ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Predicción a escala genómica de Componentes de Saccharomyces cerevisiae mediante Análisis de Balance de Flujos

Prediction of genome scale of Saccharomyces cerevisiae by flux balance analysis

César Augusto Vargas García¹, Henry Arguello Fuentes², Rodrigo Gonzalo Torres Sáez³.

¹ Ms(c) Ingeniería de Sistemas e Informática, Universidad Industrial de Santander, caugusto.vargas@gmail.com.
² PhD(c) Electrical and Computer Engineering, Docente Asistente Escuela de Ingeniería de Sistemas e Informática, Universidad Industrial de Santander. henarfu@uis.edu.co
³ PhD Bioquímica, Docente Asistente Facultad de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, rtorres@uis.edu.co

Recibido: febrero 16 de 2012 Aprobado: junio 20 de 2012

El microorganismo Saccharomyces cerevisiae cuenta con gran número de modelos biológicos conocidos como reconstrucciones, las cuales pueden ser a escala genómica. De estas reconstrucciones a escala genómica provienen los modelos matemáticos, también llamados modelos estequiométricos. Una de las técnicas más usadas para estudiar estos modelos es el Análisis de Balance de Flujos (FBA). El proposito del FBA es predecir el crecimiento del microorganismo bajo estudio, y la producción y consumo de componentes como el etanol, CO₂ glicerol, sucinato, acetato y piruvato. Para determinar si las predicciones obtenidas mediante FBA son únicas se utiliza la técnica de Análisis de Variabilidad Flujos (FVA). El presente trabajo muestra los resultados de aplicar el FBA a la reconstrucción reciente del microorganismo S. cerevisiae, la denominada iMM904 y los compara con un conjunto de datos experimentales presente en la literatura. Este trabajo también estudia la existencia de múltiples predicciones FBA utilizando la técnica FVA. Los resultados ilustran que es posible predecir el crecimiento del microorganimo S. cerevisiae, con errores entre el 11% y 28%; la producción de CO₂, con errores entre el 0.3% y 4.5% y la producción de etanol, con errores entre el 11% y 13%.

Palabras clave: analisis de balance de flujos, reconstrucción a escala genómica, iMM904, S. cerevisiae.

Abstract

Several biological models, named reconstructions, are used for the study of the S. cerevisiae microorganism. The reconstructions can be genomic scaled. Mathematical models are generated from the reconstructions and they are called stoichiometric models. The flux balance analysis (FBA) is one of the tools used for the analysis of these models. The FBA attempts to predict the evolution of the microorganism and the consumption and production of components like glucose, ethanol, glycerol, succinate, acetate and pyruvate. A Flux variability analysis (FVA) is used to determine the uniqueness of the FBA predictions. This paper shows the results of applying FBA to the iMM904 reconstruction of S. cerevisiae and compares them with experimental data from literature. The results in this paper show that it is possible to predict the evolution with errors between 11% and 28% ; the production of CO₂ with errors between 0.3% and 4.5%; and the production of ethanol with errors between 11% and 13%, using FBA for the iMM904 model.

Key words: flux balance analysis, genome scale reconstructions, iMM904, S. cerevisiae.

Introducción

Debido a que las reservas de petróleo disminuyen rápidamente y dados los actuales problemas ambientales producidos por el uso de combustibles fósiles, el etanol se ha convertido en una fuente alternativa de energía renovable y limpia (Bai et al., 2008). La producción de etanol es realizada por microorganismos como S. cerevisiae (conocida como levadura de cerveza). El uso de S. cerevisiae y no de otros microorganismos para la producción de etanol se debe a su tolerancia al etanol y a su capacidad de producción de biomasa para el consumo animal (Bai et al., 2008).

Una forma de almacenar la información estructural de S. cerevisiae es a través de los modelos estequiométricos (Llaneras y Picó, 2008), extraídos de reconstrucciones a escala genómica. Estas reconstrucciones han venido mejorando el nivel de detalle en la descripción de este microorganismo. Este nivel de detalle está representado por la cantidad de genes, reacciones y componentes incluidos en la reconstrucción. (tabla 1).

