http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v15n2.41268
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
Evaluación de diferentes medios de cultivo in vitro en el desarrollo de híbridos de Phalaenopsis (Orchidaceae)
Evaluation of different in vitro culture media in the development of Phalaenopsis hybrid (Orchidaceae)
Seir Antonio Salazar Mercado1, Anggy Zulay Amaya Nieto2, Fernando Barrientos Rey3
1 BSc. Grupo de Investigación Ambiente y vida. Semillero Grupo Académico de Investigaciones Agrobiotecnologícas, Universidad Francisco de Paula Santander, San José de Cúcuta, Colombia. Email: salazar663@hotmail.com.
2 Ing. Semillero Grupo Académico de Investigaciones Agrobiotecnologícas, Universidad Francisco de Paula Santander, San José de Cúcuta, Colombia.
3 Ing. Semillero Grupo Académico de Investigaciones Agrobiotecnologícas, Universidad Francisco de Paula Santander, San José de Cúcuta, Colombia.
Recibido: febrero 12 de 2013. Aprobado: noviembre 9 de 2013
Los híbridos de Phalaenopsis tienen una gran importancia económica a nivel mundial, como flor cortada y planta ornamental, debido a sus flores vistosas y a la capacidad de adaptación a diferentes condiciones ambientales. Las técnicas de cultivo in vitro resultan indispensables para mejorar la eficacia germinativa, el crecimiento y desarrollo de orquídeas con fines comerciales e investigativos. En esta investigación se determinó el medio de cultivo más apropiado para la germinación in vitro de un híbrido de Phalaenopsis. Inicialmente se evaluó la viabilidad de las semillas utilizando la prueba de tetrazolio (TZ). Las semillas se desinfectaron y se cultivaron aplicando el método de la jeringuilla. El porcentaje de viabilidad en promedio fue de 92,2 % (P≤ 0,05: Tukey HSD), con un porcentaje de germinación entre todos los medios de 95,1 % (P≤ 0,05: Tukey HSD). El medio de cultivo más eficiente para la germinación de híbridos de Phalaenopsis a las 18 semanas de cultivo fue el Murashige & Skoog (MS) suplementado con agua de coco, y jugo de piña con diferencias estadísticamente significativas (P≤ 0,05: Tukey HSD), con respecto a los demás medios de cultivo, contribuyendo de esta manera al uso de componentes orgánicos con el fin de mejorar la germinación y desarrollo de Phalaenopsis.
Palabras clave: Componente orgánico, germinación in vitro, hibrido, Phalaenopsis, viabilidad.
Abstract
The Phalaenopsis hybrids have a significant economic importance throughout the world, as ornamental flower or plant. It is because of its attractive flowers and its adaptation capacity into different environments. The different culture media in vitro are vital to improve the efficacy of germination, growing and development of the Orchids for commercial and research purposes. In this research, the most appropriated medium for in vitro propagation of Phalaenopsis hybrid was determined. At first, the seeds viability was evaluated by using tetrazolium test (TZ). The seeds were disinfected and cultivated by means of the syringe method. The viability percentage average was 92.2 % (P≤ 0.05: Tukey HSD), with a percentage of germination of 95.1 % (P≤ 0.05: Tukey HSD) in all the environments. The most efficient culture Medium for Phalaenopsis hybrid phenological development, at 16 weeks, was Murashige & Skoog (MS). Coconut water and pineapple juice were used as supplement showing statistically significant differences (P≤ 0,05: Tukey HSD), in comparison with the other culture media, contributing this way to the usage of organic components, which will be employed to improve the germination and development of the Phalaenopsis.
Key words: organic components, germination, in vitro, hybrid, Phalaenopsis, viability.
