ARTÍCULO CORTO
Caracterización molecular y agronómica de aislados de Trichoderma spp nativos del noreste de México
Molecular and agronomic characterization of Trichoderma spp natives of northeastern Mexico
José Luis Hernández Mendoza1 , María Isabel Sánchez Pérez1 , Jesús Gerardo García Olivares 1 , Netzahualcoyotl Mayek Pérez 2 Juan Manuel González Prieto 2 Jesús Di Carlo Quiroz Velásquez 1
1 Laboratorio de Biotecnología Experimental.
2 Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Centro de Biotecnología Genómica. Instituto Politécnico Nacional, Blvd del Maestro s/n Col Narciso Mendoza, Reynosa, Tam. 88710. México. ce: jhernandezm@ipn.mx
Resumen
Trichoderma sp es un hongo frecuentemente usado en actividades agrícolas, pues actúa como antagonista de diversas especies de hongos fitopatógenos. En este estudio se realizó el aislamiento de cuatro cepas de Trichoderma sp nativas del noreste de México, las cuales fueron identificadas a nivel molecular mediante la secuenciación del ITS 1. Además se evaluó su capacidad antagonista en contra los hongos fitopatógenos Macrophomina phaseolina y Fusarium oxysporum, que afectan severamente cultivos de sorgo, maíz y fríjol en el noreste de México. La identificación se realizó de acuerdo al grado de concordancia con secuencias reportadas y corresponden a las especies T. hammatum (HK701); T. koningiopsis (HK702); T. asperellum (HK703) y Trichoderma sp (HK704). Por otra parte, las pruebas de antagonismo muestran que los aislados HK701, HK703 y HK704 inhiben por competencia el crecimiento de M. phaseolina y F. oxysporum , mientras que HK702 tiene la capacidad para hiperparasitar dichos fitopatógenos. Finalmente, se evaluó la promoción de crecimiento de T. asperellum HK703, en maíz (Pionner 30P49®), usando para ello concentraciones de tratamiento de 1x10e2 hasta 1x10e6 esp/mL. En estos ensayos se midió la producción de biomasa. Los resultados muestran que en concentraciones intermedias se tiene el mayor incremento en altura de plantas y mayor producción de peso seco en follaje y raíz. Entre los parámetros antes mencionados existen diferencias significativas.
]]> Palabras clave: control biológico, antagonismo, biofertilizantes, Zea maiz , Sorghum bicolor .Abstract
Trichoderma sp is a fungus often used in agricultural activities, because it acts as an antagonist of several species of plant pathogenic fungi. In this study four strains of Trichoderma sp was isolated from the northeastern Mexico, which were identified by sequencing the ITS 1. We also evaluated its ability antagonistic against phytopathogenic fungi Macrophomina phaseolina and Fusarium oxysporum this fungi are reported affecting severely maize, sorghum and beans crops in northeastern Mexico. The identification was made according to the degree of consistency with reported sequences and the data show that the isolates belong to the species T. hammatum (HK701), T. koningiopsis (HK702), T. asperellum (HK703) and Trichoderma sp (HK704). Antagonism tests showed that the isolated, HK701, HK703 and HK704 inhibited the growth by competition to M phaseolina and F. oxysporum , while the HK702 has the ability to hyperparasites these pathogens. Finally was evaluated in maize (Pioneer 30P49®) We measured the dry weight and biomass production. The results show that at intermediate concentrations have the greatest increase in plant height and dry height of root and foliage.
Key words: biological control, antagonism, biofertilizers, Zea maiz , Sorghum bicolor .
Introducción
Las enfermedades producidas por hongos fitopatógenos causan pérdidas severas en la agricultura (Rey et al ., 2000); estas mermas consisten en la reducción de la calidad y/o la cantidad de la cosecha obtenida (Monte, 2001). La forma tradicional para el control de las enfermedades en cultivos es la aplicación de productos químicos, pero debido a su composición resultan tóxicos e inespecíficos, ya que además de eliminar los organismos fitopatógenos, dañan la flora del suelo (Vinale et al ., 2008). Por ello es necesaria la búsqueda de alternativas orientadas al manejo de agentes antagonistas que sean eficientes y compatibles con el ambiente (Cupull et al ., 2003).