La técnica más utilizada para el estudio de los modelos estequiométricos extraídos de estas reconstrucciones es el Análisis de Balance de Flujos - FBA (Kauffman et al., 2003), (Lee et al., 2006), (Raman y Chandra, 2009), (Orth et al., 2010), (Gianchandani et al., 2010). Esta técnica ha cobrado interés debido a que no requiere información de la dinámica del sistema (Kauffman et al., 2003). En cambio, el FBA requiere de una función que represente el objetivo biológico del sistema estudiado. El estudio de funciones objetivo se ha realizado utilizando modelos estequiométricos simples y a escala genómica del microorganismo E-coli (Schuetz et al., 2007), (Feist y Palsson, 2010) y otros microorganismos (Gong et al., 2009), (Gong y Yu, 2010). También se ha estudiado modelos estequimétricos reducidos de S. cerevisiae (Burgard y Maranas, 2003), (Gianchandani et al., 2008). Sin embargo hasta la fecha no se han explorado nuevas funciones objetivo del FBA usando redes a escala genómica de S. cerevisiae.

El trabajo realizado en (Famili et al., 2003) fue uno de los primeros sobre predicción de consumo y producción de componentes, como el etanol, del organismo S. cerevisiae utilizando FBA y un modelo estequiométrico extraído de la reconstrucción a escala genómica iFF708. Las capacidades de los modelos extraídos de iFF708 e iND750 han sido estudiadas en los trabajos (Famili et al., 2003) y (Hjersted y Henson, 2009) y se han realizado estudios posteriores como en (Bro et al., 2006) y (van Berlo et al., 2011) utilizando estos modelos. En contraste el modelo iMM904 carece de estudios como el de (Famili et al., 2003) y (Hjersted y Henson, 2009). A la fecha no existen trabajos de FBA que utilicen el modelo iMM904.

Es posible que el Análisis de Balance de Flujos produzca más de una solución (Lee et al., 2000). La enumeración de estas soluciones es computacionalmente costosa en modelos a escala genómica. Una alternativa computacionalmente viable para el estudio de estas soluciones es el Análisis de Variabilidad de Flujos - FVA. El primer trabajo que realiza un Análisis de Variabilidad de Flujos es el de (Mahadevan y Schilling, 2003).

La literatura actual carece de un trabajo que estudie la producción y consumo de los componentes etanol, glicerol, CO y acetato de S. cerevisiae a través de FBA y FVA utilizando el modelo extraído de la reconstrucción iMM904. Aunque existe un estudio sobre este modelo (Mo et al., 2009), son necesarios trabajos que exploren otros componentes además de la glucosa, tales como el etanol el cual es importante en la producción de biocombustibles.

El estudio de este modelo es importante debido a que la reconstrucción iMM904 es la más detallada dentro de las reconstrucciones que han sido base para las reconstrucciones actuales (Mo et al., 2009). También se requiere la validación de la capacidad de predicción de la técnica FBA utilizando dicho modelo. Esto permite determinar la aplicabilidad de este modelo en futuros trabajos sobre el organismo S. cerevisiae, y además muestra cuales son los problemas de predicción, con el fin de proponer futuros estudios para solucionarlos.

El uso de FBA con modelos extraídos de reconstrucciones genómicas ha permitido evaluar genes esenciales de crecimiento, reducción, o no esenciales; y por tanto permite la identificación de objetivos en el desarrollo de medicamentos usados en tratamientos como el de la tuberculosis (Raman et al., 2005). Otra de las aplicaciones del FBA y modelos genómicos es la predicción de respuesta de microorganismos ante eliminación o reducción de expresión genética. Estas predicciones son usadas para realizar ingeniería metabólica con el fin de obtener bioproductos deseados (Manichaikul et al., 2009). Usar la reconstrucción iMM904 permite estudiar S. cerevisiae a un nivel de detalle mucho mayor que los modelos iFF708 e iND750.

