http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v15n2.41263

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Balance de Flujos Metabólicos en Saccharomyces cerevisiae basado en Compartimentalización Intracelular

Metabolic Flows Balance in Saccharomyces cerevisiae based on Intracellular Compartmentalization

César Augusto Vargas García¹, Carlos Eduardo García Sánchez², Henry Arguello Fuentes³, Rodrigo Gonzalo Torres Sáez⁴

¹ Msc Ingeniería de Sistemas e Informática, Universidad Industrial de Santander, caugusto.vargas@gmail.com.
² PhD Ingeniería Química, Universidad Industrial de Santander, carlos.garcia6@correo.uis.edu.co.
³ PhD Electrical and Computer Engineering, Docente Asistente Escuela de Ingeniería de Sistemas e Informática, Universidad Industrial de Santander. henarfu@uis.edu.co.
⁴ PhD Bioquímica, Docente. Asistente Facultad de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, rtorres@uis.edu.co.

Resumen

Una de las técnicas más utilizadas para la predicción de producción de bioproductos y distribución intracelular de flujos de microorganismos es el Análisis de Balance de Flujos - FBA por sus siglas en inglés. El FBA requiere de una función objetivo que represente el objetivo biológico del microorganismo estudiado. En este trabajo se propone un nuevo tipo de funciones objetivo basada en la combinación de objetivos de compartimentos físicos presentes en el microorganismo estudiado. Este tipo de funciones objetivo son examinadas junto con un modelo estequiométrico extraído de la reconstrucción iMM904 del microorganismo S. cerevisiae. Su desempeño se compara con la función objetivo más usada en la literatura, la maximización de biomasa, en condiciones experimentales anaeróbicas en cultivos continuos y aeróbicas en cultivos tipo lote. La función objetivo propuesta en este trabajo mejora las predicciones de crecimiento en un 10% y las predicciones de producción de etanol en un 75% respecto a las obtenidas por la función objetivo de maximización de biomasa, en condiciones anaeróbicas. En condiciones aeróbicas tipo lote la función objetivo propuesta mejora en un 98% las predicciones de crecimiento y en un 70% las predicciones de etanol con respecto a la función objetivo de biomasa.

Palabras clave: Análisis de Balance de Flujos, FBA, iMM904, S. cerevisiae, Función Objetivo basada en Compartimentos.

Abstract

Flux Balance Analysis - FBA - is one of the most used techniques in prediction of microorganism bioproducts. It requires an objective function that represents biological objective of the studied microorganism. This paper presents a new kind of objective functions based on individual physical compartment objetives in the studied microorganism. These kind of functions was tested with a stoichiometric model extracted from iMM904 reconstruction of S. cerevisiae and its performance is compared with the most used objective function in literature, growth maximization, in anaerobic and aerobic batch conditions. The presented objective function outperform growth predictions in 10% and ethanol predictions in 75% compared with obtained by maximization of growth objective function, in anaerobic conditions. In aerobic batch conditions the presented objective function outperforms in 98% growth preditions and 70% ethanol predictions compared with growth maximization.

Key words: Flux Balance Analysis, FBA, iMM904 reconstruction, Compartment based Objective Function.

Introducción

En los últimos años el Análisis de Balance de Flujos (FBA) ha permitido estudiar la obtención de bioproductos y la distribución intracelular de flujos; esta última a su vez ha facilitado la comprensión de la estructura biológica a escala genómica de microorganismos. El estudio de la distribución intracelular tiene aplicaciones que van desde la ingeniería metabólica hasta el descubrimiento de medicamentos (Gianchandani et al., 2010).

Uno de los desafíos actuales presentes en el FBA es la determinación de una función objetivo que permita reproducir con mayor exactitud resultados experimentales de microorganismos estudiados (Raman y Chandra, 2009). El microorganismo Escherichia coli cuenta con numerosos estudios sobre la mejor función objetivo que describe su comportamiento bajo diferentes condiciones experimentales, incluyendo anaeróbica y aeróbica, y con diferentes niveles de detalle en sus modelos estequiométricos, desde un conjunto reducido de reacciones hasta modelos extraídos de reconstrucciones a escala genómica (Feist y Palsson, 2010). En contraste el microorganismo Saccharomyces cerevisiae tiene solo un estudio que busca nuevas funciones objetivo y ninguno usando modelos a escala genómica (Feist y Palsson, 2010).