Trichoderma spp. es un organismo de vida libre en suelos y ecosistemas de raíz, donde se pueden observar interacciones complejas entre la planta huésped, los patógenos y diversos factores del ambiente (Harman, 2006; Woo et al ., 2006). Este es un hongo fácil de aislar y cultivar en medios de cultivo naturales o semisintéticos (Rey et al ., 2000).
Diversas especies de Trichoderma spp. son utilizadas en la agricultura para el manejo de fitopatógenos, ya que limitan el desarrollo de hongos dañinos como Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum, Verticillium dahliae (González et al , 2005). Los mecanismos empleados por Trichoderma spp son la competencia, la antibiosis o el hiperparasitismo; en este último caso, se adhiere a las hifas de los fitopatógenos por medio de estructuras especializadas llamadas apresorios y libera enzimas (glucanasas, quitobiosas y quitinasas) y antibióticos (viridina, gliotoxina, gliovirina y peptaiboles) (Howell et al , 1993).
Trichoderma sp es un hongo que degrada la pared celular y destruye las hifas y estructuras reproductivas de Sclerotium cepivorum (Vera et al ., 2005). Este fenómeno es muy importante, pues muchos hongos forman estructuras de resistencia en el suelo que les permiten sobrevivir bajo condiciones adversas del ambiente hasta por más de 20 años (Higuera et al ., 2003).
Se tienen reportes que Trichoderma induce el crecimiento vegetal al degradar el epispermo de la semilla e interviene en los procesos respiratorios durante la germinación. Acelera además, el desarrollo de los tejidos meristemáticos primarios, los cuales aumentan el volumen, la altura, así como el peso de la planta (Moity, 1982; Miranda et al ., 1998; Gravel et al , 2007; Shoresh y Harman, 2008a; Shoresh y Harman, 2008b). Este hongo secreta fitohormonas como el ácido Indol Acético que estimulan la germinación, el crecimiento y desarrollo radicular, mejora la asimilación de nutrientes, lo que influye en el crecimiento vegetativo de cultivos como papa, tomate, maiz y cafetos (González et al , 1999; Cupull et al , 2003; Windham et al , 1986; Andreu et al , 1992; Harman et al , 2004; Harman, 2006; Gravel et al , 2007; Vinale et al , 2008; Sánchez- Pérez, 2009).
]]> Por otra parte, el hongo Macrophomina phaseolina es capaz de atacar a más de 500 especies de plantas cultivadas, entre ellas sorgo, maíz y fríjol, en las que produce la enfermedad conocida como pudrición carbonosa. Además el hongo forma esclerocios como estructuras de resistencia, los que sobreviven en el suelo y son difíciles de destruir (Cardona, 2006). En el caso de Fusarium oxysporum se reporta que ataca a más de 100 especies de plantas gimnospermas y angiospermas (Bosland, 1988; Garofalo and McMillan, 2003) y que puede formar tres estructuras de resistencia: macroconidios (estructuras distintivas del género), microconidios y clamidosporas, estas últimas son las que le permiten sobrevivir como saprófito de vida libre en ausencia de un hospedero (Nelson, 1981).Existen reportes del antagonismo de Trichoderma spp contra Macrophomina phaseolina, donde T. viride y T. lignorum parasitan las hifas de Macrophomina phaseolina produciendo colapso y degradación de la pared celular (Dhingra and Sinclair, 1978). T. koningii, por su parte, reduce la incidencia de la pudrición carbonosa en semilla de arveja ( Pisum sativum) (Lifshitz et al , 1986). Resultados similares se reportan al tratar plantas de ajonjolí ( Sesamum indicum) con esporas de Trichoderma sp, ya que se reduce el porcentaje de muerte de plantas causadas por Macrophomina phaseolina (Pineda y Gonnella, 1988). Así mismo se observa una resistencia a la presencia de Macrophomina phaseolina cuando las semillas de fríjol son tratadas con una suspensión de 6,8 x 107 ufc/mL-1 (Adekunle et al , 2001). T. harzianum reduce significativamente la germinación de esclerocios de Macrophomina phaseolina de 30 a 60% (Srivastava et al , 1996) y la incidencia de Fusarium oxysporum en semillas de melón ( Cucumis melo) y en plantas de papayo ( Carica papayag L.) (Booth, 1971; Harman and Nelson, 1994; González et al , 2005).
