el plegamiento a/Β-hidrolasa, común para muchas hidrolasas de orígenes filogenéticos y funciones catalíticas diferentes (Ollis et al., 1992).
La actividad funcional de las lipasas se sustenta en la tríada de aminoácidos clásica: nucleófilo-ácido-histidina (Alam et al., 2002; Mead et al., 2002), dilucidada inicialmente para las proteasas serínicas (Carter y Wells, 1988). Los elementos de la tríada se ubican en lazos muy bien conservados del dominio catalítico. El nucleófilo, generalmente una serina, se localiza en un giro que conecta una cadena Β con una hélice a (Petersen, 1996), en el contexto secuencial pequeño-x-nucleófilo-x-pequeñopequeño; donde x es cualquier aminoácido y “pequeño” se refiere a un aminoácido poco voluminoso (Ransac et al., 1996). Solo la histidina está completamente conservada en la tríada de las lipasas (Derewenda et al., 1994a), cuyo arreglo topológico y secuencial es la imagen especular de la tríada de las proteasas serínicas (Ollis et al., 1992) (figura 1).
De manera general, las lipasas son enzimas que requieren de activación interfacial para desplegar al máximo su actividad catalítica (Malcata, 1996; Ransac et al., 1996). Este fenómeno consiste en el incremento de la actividad enzimática en presencia de interfaces lípidoagua (Sarda y Desnuelle, 1958; Chahinian et al., 2002). Se entiende por interface a la superficie imaginaria que separa dos porciones del espacio homogéneas y distintas físicamente. A nivel molecular, una interface consiste en un conjunto de dos capas adyacentes de moléculas ordenadas con diferente carácter hidrofóbicohidrofílico (Malcata, 1996).
Cuando la enzima entra en contacto con una interface, el ambiente dieléctrico en la superficie proteica se modifica, en el sentido de potenciar las interacciones electrostáticas. Ello posibilita que la cubierta del centro activo se desplace (Grochulski et al., 1994a; Petersen, 1996; Foresti y Ferreira, 2004), y se produce una reestructuración en la conformación de la molécula (Jensen et al., 2002; Aloulou et al., 2006; Lin et al., 2007). Como resultado, los aminoácidos catalíticos quedan expuestos al solvente en una orientación adecuada, y alrededor de éstos se conforma la cavidad oxianiónica, por exposición de determinados residuos hidrofóbicos e internalización de otros hidrofílicos (Ransac et al., 1996). Además, se estructura la zona de contacto lipídico en la vecindad del centro activo y de la cubierta móvil (Grochulski et al., 1994a; Jensen et al., 2002). Todo esto incrementa la afinidad de la enzima por sus sustratos lipídicos y contribuye a la estabilización del estado de transición durante el ciclo catalítico (Malcata, 1996; Ransac et al., 1996; Mead et al., 2002).
Las características físico-químicas del sustrato también contribuyen de manera significativa a la activación interfacial (Egmond, 1996). En el estado agregado, los triacilglicéridos exhiben un grado de ordenamiento elevado, que minimiza el número de estados conformacionales que pueden presentar estas moléculas en solución acuosa, debido a la gran flexibilidad de sus cadenas de ácidos grasos. Este efecto tiene implicaciones favorables para el reconocimiento enzima-sustrato (Petersen, 1996) (figura 2).
El efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad lipasa ha sido ensayado con diferentes sustratos para enzimas de diversas fuentes. En la tabla 2 se presentan algunos resultados que se han informado para lipasas en sus formas solubles.
El efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática también se ha evaluado para lipasas inmovilizadas. En esos casos, se obtienen valores aparentes de los parámetros cinéticos, ya que estos se encuentran sesgados por las condiciones de la inmovilización (Tutar et al., 2009). Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática Las condiciones óptimas de pH dependen, entre otros factores, del sustrato (Berner y Hammond, 1970) y del tampón empleados (Chávez et al., 1990). El pH óptimo para las lipasas se encuentra generalmente en el intervalo entre 7,0 y 9,0 (tabla 3), cuando la actividad enzimática se ensaya frente a sus sustratos específicos, como el aceite de oliva, la tributirina, otros triacilglicéridos pequeños y la trioleína (Rúa et al., 1993; Prazeres et al., 1996). No obstante, para algunas lipasas, el pH óptimo se encuentra en la región acídica. Asimismo, se han encontrado lipasas con la mayor actividad a valores de pH más alcalinos (tabla 3). También puede suceder que se obtenga más de un valor de pH óptimo, manteniendo invariables las demás condiciones del ensayo (Kiyotani et al., 1983). Esto suele ocurrir para lipasas obtenidas a partir de extractos crudos o para mezclas heterogéneas con actividad lipolítica (Berner y Hammond, 1970). La inmovilización puede variar el valor de pH óptimo de las lipasas con respecto a sus formas solubles (Wei y Wu, 2008), en dependencia del grado de exposición resultante de sus centros activos (Balcão et al., 1996). La temperatura óptima para una enzima depende, entre otros factores, del sustrato con el que se trabaje, ya que los ligandos ejercen un efecto protector frente a la desnaturalización térmica (Chávez et al., 1990). La temperatura óptima para las lipasas puede encontrarse en el intervalo entre 35 y 50 °C, aunque existen lipasas termoestables que exhiben valores de temperatura óptima superiores a 50 °C (tabla 1). El medio en el que se encuentre la enzima también influye en el valor de temperatura óptima. De este modo, las lipasas presentes en preparados crudos, con altas concentraciones de otras proteínas contaminantes distintas de las proteasas, serán más estables y exhibirán valores aparentes de temperatura óptima superiores (Chávez et al., 1990). La inmovilización puede producir incrementos en los valores de temperatura óptima de las lipasas solubles (Palomo et al., 2004; Wei y Wu, 2008), debido a su efecto sobre la estabilidad enzimática (Balcão et al., 1996). Las lipasas son inhibidas por los organofosfatos (Kordel y Schmid, 1991; Cavalier et al., 2000), como el dietil-/-nitrofenilfosfato y el diisopropil-fluorofosfato (Bhardwaj et al., 2001), por las carbodiimidas en presencia de nucleófilos, como el glicin-etil éster, y por el iodo. También son inhibidores de lipasas los ácidos borónicos y el fenil-metil-sulfonilfluoruro (Dandavate et al., 2009), así como los metales pesados, el EDTA (Snellman et al., 2002; Dandavate et al., 2009), algunos terpenos (Morikawa et al., 2009), los iones halógenos, los alcaloides, el cloroformo, el n-hexanol, el dietil-fenil carbonato, el bromoformo, varias lactonas (Colowick y Kaplan, 1955; Kordel y Schmid, 1991) y algunos 1,2-etilen-di-N-alquilcarbamatos en presencia de detergentes (Lin et al., 2007). Algunos cationes metálicos pueden producir inhibición (Wu et al., 1996; Snellman et al., 2002; Park et al., 2008; Dandavate et al., 2009). Los inhibidores de naturaleza proteica son más específicos por su lipasa blanco, como es el caso del aislado a partir de la harina de trigo, que inhibió a la lipasa pancreática, pero no fue capaz de inhibir completamente la actividad lipasa de Candida cylindracea y no ejerció ningún efecto sobre otras lipasas aisladas de micobacterias (Tani et al., 1994). Algunas proteínas hidrofóbicas, como la albúmina de suero bovino, inhiben a las lipasas mediante su unión competitiva a las interfaces (Larsson y Erlanson-Albertsson, 1983). Para varias lipasas se han informado los fenómenos de