La reconstrucción a escala genómica iMM904 es hasta ahora la más detallada y confiable en la reproducción de condiciones experimentales de S. cerevisiae (Mo et al., 2009). Supera en información genética a sus predecesoras iND750 (Duarte et al., 2004) e iFF708 (Förster et al., 2003).

La búsqueda de la mejor función objetivo del FBA se realiza de dos formas: a través de programación binivel (Terzer et al., 2009) y mediante evaluación sistemática de funciones (Feist y Palsson, 2010). En la primera, se eligen un conjunto de posibles reacciones cuya maximización o minimización puedan explicar una condición experimental y se determinan coeficientes que acompañan a dichas reacciones, a través de las soluciones obtenidas de un problema de programación binivel. El grupo de reacciones y los coeficientes que las acompañan se conocen como "función objetivo". Los problemas de optimización binivel se vuelven intratables computacionalmente en modelos a escala genómica (Gianchandani et al., 2008) debido a que su complejidad es NP-dura¹ (Colson et al., 2007).

_____________________________
1 Problema de tiempo polinomial no deterministico. Implica que el tiempo que toma solucionar dicho problema incrementa de forma polinomial en relación a su tamaño (número de variables).

En la evaluación sistemática de funciones se elige un conjunto de funciones objetivo, ya conocidas y probadas, y mediante un criterio de selección se determina cuál de estas funciones obtiene la predicción más exacta para el modelo y condiciones experimentales estudiadas. Esta solución es computacionalmente menos costosa que la solución de problemas binivel debido a que el número de funciones objetivo probadas en la literatura es reducido (Feist y Palsson, 2010) y a que la prueba de una función objetivo consiste en resolver un FBA que a su vez consiste en resolver un problema de programación lineal.

Dentro de los trabajos de evaluación sistemática de funciones no hay registro de alguno que estudie la combinación de funciones objetivo conocidas con el fin de mejorar predicciones de producción de bioproductos como biomasa (o crecimiento) o etanol. Tampoco se ha estudiado que propiedades aporta la división espacial encontrada en microorganismos como S. cerevisiae a la predicción de bioproductos.

Hasta la fecha, la función objetivo que predice con la mayor exactitud la producción de biomasa (o crecimiento del microorganismo) y etanol de S. cerevisiae en condiciones experimentales aeróbicas tipo lote es la maximización de producción de biomasa (Gianchandani et al., 2008). Sin embargo, el estudio no se realizó sobre un modelo estequiométrico extraído de una reconstrucción a escala genómica.

El presente trabajo propone una nueva forma de crear funciones objetivo para el FBA basada en la división espacial del microorganismo S. cerevisiae. Esta división es conocida como compartimentalización. A cada compartimento se le asigna una función objetivo conocida. La función objetivo a utilizar en el FBA es la combinación de las funciones individuales de cada compartimento.

Este nuevo tipo de funciones es probada en el FBA utilizando un modelo estequiométrico extraído de la reconstrucción a escala genómica iMM904. Las condiciones experimentales a estudiar son anaeróbicas en cultivos continuos² y aeróbicas tipo lote³ en fase exponencial⁴. Los resultados obtenidos con la mejor de estas funciones son comparados con los obtenidos usando la función objetivo maximización de biomasa, que es la sugerida por Gianchandani et al. (2008) y Feist y Palsson (2010) y usada en el FBA tradicional en condiciones aeróbicas y anaeróbicas.

Este artículo está organizado de la siguiente forma: la sección de métodos explica el modelo estequiométrico y describe la técnica FBA. Además, esta sección presenta la forma de construir funciones objetivos basada en compartimentalización y el lugar que ocupa en la formulación FBA. La sección de resultados muestra el producto de aplicar la técnica FBA al modelo estequiométrico obtenido de la reconstrucción iMM904 utilizando las funciones objetivo propuestas en este trabajo y la función de maximización de biomasa.