El objetivo del presente trabajo fue aislar e identificar aislados de Trichoderma spp nativos del noreste de México y hacer una caracterización agronómica de los mismos tomando en cuenta su antagonismo con- tra Macrophomina phaseolina y Fusarium oxysporum y la inducción de crecimiento vegetal en plántulas de maíz.
Materiales y métodos
Aislamiento de cepas
Se procesaron 3 muestras de suelo de la rizósfera de girasol silvestre (Helianthus annus L.) y uno más de rizósfera de pino (Pinus cembroides Zucc) de vivero. Los aislamientos se realizaron en medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) por el método de diluciones (Sánchez-Pérez, 2009), para ello se seleccionaron las colonias que presentaron las características morfológicas de Trichoderma spp, entre las que se destacan: la morfología, la forma, el color y el crecimiento de la colonia.
Caracterización molecular
Obtención de biomasa de aislados de Trichoderma spp
Los aislados de Trichoderma spp. se multiplicaron en matraz con 50 ml de caldo LB (Luria-Bertani, Difco®), incubados a 27 °C y 200 rpm. El cultivo de 72 h de crecimiento se centrifugó para obtener la biomasa.
Extracción de DNA genómico
]]> Se siguió el método modificado de Hoffman y Wriston (1987), citados por Sánchez-Pérez (2009), en el cual la biomasa obtenida es centrifugada y lavada con agua desionizada estéril, el sobrenadante fue desechado. La biomasa se resuspendió en 0,2 ml de solución de lisis (tritón X-100, 2%; SDS, 1%; NaCl, 0,1 M; Tris-HCl pH 8, 10 mM y EDTA 1 mM) y se le añadieron 0,2 ml de fenol-cloroformo (1:1) y 0,3 g de perlas de vidrio (ballotini) de 0,45 mm de diámetro.vEl tubo donde se trató la biomasa se agitó en vorte durante 1 min, después se colocó en hielo por 1 min y se repitieron estos dos pasos en tres ocasiones; pos teriormente se añadió 0,2 ml de TE 10:1 (Tris 10 mM y EDTA 1 mM) y se centrifugó durante 10 min a 12000 rpm a 4 °C. La fase acuosa se transfirió a un tubo nue vo al cual se le añadieron 10 µl de RNAsa. Posterior mente se incubó a 37 °C por 15 min. Enseguida s agregaron 10 µl de acetato de amonio (NH4 C2 H3O2 4 M) y 1 ml de etanol (C2 H5OH) al 100%; se dejó repo sar por 15 min a -20 °C, se centrifugó a 12000 rpm po 5 min a 4 °C. El sobrenadante se desechó y se lavó e sedimento con 100 µl de etanol al 70%, se centrifugó nuevamente para eliminar la fase acuosa y se secó e precipitado a 55 °C durante 5 min. El DNA obtenido s resuspendió en 40 µl de TE 10:1 y se mantuvo a -20 °C hasta su uso.
Una vez que se extrajo el DNA se visualizó en gel de agarosa al 1% y se adicionó 0,1 µl de syber gold. Para ello se depositó 1 µl de cada muestra en el gel y se corrió en una cámara de electroforesis horizontal (BIO- RAD, ®) a 100 v por 50 min, usando una fuente de poder EC105. Se observó el gel en el transiluminador de luz ultravioleta y se captó la imagen del gel con el programa Kodak digital Science® 1D.