El objetivo del presente artículo es comparar los resultados obtenidos al aplicar la técnica de FBA utilizando el modelo estequiométrico iMM904, contra resultados experimentales de este organismo. Además se busca comparar los resultados de aplicar FVA contra mediciones experimentales. En este artículo se describen y utilizan las técnicas FBA y FVA sobre el modelo estequiométrico de la iMM904. La capacidad de predicción es representada por los errores entre las predicciones de crecimiento y producción de los componentes CO₂ y etanol del organismo S. cerevisiae, y los correspondientes valores experimentales.

Este artículo está organizado de la siguiente forma: la sección de métodos explica el modelo estequiométrico y describe las técnicas FBA y FVA, y el por qué de la existencia de múltiples soluciones de un FBA. La sección de resultados muestra el resultado de aplicar las técnicas FBA y FVA al modelo estequiométrico obtenido de la reconstrucción iMM904. La sección final indica las conclusiones del presente trabajo.

Materiales y métodos

En el modelo estequiométrico, la variación de la cantidad de un componente a través del tiempo v_j^E , se define como una combinación lineal

donde v_j son las velocidades de reacción que lo afectan, S_j, y N es el coeficiente estequiométrico que indica la cantidad requerida o producida del componente n_i en la reacción con velocidad v_j, y N es el número de reacciones del sistema. De la misma manera, el conjunto de variaciones de todos los componentes n_i donde i=1,...,M se representan por medio del sistema de ecuaciones lineales

donde n = [ n₁, ..., n_M]^T es el vector de cantidades de los componentes del sistema estudiado, es una matriz de dimensiones, la cual se conoce como la matriz estequiométrica, y es el vector de velocidades de reacción (vector de distribución de flujos o vector de flujos). En todo modelo estequiométrico el número de componentes es menor que el número de reacciones, es decir M < N.

La figura 1 muestra un ejemplo de un modelo estequiométrico. El sistema está compuesto por cuatro componentes cuyas cantidades son: ρ₁, ρ₂, n₁, n₂ y cuatro reacciones cuyas velocidades son: ν₁, ν₂, ν₃ y ν₄. ρ₁ y ρ₂ son respectivamente la entrada y la salida del sistema y se conocen como componentes externos. n₁ y n₂ representan componentes internos. Este sistema puede representarse mediante un grafo cuyos nodos corresponden a los componentes n₁ y ρ_w w = 1, ..., w, y cuyas aristas corresponden a las reacciones v_j (figura 1(a)).

El conjunto de reacciones que describe el sistema se muestra en la figura 1(b). En este sistema una reacción es un proceso que afecta un conjunto de componentes, así como una arista es una conexión entre un conjunto de nodos en un grafo. Las reacciones se clasifican en internas y externas. Las reacciones internas incluyen solo componentes internos y las externas afectan tanto componentes internos como externos. La cantidad de cada uno de los componentes que involucra cada reacción se muestra en la figura 1(b); por ejemplo, la reacción que ocurre a la velocidad v₁ toma una unidad del componente ρ₁ y produce dos unidades de n₁ .

Para construir la matriz S‾ se usa la matriz de incidencia S‾ de dimensiones (W + M) × N, mostrada en la figura 1(c). Las primeras W filas de S‾ corresponden a los componentes ρ _w, y las restantes corresponden a los componentes n₁ . Las columnas de S‾ corresponden a las reacciones con velocidades v_j .

En general, si S‾_w+i,j<0 entonces v_j consume ¦ S‾_w+i,j ¦ unidades del componente n_i, si S‾_w+i,j>0 entonces la reacción v_j produce el componente n₁ S‾_w+i,j unidades, y si S‾_w+i,j=0 el componente n_i no participa en la reacción v_j . De forma análoga, S‾_w+i,j representa la participación del componente ρ_w en la reacción v_j .