Materiales y Métodos

Modelo Estequiométrico

En el modelo estequiométrico, la variación de la cantidad de un componente a través del tiempo se define como una combinación lineal

donde v_j son las velocidades de reacción que lo afectan, S_i,j es el coeficiente estequiométrico que indica la cantidad requerida o producida del componente n_j en la reacción con velocidad v_j , y N es el número de reacciones del sistema.

donde n = [n₁, ..., n_M]^T es el vector de cantidades de los componentes del sistema estudiado, S es una matriz de dimensiones M × N, la cual se conoce como la matriz estequiométrica, y v = [ν₁, ..., ν_N]^T es el vector de velocidades de reacción (vector de distribución de flujos o vector de flujos). En todo modelo estequiométrico el número de componentes es menor que el número de reacciones, es decir M < N.

Análisis de Balance de Flujos - FBA

Para estimar el comportamiento de un sistema usando el modelo estequiométrico, se asume estado de equilibrio estacionario del sistema el cual se representa por medio de la ecuación

donde 0_M es un vector de longitud M cuyos elementos son todos cero. La ecuación matricial (3) define un sistema de ecuaciones lineales subdeterminado con infinitas soluciones. Para delimitar el espacio solución de la ecuación (3) se definen los límites de cada una de las velocidades de reacción ν_j del sistema mediante

donde α_j y β_j son los límites inferior y superior de ν_j. Por último, se establece una función objetivo

Dados la matriz S, los vectores α[α₁,..., α_N], β = [β₁,...β_N] y c, se busca un vector v que sea solución del problema de programación lineal

La búsqueda de soluciones al problema (6) se conoce como FBA.

Funciones Objetivo Basadas en Compartimentos

Sea el compartimento P₁ donde l = 1,...,L es un conjunto de índices j de v. Se define la combinación lineal C₁^Tv, donde C₁ es un vector columna de dimensión N. Esta combinación se conoce como la función objetivo del compartimento P₁. Si j P₁ y la velocidad ν₁ no está incluida dentro de la función objetivo del compartimento P₁ entonces C_j,l = 0. Por el contrario, si j P₁ y ν_j hace parte de la función objetivo del compartimento P₁ entonces C_j,l ≠ 0. Por último C_j,l ≠ 0 si ƒ Pl.

La figura 1 muestra un ejemplo de un sistema con 3 compartimentos: P₁, P₂ y P₃. El conjunto P₁ contiene las reacciones ν₈, ..., ν₁₄, P₂, contiene las reacciones ν₁₆, ..., ν₁₈, P₃ las reacciones ν₂₀, ..., ν₂₇. Las reacciones ν₁, ..., ν₇ no pertenecen a compartimento alguno y se conocen como reacciones de transporte externas del sistema. Las reacciones ν₁₅ y ν₁₉ representan el intercambio de componentes entre compartimentos y tampoco pertenecen a compartimento alguno. La figura 1 también muestra los vectores columna C₁, C₂ y C₃ los cuales representan las funciones objetivo de los compartimentos P₁, P₂ y P₃, respectivamente. Es importante aclarar que aunque las reacciones ν₈, ..., ν₁₄ pertenecen al compartimento P₁, sólo las reacciones ν₁₀, y ν₁₃ se incluyen en la función objetivo C₁^Tv.