Amplificación ITS
Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 50 µl. Se utilizó 1 µl del ADN genómico, 5 µl de Buffer 10X (concentración final a 1X), 1,5 µl de cloruro de magnesio de 50 mM (final 3 mM), 1 µl de dNTPs 10 mM (0,2 mM), 1 µl de cada uno de los iniciadores 5 µM (final 0,1 µM) y 0,4 µl de la enzima Taq DNA polimerasa y se adicionó agua milliQ estéril hasta alcanzar el volumen de 50 µl. El programa de amplificación que se utilizó consis tió en 1 ciclo de 3 min a 94 °C y 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1min a 53 °C y 1 min a 72 °C. Por último, se realizó una extensión final de 1 min a 72 °C y se procedió a visualizarla en un gel de agarosa al 1%, se adicionó 0,1 µl syber gold y 0,4 µl de orange. Se depositaron 5 µl de cada muestra en el gel y se corrió en una cámara de electroforesis horizontal (Bio- Rad®) a 80 volts por 1 h. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador Peltier MJ Research® y los geles se trataron como ya se mencionó con anterioridad.
Secuenciación
Los productos de PCR, en una concentración de 50 ng, fueron tratados en el secuenciador de columna marca Applied System, modelo 3130®. Para la identificación a nivel de especie, se empleó el primer de ITS 1 Forward (5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’), las secuencias obtenidas fueron comparadas con las secuencias de referencia de la base de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y en TricOkey de ISTH (http://www.isth.info/tools/molkey/index.php), y se asignó la especie de acuerdo a los niveles de concordancia.
Fitopatógenos
La cepa de Macrophomina phaseolina (cepa HMP5) fue aislada de plantas de fríjol (Phaseolus vulgaris) en Cotaxtla, estado de Veracruz, México.La cepa HFO6 de Fusarium oxysporum también se aisló de fríjol en la Isla, estado de Veracruz, en México. Ambos materiales fueron proporcionados por el Laboratorio de biotecnología vegetal del Centro de biotecnología genómica del Instituto Politécnico Nacional (IPN).
Antagonismo
]]> Los hongos fueron cultivados de manera individual en cajas de petri con PDA y se obtenieron mediciones de desarrollo de la colonia cada 24 h. Posteriormente se realizaron las pruebas de antagonismo en individual, confrontando directamente la Trichoderma spp. contra los fitopatógenos, siguiendo la metodología descrita por Acevedo (1995), la cual consiste en colocar en puntos opuestos en una caja de petri con PDA, un disco de 7 mm de diámetro de agar con micelio de siete días de desarrollo de Macrophomina phaseolina y Fusarium oxysporum (respectivamente), y en el otro extremo, un disco de agar con micelio de Trichoderma spp. de cuatro días de crecimiento. Cada ensayo se realizó por triplicado.Inducción de crecimiento
La evaluación de la inducción de crecimiento fue realizada en semillas (72 por tratamiento) de maíz (Pionner 30P49®), las cuales fueron inoculadas en una caja de petri (55 mm) con 6 ml de la suspensión de esporas de cada uno de los tratamientos (1x10 e2 a 1x10 e6 esporas por mL-1 ). Las semillas se incubaron por 72 h, luego se sembraron en charolas de 72 cavidades (capacidad 120 ml de sustrato c/u) con una mezcla de suelo agrícola y perlita en relación 3:1v/v. Se realizó la evaluación de biomasa producida (medida como peso seco de raíz, follaje y peso total) a los 15 y 30 días después de la siembra. Para el análisis estadístico se utilizó la comparación de medias, se obtuvo la diferencia mínima significativa con el programa de cómputo de Olivares (1994) y se graficó con el programa Microsoft Excel XP® y GraphPad Prism 4.0®.