inhibición por exceso de sustrato, frente a trioleína (Biesiot y Capuzzo, 1990; Prazeres et al., 1996), e inhibición por producto, causado por los ácidos grasos (Larsson y Erlanson-Albertsson, 1983). Los detergentes (Tsai et al., 1996; Brockman, 2000) y las emulsiones de varios solventes orgánicos (Sugiura e Isobe, 1975) pueden actuar como inhibidores de las lipasas. Algunos autores han informado inhibición competitiva causada por concentraciones elevadas de detergentes (Kimura et al., 1982). La actividad lipasa puede ser afectada de diferentes maneras por la presencia de iones metálicos en la preparación, los que pueden estabilizar o desestabilizar la estructura de estas enzimas en solución (Tyndall et al., 2002). Muchas lipasas requieren del ion Ca2+ para mantener una conformación estable y/o catalíticamente competente (Amada et al., 2001; Snellman et al., 2002). Además del efecto inhibitorio ya mencionado, los cationes metálicos también pueden actuar como activadores de las lipasas (Kimura et al., 1982; Snellman et al., 2002; Dandavate et al., 2009). El efecto activador del Ca2+ puede manifestarse como un incremento de la Vmáx y/o un decremento de la KM (Kimura et al., 1982). Algunos iones provocan efectos opuestos en lipasas diferentes (Wu et al., 1996; Snellman et al., 2002). También pueden influir sobre la actividad de estas enzimas el tampón (Alston y Freedman, 2001), el solvente (Sugiura e Isobe, 1975; Triantafyllou et al., 1993; Sharma et al., 2002; Dandavate et al., 2009) y la fuerza iónica del medio (Mead et al., 2002). El efecto inhibitorio del EDTA se basa en su capacidad de quelar el Ca2+. Los detergentes o surfactantes son aditivos de primera importancia para la actividad lipolítica (Dandavate et al., 2009), puesto que intervienen en la formación de micelas a partir de la dispersión de los grandes agregados hidrofóbicos en que se organizan espontáneamente los sustratos naturales de estas enzimas en solución acuosa. Esto trae como consecuencia un incremento notable del área superficial disponible para la interacción enzima-sustrato, con el consiguiente efecto sobre la velocidad de la reacción (Egmond, 1996). Estas sustancias pueden además formar micelas invertidas en solventes orgánicos con un contenido de agua moderado, lo que puede traducirse en una mayor actividad y estabilización de las moléculas enzimáticas ubicadas en su interior (Shome et al., 2007). Los detergentes también pueden influir sobre las propiedades estereoselectivas de las lipasas (Tsai et al., 1996). Sin embargo, el efecto de los detergentes no es homogéneo para todas las enzimas, ni éstas son afectadas del mismo modo por todos los surfactantes (Aloulou et al., 2007). Además, la influencia de estos compuestos sobre la actividad lipasa es dependiente de la dosis (Sonesson et al., 2006). Las sales biliares son activadores fundamentales para las lipasas pancreáticas de mamíferos en presencia de colipasa (Kimura et al., 1982; Larsson y Erlanson-Albertsson, 1983), y resultan inhibitorias para otras lipasas (Barnescu et al., 1997). El SDS, conocido por su efecto desnaturalizante sobre las proteínas, activa a determinadas lipasas e inhibe a otras (Wu et al., 1996). Algunos detergentes no iónicos previenen la formación de agregados enzimáticos (Palomo et al., 2003) y estabilizan estructuralmente a la molécula (Guisán et al., 1996b). El Triton-X100 es un detergente no iónico conocido por su capacidad de estimular la actividad de las lipasas (Sharma et al., 2002). Métodos de determinación de la actividad enzimática La actividad esterasa más general puede determinarse empleando como sustratos los ésteres de cadena acílica del p-nitrofenol o del α/Β-naftol, siguiendo la liberación de la base alcohólica por métodos espectrofotométricos. Deben considerarse los distintos coeficientes de extinción del p-nitrofenol a diferentes valores de pH, la ausencia de absorbancia a pH ácido, y la ocurrencia de hidrólisis espontánea a pH básico (De Caro et al., 