Introducción
Phalaenopsis es un género de la familia Orquidaceae, conformado por aproximadamente 66 especies nativas en todo el mundo (Chu et al., 2012), presenta un crecimiento monopodial (crecimiento vertical definido), carecen de seudobulbos, las hojas son dísticas y carnosas (Griesbach, 2002), Las flores son de diferentes tamaños y colores, que le confieren un aspecto atractivo como planta ornamental. (Chen y Lin, 2012; Lesar et al., 2012). Como resultado de extensivos trabajos de hibridación, este género representa uno de los grupos de orquídeas más apreciados por el colorido, forma y duración de sus flores como planta en maceta o flor cortada a nivel mundial (Chen et al., 2012; Niknejad et al., 2011). Algunas orquídeas del genero Phalaenopsis no son comercializadas por su belleza, sino por usos en la industria alimentaria, otras son utilizadas medicinalmente como tratamientos para la diarrea y como afrodisiaco (Leva y Rinaldi, 2012). El crecimiento en condiciones naturales es lento, debido a la dependencia de una relación simbiótica con un hongo formador de micorriza, lo que ha dificultado la multiplicación vegetativa (Murdad., et al., 2010). En cuanto a la reproducción sexual, Phalaenopsis se ha visto perjudicada por la esterilidad de algunos de sus híbridos (Chen et al., 2012; Feria et al., 2007).
La propagación natural de Phalaenopsis es difícil y demanda mucho tiempo, las técnicas de cultivo in vitro, han permitido obtener grandes volúmenes de Phalaenopsis con el fin de producir plantas a gran escala para el comercio. Sin embargo, es indispensable la utilización de medios de cultivos simples, que permitan disminuir los costos de producción de Phalaenopsis (Leva y Rinaldi, 2012). No obstante, El éxito depende del tipo de explante a utilizar (Zhao et al., 2010). Recientes estudios en protocolos de cultivos vegetales in vitro específicos para Phalaenopsis se han desarrollado de una forma satisfactoria, incluyendo los tallos con yemas axilares (Feria et al., 2007), meristemos (Arditti y Ernst, 1993), segmentos nodales (Košir et al., 2004), fragmentos de hojas, botones florales (Tokuhara y Mii, 2001) y raíces (Park et al., 2003). Asimismo estos métodos se han reportados como complicados e ineficientes (Murdad et al., 2006).
Varios medios de cultivos se han utilizado para la propagación in vitro de Phalaenopsis, el medio Vacin y Went (VW) (Vacin y Went, 1949), el medio Murashige y Skoog (MS) (Murashige y Skoog, 1962), el medio Knudson C (KC) (Knudson, 1946) y el medio Hyponex (Nishimura, 1982). Actualmente se ha mejorado la germinación de orquídeas, suplementando los medios de cultivos con componentes orgánicos (Asghar et al., 2011; Salazar y Cancino 2012; Salazar, 2012).
]]> Teniendo en cuenta la importancia desde el punto de vista económico que revisten estos híbridos de Phalaenopsis (Lesar et al., 2012), en el cultivo ex vitro se corre con el riesgo de perder su variabilidad genética y además, los tiempos de germinación y desarrollo son extensos (Niknejad et al., 2011; Murdad et al., 2010), por tal motivo esta investigación busca establecer el mejor medio de cultivo in vitro para la germinación asimbiótica de semillas de Phalaenopsis híbrida.Materiales y métodos
Material vegetal
Las cápsulas dehiscentes del hibrido de Phalaenopsis de interés comercial fueron colectadas maduras a los 5 meses en el municipio de Bochalema - Norte de Santander, Colombia. Las cápsulas se polinizaron manualmente, transfiriendo las polinias de la planta donadora (Phalaenopsis Carmela's Wild Thing; figura 1A) a la cavidad estigmática de la planta receptora (Phalaenopsis Taipei Pearl; figura 1B). Se emplearon en total cuatro plantas: dos donadoras y dos receptoras, obteniendo cuatro cápsulas. Posteriormente, fueron extraídas las semillas de su interior y se procedió a la respectiva conservación en sobres de papel kraft, se almacenaron en una caja estéril con un agente desecante (silica gel), para evitar la excesiva humedad. (Mckendrick, 2002; Vogel y Macedo, 2011).
Preparación del medio de cultivo:
El medio de cultivo basal fue el MS, utilizando las concentraciones de macro y micronutrientes al 100% (Murashige y Skoog, 1962), adicionado con 3000 mg/L de sacarosa, 700 mg/L de agar, 100 mg/L de mioinositol y 1000mg/L de carbón activado. Se emplearon cinco medios de cultivos, el medio basal MS como control, MS suplementado con jugo de piña (MS+JP), MS con agua de coco (MS+AC), MS más 0,5 mg/L de ácido indolacético (AIA) y MS con 0,5 mg/L de ácido giberélico (MS+GA3). Los medios con suplementos orgánicos (agua de coco y jugo de piña), se prepararon adicionando 200 mL/L.