Resultados
Identificación molecular
Las muestras permitieron el aislamiento de 4 cepas de Trichoderma spp, las cuales fueron codificadas como HK701, HK702, HK703 y HK704. Las 3 primeras fue-ron obtenidas de la rizósfera de Helianthus annus L. y la HK704 de la rizósfera de Pinus cembroides Zucc. Se realizó la asignación de la especie comparando las secuencias obtenidas para cada aislado y se alinearon empleando las bases de datos del NCBI y del TricOkey. Las especies identificadas corresponden a T. hamMatum; T. koningiopsis; T. asperellum y a Trichoderma sp respectivamente. En este caso, solo la HK704 tuvo un nivel de correspondencia con secuencias reportadas para otras especies, inferior al 60%, razón por la cual se reporta solo como Trichoderma sp.
Los aislados HK702 y HK703 fueron depositados en el ARS Culture Collection (NRRL, http://nrrl.ncaur.usda.gov) donde quedaron protegidos para procedimientos de patentes con los códigos NRRL 50190 y NRRL 50191 respectivamente.
Pruebas de antagonismo
Los resultados obtenidos de las pruebas de desarrollo in vitro de los aislamientos muestran que el HK702 de Trichoderma koningiopsis tiene un crecimiento vegetativo más rápido que los otros dos, T. hammatum (HK701) y T. asperellum (HK703), todos obtenidos de Helianthus annus L., y que Trichoderma sp (HK704), aislado de Pinus cembroides Zucc., los cuales tienen un crecimiento similar entre sí (gráfica 1a).
En cuanto al crecimiento de M. phaseolina, en comparación al testigo, se observa que a las primeras 24 h crece más cuando está frente a Trichoderma spp que cuando está solo (gráfica 2a). Los aislados HK701, HK703 y HK704, a las 48 h mostraron un desarrollo significativamente menor en comparación al testigo (gráfica 2b). A las 72 h HK702 disminuyó su tasa de crecimiento, mientras que HK704 la incrementó y fue similar al testigo.
En las pruebas de antagonismo de los 4 aislados d Trichoderma spp contra F. oxysporum , se observó qu el primero no afectó la velocidad de crecimiento de F. oxysporum , pero sí limitó su desarrollo una vez que entraron en contacto (gráfica 2b).
El contacto entre las colonias de Trichoderma spp y M. phaseolina se observó en el caso del aislado HK702 a partir de las 48 h y a las 72 h con los otros tres aislados. El sitio donde los dos hongos hacen contacto es caracterizado por una ligera variación en coloración, lo cual indica la incompatibilidad que existe entre ellos. Como se puede observar en la figura 2a, en la parte superior el aislamiento HK704 presenta una franja color crema o beige amarillenta, igual se presenta con los aislados HK701 y HK703. En la parte inferior de la figura 2a se observa que el medio de cultivo no presentó cambios de coloración cuando entran en contacto T. koningiopsis (HK702) y M. phaseolina, por lo que se estima que no hay antibiosis. Sin embargo, algo muy interesante fue observado, T. koningiopsis sigue creciendo sobre las colonias de ambos fitopatógenos F. oxysporum y M. phaseolina (figura 2b). Este fenómeno es importante, ya que muestra un hiperparasitismo que debe ser considerado entre los parámetros relevantes para evaluar su uso potencial en agricultura para el control biológico de fitopatógenos.
A nivel individual, en la interacción entre los aislados de T. koningiopsis y M. phaseolina se observó a nivel microscópico que el primero enrolla a la hifa de M. phaseolina. En el caso de F. oxysporum se puede observar como las hifas de T. koningiopsis crecen y se desarrollan adheridas a las hifas del fitopatógeno (figura 3).
Estimulación de crecimiento
]]> El ANOVA mostró diferencias significativas para tratamientos en los tres parámetros analizados (peso folla-je, peso raíz y peso total), no ocurrió lo mismo para la fuente de variación de bloques en ningún parámetro de peso de plántulas de maíz (Pionner 30P49®) tratadas con T. asperellum (HK703) (Tabla 1 ).