La matriz S se obtiene eliminando las primeras W filas de S‾ que corresponden a componentes externos. La figura 1(d) muestra la matriz S resultado de eliminar las filas w = 1,2 de S‾, que corresponden a los componentes ρ₁ y ρ₂ . En S se cumple que M < N (M = 2 y N = 4). Finalmente, la figura 1(e) muestra el vector de velocidades de reacción v .

Análisis de balance de flujos - FBA

Para estimar el comportamiento de un sistema usando el modelo estequiométrico, se asume estado estacionario del sistema el cual se representa por medio de la ecuación

donde O_M es un vector de longitud M cuyos elementos son todos cero. La ecuación matricial (3) define un sistema de ecuaciones lineales subdeterminado con infinitas soluciones. Para delimitar el espacio solución de la ecuación (3) se definen los límites de cada una de las velocidades de reacción del sistema mediante

donde α_j y β_j son los límites inferior y superior de v_j . Por último se establece una función objetivo

Dados la matriz S, los vectores α = [α₁,…, α_N], Β = [Β₁,…, ΒN] y c, se busca un vector que sea solución del problema de programación lineal

la búsqueda de soluciones al problema (6) se conoce como FBA.

La figura 2 muestra un sistema biológico y las definiciones correspondientes a la formulación FBA. Los elementos externos son ρ ₁, ρ₂, ρ₃, ρ₄ y los internos son n₁, n₃, n₄ y n₅. El grafo que describe el sistema se muestra en la figura 2(a). La matriz estequiométrica S se define en la figura 2(b). α, β y c se muestran en la figura 2(c). El valor negativo de α₁ indica que la dirección de la reacción con velocidad v₁ puede ser en cualquiera de dos sentidos: consumo del elemento n₁ con un valor máximo β₁=5, o producción de éste con valor mínimo α₁=-2. Un valor negativo de v_j indica que lo que se produce en una reacción se consume y lo que se consume se produce. En general si α_j<0 entonces la reacción con velocidad v_j se denomina reversible. Si por el contrario α_j ≥0 entonces v_j es irreversible, debido a que conserva la dirección con la que aparece el grafo (Raman y Chandra, 2009).

El vector de coeficientes c define la función objetivo del sistema de la figura 2. En este ejemplo el vector contiene valores diferentes de 0 en las posiciones correspondientes a las reacciones externas v₁ y v₂ . Esto indica que el objetivo del sistema es la maximización de las velocidades de las reacciones que producen los elementos ρ₂ y ρ₄ . En el caso de la figura 2, la función objetivo se puede expresar como ƒ = c^Tv = v₂ + v₄. La solución v mostrada en la figura 2(c) se obtuvo a través de programación lineal utilizando el paquete matemático MatLab . La figura 2(d) muestra de forma gráfica la interpretación de este resultado. Por último la figura 2(e) muestra el código utilizado en MatLab para obtener esta solución.

Soluciones del FBA

El conjunto de ecuaciones lineales Sv = 0M y de inecuaciones lineales α_j ≤ ν_j ≤ Β_j definen el poliedro convexo, cerrado y acotado

donde u_k k = 1,..., se conoce como los puntos extremos o vértices del poliedro P. Un punto u_k es extremo si no existen dos puntos a y b ε P tales que u_k = θ_a + (1 - θ)b . Esta representación de P se conoce como la representación V.

El teorema estudiado en (Gass, 1985) indica que el vector que resuelve la ecuación (6) es el punto extremo u_Q, Q?{1,…,L} tal que c^Tu_Q > c^Tu_k con k≠Q . En caso de existir múltiples soluciones, los vectores que resuelven la ecuación (6) son los puntos extremos u_Qr, Q_r &e12:50 09/10/2012psilon;{1,…,L} r = 1,…,R tales que c^Tu_Qr > c^Tu_k con k ≠ Q_r y . Más aún, los vectores de la forma

también son solución de la ecuación (6).

Los teoremas anteriormente descritos son equivalentes a establecer que, el punto extremo con el mayor valor de función objetivo es solución única de la ecuación (6). Si existe más de un punto extremo con el máximo valor de función objetivo posible, la ecuación (6) tiene infinitas soluciones, todas descritas por combinaciones lineales convexas de estos puntos extremos.