Viabilidad de las semillas
Para determinar la viabilidad de las semillas se utilizó la prueba de Tetrazolio en concordancia con lo reportado por Ossenbach et al. (2007). Para lo anterior se sumergieron 100 semillas de orquídeas en la solución de CTT al 1%, durante 24 horas en la oscuridad Se realizaron cinco repeticiones, las cuales fueron evaluadas en el microscopio estereoscopio.
Para analizar el efecto de la viabilidad de semillas con respecto a los tratamientos de hipoclorito de sodio con los tiempos de inmersión (tabla 1), se utilizó la metodología descrita por Batty (2001).
]]>
Desinfección del material vegetal
Primeramente, las semillas fueron colocadas en etanol (70%) durante 45 s. Al término de dicho tiempo las semillas se lavaron con 5 mL de agua estéril (cinco veces). Finalmente, las semillas se sumergieron en de hipoclorito de sodio (NaOCI: 1%), suplementado con dos gotas de Tween 20, y se agitaron por 5 min (Batty, 2001). Seguidamente, las semillas fueron cultivas.
Siembra de las semillas
Una vez finalizado el protocolo de desinfección se retiró el filtro de tela, seguidamente, se cultivaron aproximadamente 100 semillas en agua destilada estéril, en cajas Petri que contenían 25 mL del medio de cultivo. Esta técnica se realizó en la cámara de flujo laminar, donde se procedió a sellar con papel parafilm, posteriormente fueron incubadas en el cuarto de crecimiento bajo condiciones ambientales controladas (26 ± 2°C, fotoperiodo de 16 horas luz y 8 oscuridad, con una intensidad de luz 25μmol/m por segundo, provista por luz fluorescente y 60 % de humedad relativa.
Desarrollo fenológico
El desarrollo fenológico de las semillas se evaluó cada 15 días mediante observaciones, descripciones y fotografías en cada una de las etapas de desarrollo de Phalaenopsis (tabla 2).
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental para la evaluación de las concentraciones de hipoclorito. Consistió en un diseño factorial 5x3 completamente al azar (cinco concentraciones de NaOCl y tres tiempos de inmersión), con tres repeticiones, 45 unidades experimentales.
]]> El diseño experimental para la evaluación del medio de cultivo fue de 6x5 completamente al azar (seis fases del desarrollo y cinco medios de cultivo), con cinco repeticiones con promedios de tres cajas Petri (cada una con 100 semillas), para un total de 75 unidades experimentales.Los datos fueron sometidos a análisis de varianza (Anova) y posteriormente las medias se compararon utilizando la prueba de rangos múltiples de HSD (Honestly Significant Difference) de Tukey para determinar las diferencias significativas a un nivel de P≤0.05 (Tukey, 1994).
El desarrollo fenológico se evaluó cada quince días, durante 18 semanas mediante las fases de desarrollo de orquídeas adaptadas por Vasudevan y Staden (2010). Para el análisis estadístico se utilizó el software Statgraphic Centurión® versión 16.
Resultados y discusión
Viabilidad de las semillas
La prueba de TZ (figura 2), logró determinar la viabilidad de las semillas del hibrido de Phalaenopsis (92.2%), esta técnica permitió combrobar lo descrito por Pedroza et al., (2010), donde afirma que las semillas maduras de Phalaenopsis permiten lograr un completo desarrollo morfofisiológico, el cual asegura el posterior desarrollo fenológico de las mismas. Vujanovic et al., (2000), Lauzer et al. (2007) y Padilla (2011), demostraron que la prueba de TZ no es un buen indicador de germinación, ya que no evalúa la capacidad de división celular y a su vez el desarrollo fenológico. Por otro lado, Yamazaki y Miyoshi (2006) reportaron que en cápsulas maduras de Phalaenopsis, las semillas no se tiñen fuertemente con tetrazolio, a menos que sea eliminada la cubierta de éstas, debido a las características morfológicas de la cubierta, que actúan como barrera en la difusión del TZ. Así mismo, Mweetwa et al. (2008) afirmaron, que la tinción de tetrazolio en semillas de Phalaenopsis es más opaca, debido a la fuerte estructura que recubre la semilla.