En cuanto a la comparación de medias (DMS), el tratamiento de la concentración 1x10 exp 4 esp/mL-1 mostró un efecto promedio más alto en el caso del peso seco de follaje, con diferencias significativas con las otras cinco concentraciones analizadas y con el tratamiento testigo. En cuanto al peso de raíz, el tratamiento de la concentración de 1x10 exp4 esp/mL-1 fue donde se obtuvieron los valores más altos, seguido por la concentración de 1x10 exp3 esp/mL-1 . Finalmente, los tratamientos de 1x10 exp2 y 1x10 exp5 esp/mL-1 mostraron un comportamiento igual que el testigo. Con respecto al peso seco total, sigue siendo la concentración de esporas 1x10 exp4 esp/mL-1 donde se observan las mayores diferencias entre tratamientos (gráfica 3).
Discusión
Los aislados presentaron la forma típica de las colonias de Trichoderma sp. con formación de anillos concéntricos de color verde en los sitios de esporulación (Druzhinina et al , 2006). El color verde varía de tono en cada uno de los aislados, en el caso de HK702, que corresponde a T. koningiopsis, es un verde claro. En la morfología a nivel microscópico se observaron hifas hialinas segmentadas, conidióforos y conidios redondos, semejantes a los reportados para otras especies de este genero (Druzhinina et al , 2006). En los resultados obtenidos de las tasas de crecimiento se observa que el aislado de Trichoderma sp. HK702 es el de crecimiento mayor. Con respecto a los otros tres aislados y que la presencia de los dos fitopatógenos evaluados, afectaron ligeramente el crecimiento de las colonias de los cuatro aislados de Trichoderma spp. debido quizá a la competencia de nutrimentos con los fitopatógenos.
Un fenómeno no reportado fue el que se observó en el aislado HK704, que es significativamente afectado en su crecimiento cuando está frente a M. phaseolina.
En cuanto a las pruebas de antagonismo se observa que los aislados HK701 de T. hammatum, HK703 de T. asperellum y HK704 muestran antibiosis por competencia hacia M. phaseolina. Esta característica puede servir para intervenciones en condiciones de campo, pues esto puede conducir a una disminución de daños en plantas afectadas por este fitopatógeno. Esto concuerda con reportes anteriores de otras especies de Trichoderma spp que se han probado para el control de M. phaseolina (Adekunle et al , 2001).
T. asperellum y HK704 muestran antibiosis por competencia hacia M. phaseolina. Esta característica puede servir para intervenciones en condiciones de campo, pues esto puede conducir a una disminución de daños en plantas afectadas por este fitopatógeno. Esto concuerda con reportes anteriores de otras especies de Trichoderma spp que se han probado para el control de M. phaseolina (Adekunle et al , 2001).
El crecimiento de la colonia de T. koningiopsis cubrió por completo el micelio de M. phaseolina y a las 72 h se observó en la parte inferior de la caja que el color negruzco, típico de la formación de esclerocios de M. phaseolina, disminuye cuando está presente al aislado HK702, lo que indica que existe micoparasitismo hacia este fitopatógeno. Así se confirma que Trichoderma sp. podría destruir no solo el micelio, sino también las estructuras de resistencia de este hongo fitopatógeno, lo cual coincide con lo reportado con anterioridad por Vera et al , (2005) quien muestra que Trichoderma sp. es capaz de degradar e inhibir la formación de esclerocios de Sclerotium cepivorum. Por lo que toca a F. oxysporum , este fue detenido en su crecimiento por los cuatro aislados de Trichoderma sp, pero fue el HK702 el que cubrió por completo la colonia de F. oxysporum. El uso potencial de Trichoderma spp ya había sido reportado contra este fitopatógeno (González et al , 2005).