La existencia de más de una solución se ilustra a través del estudio de los puntos extremos del problema de la figura 2. Se obtuvieron L=35 puntos extremos mediante el Método de Descripción Doble (cdd) (Fukuda and Prodon, 1996), con implementación disponible para uso en MatLab. En la figura 3 se muestran los valores de c^Tu_k, k = 1,...,L. El máximo valor de c^Tu_k es 5, el cual corresponde a los puntos u₂₄, u₃₃, u₃₄ y u₃₅ .

En la figura 4 se muestran los puntos u_Qr, r=1,...,4 con Q₁=24, Q₂=33, Q₃=34 y Q₄=35, que son los puntos extremos solución de la ecuación (6). El vector solución v mostrado en la figura 2 se puede expresar como la combinación lineal convexa de los puntos extremos u_Qr indicados en la figura 3. Esto se indica en la figura 4. Para encontrar los valores λ_r mostrados en la figura 4, se hizo λ=U⁺v, donde λ =[λ₁,..., λ₄]^T, U = [u_Qr1,..., u_Q4 U⁺ es la pseudoinversa de U y v es el vector solución encontrado en la figura 2.

Análisis de variabilidad de flujos - FVA

Debido a la existencia de múltiples soluciones de (6), se requiere determinar el intervalo de posibles valores de v_j . El Análisis Variabilidad de Flujos (Mahadevan y Schilling, 2003) consiste en optimizar el valor de v_j mediante dos problemas de optimización separados. La primera optimización consiste en minimizar v_j a través de

y la segunda optimización consiste en maximizar v_j resolviendo

Las simulaciones realizadas buscan determinar la capacidad de predicción del FBA usando el modelo estequiométrico obtenido de la reconstrucción iMM904. Para este fin, se compara las velocidades de reacciones de consumo/producción de componentes obtenidas a través del FBA, con las respectivas mediciones experimentales. El conjunto de mediciones experimentales usado en este trabajo fue tomado de (Nissen et al., 1997) y se presenta en la tabla 2. Consta de 4 experimentos bajo condiciones anaeróbicas, en los cuales varía la velocidad de crecimiento (gw) del sistema. A cada velocidad de crecimiento, le corresponde la velocidad de producción de dióxido de carbono (CO₂), etanol (eth), glicerol (gly), sucinato (succ), acetato (ace) y consumo de glucosa (glc).

La reconstrucción iMM904 cuenta con 1228 componentes internos y 1577 reacciones. Está disponible en formato SimPheny (Mo et al., 2009).

Se define v_<reacción>, como la velocidad de reacción de nombre <reacción>, con j igual al índice de la columna de S que corresponde a la reacción . Los valores α_<reacción> y β_<reacción> definen los límites de la reacción v_<reacción> . El valor c_<reacción> define el coeficiente que acompaña a v_<reacción> en la función objetivo. La correspondencia entre nombres de reacción en la iMM904 y velocidades v_<reacción> usados en las simulaciones del presente trabajo se muestran en la tabla 3. Las reacciones listadas son externas, salvo v_gw y v_ATPM . Por convención, en la reconstrucción iMM904 todas las reacciones externas producen componentes externos.

El modelo estequiométrico S^1228×1577 se construye utilizando el paquete COBRA disponible para MatLab® (Schellenberger et al., 2011). La reconstrucción iMM904 también cuenta con información sobre las capacidades del sistema representadas por los vectores α y β . Excluyendo algunas reacciones, los límites de v_j son α_j=-1000 (mmol/gDWh) para reacciones reversibles, α_j=0 (mmol/gDWh) para irreversibles y β_j=-1000 (mmol/gDWh) . La función objetivo incluida en esta reconstrucción es la maximización del crecimiento del sistema, representada por c, con c_gw=1 y para toda reacción diferente a la de crecimiento. Este vector c se interpreta como que el objetivo es la maximización de crecimiento del sistema. La reconstrucción iMM904 incluye la función objetivo c^Tv descrita anteriormente debido a que es la más aceptada en la literatura (Feist y Palsson, 2010) . El modelo está disponible para MatLab® y COBRA**** .