1986; Gupta et al., 2003). Se han desarrollado numerosos ensayos para cuantificar la actividad hidrolítica de las lipasas en distintas muestras biológicas. éstos permiten monitorear tanto el consumo de los sustratos como la liberación de los productos en el tiempo (Beisson et al., 2000). La desaparición de los sustratos puede seguirse por nefelometría o turbidimetría (von Tigerstrom y Stelmaschuk, 1989). Sin embargo, algunas variantes de estos métodos experimentan interferencias debidas a la complejidad de ciertas mezclas. El consumo de los sustratos también puede ser monitoreado por métodos espectrofotométricos (Goujard et al., 2009), tensiometría interfacial (Aloulou et al., 2007), microscopía de fuerza atómica (Prim et al., 2006) y espectroscopía infrarroja. Los últimos tres métodos requieren un equipamiento costoso. El análisis de la velocidad de liberación de los ácidos grasos puede efectuarse indirectamente mediante el seguimiento de los protones liberados durante la hidrólisis enzimática. El método de pH-stat, que se fundamenta en la valoración de la disminución del pH en el tiempo, es una de las técnicas más utilizadas bajo este principio (Bertolini et al., 1995). Los ácidos grasos liberados por la actividad de la lipasa se ionizan en solución acuosa mediante la pérdida de protones y la mezcla de reacción tiende a acidificarse. La velocidad de liberación de los ácidos grasos es proporcional a la velocidad de liberación de los protones y, por tanto, a la velocidad de acidificación del medio. Si se añade NaOH a la misma velocidad a la que se liberan los protones, el pH de la mezcla se mantiene constante en el tiempo. Este ensayo consiste en registrar la velocidad a la que es necesario añadir el NaOH titulante a la mezcla de reacción, a fin de mantener el pH en un valor fijo. Esta velocidad es proporcional a la velocidad de hidrólisis enzimática de los enlaces éster del sustrato y, por tanto, su medición permite determinar la actividad de la enzima. La técnica de pH-stat se ha empleado para cuantificar la actividad lipasa en plantas, suero, plasma y secreción duodenal. El ensayo presenta un límite de detección en el orden de 0,1 µmol/min y solo puede desarrollarse en un intervalo restringido de valores de pH, los que deben igualar o exceder el valor aparente de pKa de los ácidos grasos liberados, ya que éstos deben encontrarse parcialmente ionizados (Beisson et al., 2000).
La cuantificación de los ácidos grasos liberados durante el transcurso de la reacción se ha abordado utilizando métodos colorimétricos que apelan a reactivos cromogénicos cuyas absorbancias varían al interactuar con estas moléculas. Para garantizar una señal de fondo lo más baja posible, los triacilglicéridos empleados como sustratos no deben contener cantidades elevadas de ácidos grasos libres acompañantes. También se han desarrollado ensayos fluorimétricos (Knotz et al., 2006), basados en la interacción entre los ácidos grasos liberados y determinados fluoróforos. Estos métodos son muy sensibles y costosos. La cromatografía en placa fina permite cuantificar los ácidos grasos liberados mediante técnicas densitométricas o autorradiográficas. Este método es discontinuo y consume mucho tiempo. La separación entre el sustrato y los productos radiactivos también puede realizarse mediante HPLC, centrifugación o extracción con solventes. El ensayo radioisotópico es muy específico y sensible, y su límite de detección es del orden de los picomoles. Su inconveniente principal radica en el empleo de triacilglicéridos sintéticos marcados radiactivamente (Beisson et al., 2000).
Esta variedad de ensayos enzimáticos proporciona amplias posibilidades al investigador en este campo, pero al mismo tiempo dificulta la comparación entre los resultados obtenidos en distintos laboratorios mediante el empleo de métodos diferentes. Esto se debe a que las condiciones del ensayo influyen sobre la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente (Chávez et al., 1990).