Figura 1

Dados S, α, β, la matriz C = [C_l1, ..., C_lg] de dimensiones N × K y el vector w = [w₁, ..., w_K]^T, el presente trabajo propone buscar el vector que es solución del problema de programación lineal

Simulaciones

La reconstrucción iMM904 cuenta con 1228 componentes internos y 1577 reacciones distribuidos en 8 compartimentos, disponible en formato SimPhenyTM. Cuenta con información sobre las capacidades del sistema representadas por los vectores α y β. Excluyendo algunas reacciones, los límites de ν_j, siendo PS el peso seco, son α_j = -1000 para reacciones reversibles, α_j = 0 para irreversibles y β_j = 1000 . La función objetivo por defecto en esta reconstrucción es la maximización de biomasa o crecimiento del sistema (Feist y Palsson, 2010), representada por c, con c_gw = 1 y c_j = 0 para toda reacción diferente a la de crecimiento ν_gw. El modelo estequiométrico S^1228×1577 y los vectores α y β se extrajeron de la reconstrucción iMM904 utilizando el paquete COBRA (Schellenberger et al., 2011) disponible para MatLab^®.

Se utilizaron los compartimentos citosol, mitocondria y peroxisoma disponibles en la reconstrucción iMM904, los cuales se denominarán de aquí en adelante P₁, P₂ y P₃. Para el compartimento P₁ se propusieron 13 posibles funciones objetivo; para el compartimento P₂, 4 posibles funciones objetivo; y para el compartimento P₃, 5 posibles funciones objetivo. Estas funciones objetivo se denominarán de aquí en adelante C₁, C₂ y C₃, respectivamente.

Para la construcción de las funciones C₁ se eligió la maximización y minimización de las velocidades de reacción que corresponden a la producción y/o consumo de los componentes NADH, NADPH, ATP, etanol, dióxido de carbono, glicerol, succinato y acetato los cuales están presentes en el compartimento P₁. Las funciones C₂ consisten en la maximización y minimización de las velocidades de producción y/o consumo de los componentes NADH, NADPH y ATP del compartimento P₂. Por último, para las funciones objetivo C₃ se eligió la maximización y minimización de las reacciones que producen y/o consumen ácidos grasos, NADH, NADPH y ATP que se encuentran en el compartimento P₃.

Estas funciones objetivo están relacionados principalmente con la producción y consumo de ATP y poder reductor, debido a que estos cofactores juegan un papel importante en la explicación del comportamiento celular. Otros objetivos considerados están asociados con la producción de biomasa, debido a la relevancia de este objetivo en el modelado FBA. La mayoría de los objetivos comparados en trabajos como Schuetz et al. (2007) y Knorr et al. (2007) quedan incluidos entre las combinaciones estudiadas en este trabajo. Su efectividad ha sido estudiada en la literatura de forma individual sin tener en cuenta compartimentos físicos del microorganismo estudiado (Feist y Palsson, 2010).

Se propuso un nuevo compartimento virtual representado por P₄ cuyas funciones objetivo, denominadas C₄ son la maximización y la minimización de biomasa. Este nuevo compartimento permite probar combinaciones de estas dos funciones y otros objetivos propuestos en el citosol. La tabla 1 lista las funciones objetivo propuestas en este trabajo para cada compartimento.

Tabla 1

Se construyeron en total 1259 matrices C que corresponden a las posibles combinaciones de compartimentos y funciones objetivo de cada uno de estos. Por cada matriz C se construyó el vector w = 1_K, donde 1_K es un vector con todos sus elementos iguales a uno y con una longitud K igual al número de compartimentos incluidos en C.

Por cada matriz construida se formularon 12 instancias del problema (7) que representan 12 condiciones experimentales, divididas en 4 condiciones anaeróbicas en quimiostato (Nissen et al., 1997) y 8 aeróbicas tipo lote (Heyland et al., 2009). La condición anaeróbica significa que el medio en el que se encuentra el microorganismo carece de oxígeno y la aeróbica implica que hay presencia de oxígeno. El crecimiento se presentó por medio de la tasa específica de crecimiento. Esta tasa es igual a la tasa de dilución en cultivos continuos con unidades . En cultivos tipo lote, aunque no hay tasa de dilución, se conserva las mismas unidades que en el caso continuo. Las tablas 2 y 3 muestran las condiciones y componentes estudiados.

Tabla 3

Cada una de las instancias del problema (7) formuladas para cada una de las matrices C se resuelve utilizando el software GLPK (Makhorin, 2011) con interfaz disponible para MatLab^® a través del paquete COBRA, mediante un equipo con sistema operativo Linux. En total se resolvieron 12 × 1259 = 15108 instancias del problema (7).