]]> La reacción que existe en el momento en que Trichoderma sp. entra en contacto con estos dos fitopatógenos es casi imperceptible y solo se observa un ligero cambio de color en dicho punto de contacto. La franja de color que se presenta con los aislados HK701 (T. hammatum), HK703 (T. asperellum) y HK704 (Trichoderma sp) nos indica que existe una reacción de incompatibilidad entre estos aislados y M. phaseolina. Sin embargo, esta interacción no es visible cuando los aislados de Trichoderma spp están frente a F. oxysporum. En el caso del aislado HK702 en el punto de contacto entre las dos colonias en el medio de cultivo, la colonia de T. koningiopsis sigue creciendo y avanza sobre la colonia de M. phaseolina o la de A. parasiticus .A nivel microscópico se observa que el asilado HK702 de T. koningiopsis se enrolla sobre la hifa de M. phaseolina. En el caso del F. oxysporum se observa la unión de las hifas de Trichoderma con las hifas de este. El enrollamiento y formación de apresorios son estructuras especializadas de Trichoderma spp. involucradas en el micoparasitismo para poder parasitar la hifa del patógeno y causar su degradación celular (Benítez et al, 2004). En este caso, no fue posible visualizar estas estructuras con el microscopio óptico, sin embargo, la colonia de HK702 de T. koningiopsis sí cubre totalmen- í cubre totalmente la caja de petri y alcanza a esporular incluso sobre el punto de inoculación de los fitopatógenos.
Por otra parte, Trichoderma spp tiene interacciones complejas con las plantas y uno de sus efectos es sobre la degradación del epispermo que cubre la semilla. Al momento de la germinación acelera el desarrollo de los tejidos meristemáticos primarios, los cuales aumentan la germinación, el volumen, la altura, así como el peso de la planta (Moity, 1982; Miranda et al , 1998; Bailey y Lumsden, 1998; Samuels et al , 2006; Harman, 2006; Shoresh y Harman, 2008a; Shoresh y Harman, 2008b ); esto concuerda con los datos observados, pues en la concentración de esporas intermedia, se incrementa la altura de la planta y la biomasa producida.
Además las cepas de Trichoderma spp. estimulan la germinación, el crecimiento y desarrollo radicular, lo cual mejora la asimilación de agua y nutrientes en cultivos como papas, tomate y cafetos (Windham et al , 1986; Andreu et al , 1992; Cupull et al , 2003; Harman, 2006; Shoresh y Harman, 2008b; Vinale et al , 2008). Este incremento en el peso seco de raíz también fue detectado en la concentración de esporas de 1x10 ex- p4 esp/mL-1 . En el caso de concentración de esporas más elevada se observa una disminución en el desarrollo de las plantas, lo cual puede ser ocasionado por fitotoxinas que producen algunas cepas de Trichoderma spp (Samuels et al a, 2006; Harman, 2006; Shoresh y Harman, 2008b).
Conclusiones
Se aislaron cuatro cepas de Trichoderma spp y se identificaron por métodos moleculares como T. hammatum, cepa HK701; T. koningiopsis, cepa HK702; T. asperellum, cepa HK703 y Trichoderma sp, cepa HK704. Las tres primeras fueron aisladas de la rizósfera de Helianthus annus y la última de la rizósfera de Pinus cembroidess . La cepa HK702 fue el antagonista más agresivo ya que presentó una alta velocidad de crecimiento y limitó el desarrollo de los fitopatógenos al efectuar sobre ellos por hiperparasitismo. Las otras cepas mostraron antagonismo por competencia y antibiosis, pues detienen por completo el crecimiento de los fitopatógenos contra los que fueron evaluados. El aislado HK703 mostró capacidad para incrementar significativamente la biomasa de raíz y el follaje de las plantas tratadas.
Agradecimientos
Se agradece al Instituto Politécnico Nacional y al Patronato para la investigación fomento y sanidad vegetal AC por el apoyo financiero para la realización del trabajo. Al Laboratorio de biotecnología vegetal del CBG-IPN por haber proporcionado las cepas de M. phaseolina y F. oxysporum para este estudio. Hernán- dez Mendoza, J. Luis es becario EDI-IPN y COFAA-IPN. J Manuel González Prieto es becario EDI-IPN; COFAA- IPN y SNI 1. Sánchez-Pérez María Isabel es becaria PIFI- IPN y CONACYT.
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