**** http://www.eecsgroup.com/CV_Research_files/cb_iMM904.mat

Las condiciones de las mediciones experimentales de la tabla 2 requieren modificación de algunas restricciones FBA que establece por defecto la reconstrucción iMM904. La condición anaerobia significa que el medio en el que se encuentra carece de oxigeno. En el FBA esto equivale a establecer α_{EX_02(e)} β_{EX_02(e)}=1. Debido al estado anaerobio es necesario que el sistema tenga acceso a componentes que en ausencia de oxigeno no se pueden producir. Por defecto las reacciones correspondientes a estos componentes solo producen y no consumen, es decir dichas reacciones son irreversibles. Para permitir que el sistema tenga acceso a componentes fundamentales se convierten en reversibles.

El mantenimiento interno de energía del sistema, representado en el modelo por v_APTM se conserva igual al provisto por la reconstrucción. La lista de restricciones por defecto de la iMM904 y las restricciones del FBA establecidas en este trabajo se presentan en la tabla 4. Esta lista no incluye todas las restricciones, solo aquellas relevantes para el conjunto de datos experimentales de la tabla 2.

Cada una de las cuatro condiciones experimentales expuestas en la tabla 2 establece una entrada de glucosa. Esta entrada es representada fijando α_{EX_glc(e)} y β_{EX_glc(e)} a cada uno de los valores experimentales. Por defecto todas las reacciones externas de la iMM904 producen componentes externos. La reacción v_{EX_glc(e)} es externa y produce el componente de glucosa (glc(e)). El valor experimental de glucosa que aparece en la tabla 2 es de consumo y no producción por tanto, el valor de α_{EX_glc(e)} y β_{EX_glc(e)} es el valor experimental con signo negativo.

Por cada condición experimental de la tabla 2 se realizó un FBA y un FVA. Se determinó el error entre la predicción de las velocidad de reacción v_j y el correspondiente valor experimental v_j^E mediante ¦ (v_j-v_j^E)/v_j^E ¦ X 100%. También se midió la variabilidad de cada una de las reacciones en cada una de las condiciones experimentales. Esta variabilidad se obtuvo restando el valor mínimo del máximo de la reacción obtenidos resolviendo las ecuaciones (10) y (11) para aquellas con información experimental disponible.

También se realizó un FVA fijando el valor de la función objetivo f=v_gw al valor de crecimiento de cada condición experimental del sistema. Al fijar la función objetivo al valor experimental de crecimiento se busca determinar los efectos de un estado subóptimo del sistema sobre la variabilidad de las demás reacciones con valor experimental.

Las simulaciones se realizaron en un equipo con procesador Intel Core i3® y memoria RAM de 4GB DDR3. Los problemas de programación lineal de este trabajo fueron solucionados utilizando el paquete de software libre GLPK (Makhorin, 2011) con interfaz disponible para MatLab® a través del paquete COBRA.

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 6. Las reacciones con las mejores predicciones mediante FBA en las cuatro condiciones experimentales son, en orden de exactitud CO₂, con errores entre 0.3% y 4.5% ; etanol, entre 11% y 13% ; y crecimiento, entre 11% y 28% (figura 5). La predicción del crecimiento es superior al registrado en cada condición experimental de la tabla 2 (figura 5(a)).

La predicción de glicerol en todas las condiciones experimentales es de 0 (mmmol/gDWh) . El valor experimental del glicerol en todas las condiciones comparadas está entre 0 y 6 (mmmol/gDWh) . Esto implica que el error de predicción de glicerol excede el 100%. La predicción de sucinato en todas las condiciones experimentales está entre 0 y 2 (mmmol/gDWh) . Los valores experimentales de sucinato en todas las condiciones están entre 0.03 y 0.07 (mmmol/gDWh) . Por lo tanto, el error en la predicción de sucinato supera el 100%. Observaciones similares a las anteriores muestran que el error en las predicciones de acetato y piruvato exceden el 100%.