Con el fin de facilitar la notación se define como la velocidad de reacción de nombre <rX> a la cual le corresponde la columna j de S, i.e. ν_<rX> = ν_j. Los valores α_<rX> y β_<rX> definen los límites de la reacción ν_<rX>. El valor c_<rX> define el coeficiente que acompaña a ν_<rX> en la función objetivo. La correspondencia entre nombres de reacción en la iMM904 y velocidades ν_<rX> usados en las simulaciones del presente trabajo se muestran en la tabla 4. Las reacciones listadas son externas, salvo ν_gw y ν_ATPM. Por convención, en la reconstrucción iMM904 todas las reacciones externas producen componentes externos.

Tabla 4

Las condiciones experimentales anaeróbicas de Nissen et al. (1997) requieren modificación de algunas restricciones en el problema (7) que establece por defecto la reconstrucción iMM904. En el problema (7) la condición anaeróbica equivale a establecer α_{EX_o2(e)} = β_{EX_o2(e)} = 0. Debido al estado anaeróbico es necesario que el sistema tenga acceso a componentes que en ausencia de oxígeno no se pueden producir. Estos componentes son ergosterol, zymosterol y algunos ácidos grasos. Dicho acceso es permitido relajando las restricciones sobre 6 reacciones de intercambio; ν_{<EX_ergst(e)>}, ν_{<EX_zymst(e)>}, ν_{<EX_hdcea(e)>}, ν_{<EX_ocdca(e)>}, ν_{<EX_ocdcea(e)>} y ν_{<EX_ocdcya(e)>} ; de modo que pasen de ser irreversibles (sólo producción) a ser reversibles (consumo o producción). Por convención, en la reconstrucción iMM904, las reacciones correspondientes a estos componentes son irreversibles. Convertir en reversibles estas reacciones es equivalente a que el límite inferior sea α_<rX> = -1000 en cada una de las velocidades de reacción de estos componentes.

La lista de restricciones por defecto de la iMM904 y las restricciones del problema (7) extraídas de Nissen et al. (1997) se presentan en la tabla 5. Esta lista no incluye todas las restricciones, sólo aquellas relevantes para el conjunto de datos experimentales de dicho trabajo.

Tabla 5

En las condiciones aeróbicas tipo lote (Heyland et al., 2009) se modificó el límite inferior α_{EX_o2(e)} de consumo de oxígeno por defecto de la reconstrucción iMM904 el cual pasó de -2 a -1000 . Se cambió el límite inferior de consumo oxígeno para que los resultados obtenidos no fueran producto de esa restricción (Hjersted y Henson, 2009) si no del desempeño de las funciones objetivo. Además el consumo de oxígeno puede ser superior a 2 , ya que valores de hasta 10 son comunes experimentalmente.

El mantenimiento interno de energía del sistema, representado en el modelo por νAPTM se conserva igual al provisto por la reconstrucción para todas las condiciones experimentales estudiadas. Para todas las condiciones experimentales se fijó el valor de consumo de glucosa ν_{EX_glc(e)} al correspondiente valor registrado. Las demás restricciones se mantuvieron igual a las suministradas por la reconstrucción iMM904.

_gw

Por último, se compararon las predicciones de etanol y crecimiento obtenidas por la matriz C con el menor error promedio en la predicción de crecimiento _gw, las predicciones de estos bioproductos obtenidas por la función objetivo del FBA tradicional, la maximización de biomasa (Feist y Palsson, 2010), y los resultados experimentales registrados en Nissen et al. (1997) y Heyland et al. (2009). Estas comparaciones se hicieron en términos del error promedio en la predicción de crecimiento _gw y de etanol _{EX_etoh(e)}.

Resultados

La tabla 6 muestra las diez matrices C que producen los promedios de error más bajos en la predicción de crecimiento e_gw, para cada una de las condiciones experimentales de las Tablas 1 y 2.