Inmovilización
Las ventajas derivadas de la inmovilización de enzimas también son aplicables a las lipasas. Debido a la hidrofobicidad marcada que presentan los sustratos naturales de estas enzimas, las mezclas de reacción en las que ellas operan deben contener un solvente orgánico o un agente emulsificante apropiados, que traen consigo la ruptura de la homogeneidad del medio. Bajo estas condiciones, es deseable que la lipasa constituya una fase independiente dentro del sistema de reacción, a fin de prevenir la contaminación de los productos con cierto nivel de actividad enzimática residual. Esta aspiración tecnológica puede alcanzarse con la inmovilización, la que además extiende el tiempo de vida útil del reactor (Balcão et al., 1996; Kneževic et al., 2004). Se ha desarrollado una variedad amplia de protocolos de inmovilización para las lipasas (tabla 4).
Las enzimas son catalizadores biológicos extraordinariamente específicos y de gran poder catalítico. La aplicación industrial de la tecnología enzimática es particularmente interesante en procesos que requieren condiciones de reacción suaves, en términos de pH, temperatura y presión, debido a la labilidad de la mezcla. Estas moléculas se requieren en cantidades pequeñas, pueden distinguir entre grupos funcionales de reactividad similar y son capaces de modificar un sustrato dado dentro de una mezcla compleja, llegando a discriminar incluso entre dos isómeros ópticos en el caso de compuestos quirales. En la literatura especializada puede encontrarse abundante documentación sobre el empleo de enzimas en la obtención de principios activos (Klibanov, 1990).
Las lipasas son enzimas con una aplicación amplia en diferentes procesos industriales, particularmente en sus formas inmovilizadas. Ellas se emplean en la producción de detergentes y de saborizantes naturales (Pandey et al., 1999), en la hidrólisis de aceites y grasas (Taylor, 1996), en la producción de papel (Jaeger y Reetz, 1998) y en la elaboración de cosméticos (Benjamin y Pandey, 1998). Debido a su capacidad de catalizar la síntesis de determinados compuestos en medios orgánicos con actividad de agua controlada (Dandavate et al., 2009; Gupta y Khare, 2009), las lipasas se han empleado en la producción de intermediarios para la síntesis orgánica (Vaidya, 1996), así como de penicilinas (Savidge, 1984).
Las lipasas han sido utilizadas extensivamente en la obtención de compuestos ópticamente puros (Yoshimura et al., 2002) y en la resolución de mezclas racémicas (Kirchner et al., 1985; Felluga et al., 2009), aprovechando sus propiedades estereoespecíficas (Bornscheuer, 2002; Segura et al., 2004). Esta aplicación tiene un impacto considerable en la producción de fármacos más selectivos y efectivos, con efectos secundarios menores, y en la obtención de pesticidas con menor incidencia en el medio ambiente (Zarevúcka y Wimmer, 2008). Esto se debe a que la actividad funcional de los compuestos quirales es debida generalmente a uno de los enantiómeros, mientras que el otro es inocuo o perjudicial, y puede reducir la actividad del primero, provocar reacciones colaterales indeseadas, o simplemente aportar una contribución innecesaria a la dosis terapéutica con su presencia en la mezcla (Ariens, 1984).
Conclusiones
Las lipasas son enzimas extraordinariamente versátiles que han recibido considerable atención en biotecnología desde hace más de tres décadas. Esto se debe a las peculiares propiedades funcionales que exhiben estas moléculas, dado su carácter de enzimas interfaciales. La activación en interfaces, una especificidad de sustrato amplia y una selectividad basada en múltiples determinantes estructurales, una sensibilidad de la actividad enzimática muy rica frente a numerosos y variados efectores, la posibilidad de inmovilización con altas retenciones de la actividad funcional, la estabilidad operacional de los biocatalizadores inmovilizados, la estabilidad en solventes orgánicos, y la capacidad de desarrollar la catálisis en medios con baja actividad de agua, son algunos de los aspectos más atractivos de las lipasas que han determinado su papel protagónico en numerosos procedimientos de la tecnología enzimática. Profundizar en las bondades y limitaciones de estas enzimas como biocatalizadores, contribuye a la optimización de los procesos biotecnológicos en los que ellas participan y, por tanto, a una mejor aplicación de las lipasas para la obtención de bioproductos de utilidad humana.
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