La exactitud de las predicciones de CO₂ son mejores que las registradas en (Famili et al., 2003). Las predicciones de etanol tienen una exactitud similar a las registradas en dicho trabajo. Es importante resaltar que (Famili et al., 2003) es el único estudio de S. cerevisiae mediante FBA y modelos genómicos que incluye un FVA.

La figura 5 muestra también los resultados de variabilidad de las soluciones FBA para cada condición experimental. Se considera que no hay variabilidad cuando la diferencia entre el valor máximo y mínimo de una reacción en una predicción es inferior a aX10^-5 (Mahadevan y Schilling, 2003). Si no hay variabilidad en las velocidades de reacción estudiadas quiere decir que todas las soluciones posibles tienen los mismos valores de velocidades de reacción estudiadas. Si todas las velocidades v_j no tienen variabilidad entonces la solución es única. A mayor variabilidad, mayor número de soluciones al problema FBA. La variabilidad de las reacciones con mediciones experimentales osciló entre 2X10^-5 y 3.48 . Las reacciones v_{EX_gly(e)} y v_{EX_ace(e)} tuvieron variabilidad únicamente en la condición experimental 2 . La reacción v_{EX_pyr(e)} no tuvo variabilidad en las condiciones 1 y 3 . La figura 5(c) muestra que el valor experimental de v_{EX_gly(e)} no está entre las predicciones máxima y mínima. Las predicciones máxima y mínima del sucinato, acetato y piruvato solo contienen los valores de la condición experimental 2 (figuras 5(d), 5(e) y 5(f)).

La figura 6 muestra los resultados de realizar FVA fijando el valor de función objetivo al valor experimental de v_gw . La variabilidad aumentó, oscilando entre 0.81 y 36.54 (mmol/gDWh) para las reacciones con valor experimental. A diferencia de la figura 5, los valores de las condiciones experimentales están entre el valor mínimo y máximo de cada reacción. Estos resultados requieren un valor de crecimiento diferente al óptimo para explicar el comportamiento experimental de v_{EX_gly(e)}, v_{EX_succ(e)}, v_{EX_ace(e)} y v_{EX_pyr(e)} . Este valor de crecimiento es subóptimo comparado con el obtenido por el FBA. Lo anterior implica que fijar el crecimiento a un valor subóptimo, permite que la diferencia entre la predicción FBA de crecimiento v_gw y su respectivo valor experimental pueda ser utilizada en la producción de componentes como el glicerol v_{EX_gly(e)} .

Aunque la exactitud de las predicciones es similar a la encontrada en la literatura, los FVA realizados en este trabajo muestran que se requiere una función objetivo que permita al FBA explicar completamente el comportamiento experimental. Es necesario un estudio de la técnica FBA y la reconstrucción iMM904 utilizando propuestas alternativas de funciones objetivo.

Conclusiones

Los resultados de los FVA realizados en este trabajo permitieron determinar que el FBA y la reconstrucción iMM904 falla en la predicción de glicerol v_{EX_gly(e)}, sucinato v_{EX_succ(e)}, acetato v_{EX_ace(e)} y piruvato v_{EX_pyr(e)} bajo las condiciones experimentales descritas en (Nissen et al., 1997). La no variabilidad en la predicción de estos componentes soporta esta afirmación. El aumento de la variabilidad obtenida al realizar el estudio de FVA con un valor subóptimo de función objetivo confirma este resultado.

Este trabajo detalló la formulación FBA aplicada a la reconstrucción iMM904. A diferencia de los trabajos encontrados en la literatura, este trabajo explica cada una de las restricciones utilizadas en el FBA y mostró su equivalencia en las condiciones experimentales utilizadas. Este trabajo describió y mostró la importancia de utilizar el FVA para el análisis de resultados arrojados por el FBA.

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