Tabla 6

Las seis primeras matrices C usadas en condiciones anaeróbicas tienen promedios iguales e_gw (diferencias menores a 1 × 10^-2). Las funciones objetivo C₁ y C₄ son la misma para estas seis matrices. La función objetivo C₂ no aparece en alguna de estas. Esto significa que incluir alguna de las funciones del compartimento C₂ no mejora la predicción de crecimiento. La diferencia en las primeras seis matrices radica en la función objetivo C₃. Cada una de las alternativas de función objetivo C₃ aparece en los seis primeros lugares. También existen una matriz C en la que no se incluye alguna función objetivo C₃ (Fila 1 de resultados en condiciones anaeróbicas en la tabla 6). Lo anterior implica que el menor promedio de error de predicción de crecimiento se obtiene construyendo Cana con minimización de producción de NADH como función objetivo C₁ y maximización de biomasa como función C₄ . C_ana reduce el error en la predicción de crecimiento e_gw en un 10% con respecto a la predicción obtenida con la función objetivo de maximización de biomasa. El menor valor de e_gw encontrado es de 0.19.

En condiciones aeróbicas en cultivos tipo lote se observa que son seis matrices las que obtienen el menor promedio e_gw, para las cuales el promedio es el mismo. Estas matrices difieren en la función objetivo C₃. Lo anterior indica que incluir o no cualquier alternativa de la función objetivo C₃ no afecta significativamente el valor de e_gw. Las seis matrices tienen como función objetivo C₁ la minimización de la producción de NADH; en C₂ la minimización de consumo de NADH y NADPH; y en C₄ la maximización de la producción de biomasa. Por lo tanto la matriz C_aer, compuesta por esta combinación de compartimentos y funciones objetivo, permite obtener la mejor predicción. El mínimo valor e_gw obtenido para este tipo de condiciones experimentales es 0.1.

En condiciones anaeróbicas, la función objetivo maximización de biomasa obtuvo un error de predicción promedio de crecimiento _gw de 0.21. La matriz Cana obtuvo un _gw de 0.19. Esto implica que se logró una reducción del % en el valor de . En cuanto a la producción de etanol, la función objetivo de maximización de biomasa obtuvo un error de predicción promedio de etanol _{EX_etoh(e)} de 0.12. La matriz Cana obtuvo un _{EX_etoh(e)} de 0.03, lo que significa una reducción del 75% en el valor de _{EX_etoh(e)}. La figura 2 muestra el desempeño de la función objetivo maximización de producción de biomasa, la matriz C_ana y el comportamiento experimental en condiciones anaeróbicas. Los valores obtenidos de e_gw y e_{EX_etoh(e)} para cada condición anaeróbica son mostrados en la tabla 7.

Figura 2

Tabla 7

_gw

_gw

_gw

Figura 3

Tabla 8

Conclusiones

Combinar la maximización de producción de biomasa con la minimización de producción de NADH en el compartimento citosol de S. cerevisiae reduce el error promedio en la predicción de crecimiento en un 75% en las condiciones anaeróbicas de Nissen et al. (1997). Esta combinación también reduce en un % el promedio del error en la predicción de producción de etanol.

Si a la función objetivo encontrada en condiciones anaeróbicas se agrega la minimización de consumo de NADH y NADPH en el compartimento mitocondria de S. cerevisiae, se reduce el promedio del error en la predicción de crecimiento en un 98% en las condiciones aeróbicas tipo lote planteadas por Heyland et al. (2009). Esta nueva función objetivo reduce el promedio del error en la predicción de etanol en un 70% con respecto a la función de maximización de biomasa.

Agregar funciones objetivo de compartimentos de S. cerevisiae a la función objetivo de maximización de biomasa mejora las predicciones obtenidas por la función objetivo maximización de biomasa, propuesta en la literatura por Feist y Palsson (2010) y en la reconstrucción a escala genómica iMM904 (Mo et al., 2009), en condiciones experimentales anaeróbicas en cultivo continuo (Nissen et al., 1997) y aeróbicas tipo lote (Heyland et al., 2009).

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