Porcentaje de viabilidad con relación a la concentración de NaOCl.
El mayor porcentaje de viabilidad de las semillas del hibrido de Phalaenopsis se encontró en el tratamiento con hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1 %, con un tiempo de inmersión de 5 minutos. Esta técnica permitió determinar el efecto perjudicial ejercido por el NaOCl a altas concentraciones sobre las semillas, mediante la prueba de rangos múltiples de HSD según Tukey (P≤0.05), se logra encontrar diferencias significativas en el tratamiento con NaOCl al 1 %, por 5 minutos de inmersión, frente a los demás tratamientos, a diferencia de los fueron manejados con concentraciones de 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0%, donde no se encontraron diferencias significativas entre ellas (tabla 3).
]]> La prueba de incidencia del NaOH en la viabilidad de las semillas, permitió demostrar lo descrito por Mweetwa et al., (2008), donde describe que la viabilidad de Phalaenopsis cae bruscamente, con tiempos de exposición largos a altas concentraciones de hipoclorito de sodio, causando un efecto negativo sobre la fisiología de las semillas, provocando la muerte del tejido embrionario y la pérdida total en la viabilidad de las semillas. Quiala et al., (2005) y Feria (2007), demostraron que el uso de diferentes concentraciones de NaOH con diferentes tiempos de exposición, permiten observar el efecto toxico que recae sobre la morfofisiología de las semillas de orquídeas.Prueba de viabilidad y germinación
La germinación en los cinco medios de cultivo fue alta, con un porcentaje promedio de 95.1% (tabla 4), donde la diferencia entre las pruebas de germinación y viabilidad fue del 2.9%, con un valor de P≤0.05, donde no presentaron diferencias significativas, hecho que permite observar la relación que existe entre el porcentaje de viabilidad y el porcentaje de germinación, lo que demuestra que la aplicación de la técnica de tetrazolio es un paso importante para la conservación y propagación in vitro de orquídeas, como lo describe Thompson et al., (2006). En efecto, Kauth et al. (2011) y Salazar (2012) afirmaron que la prueba de tetrazolio permite predecir la capacidad de germinación y de crecimiento de las plántulas de una amplia gama de especies de orquídeas. De igual manera, Vendrame et al., 2007; Hirano et al., 2011, afirmaron que la técnica de tetrazolio es una prueba que permite indicar la capacidad de germinación de las semillas de orquídeas en general y a su vez, afirman que la viabilidad de las semillas de diferentes cápsulas, varía considerablemente, y en diversas especies de orquídeas, disminuye durante el almacenamiento.
Germinación y desarrollo fenológico
Las semillas de Phalaenopsis germinaron cuando el embrión absorbió agua e incrementó su circunferencia y longitud, llegando a romper la testa "fase 2" (15 días). La germinación máxima alcanzada en los cinco medios de cultivos evaluados a las 18 semanas de crecimiento para el híbrido de Phalaenopsis, tienen un promedio de germinación del 95.1% (tabla 4), la cual dio inicio a partir de la semana 3.
Durante el desarrollo in vitro de Phalaenopsis híbrida, se observaron las diferentes etapas fenológicas, las cuales fueron muy variables en el transcurso de las 18 semanas evaluadas; a diferencia de la fase 0, (figura 3a), donde las semillas no germinadas variaron hasta la semana 3 en cada medio de cultivo.
Pierik (1990), Arditti (1993), Arditti y Gani (2000), consideran la fase 1, como la primera etapa en el proceso de germinación en las semillas de orquídeas; en esta fase se logra observar el mayor porcentaje de imbibición (figura 3B), en el medio MS control, con un porcentaje de 57.33%, presentando diferencia significativa (p≤0.05; tukey con HSD) (tabla 5, fase I), frente a los demás medios evaluados, esta fase se vio reflejada al inicio de la semana 2, donde las semillas presentaron hinchamiento pronunciado y una coloración verde pálida del embrión, ocasionado por la absorción del agua presente en cada uno de los medios. Sin embargo, las características morfológicas de impermeabilidad de la testa en las semillas de Phalaenopsis, dificulta el inicio del desarrollo de esta fase, por tal motivo, Vujanovic et al. (2000) y Ervin y Wetzel, (2002), afirman que el NaOH es un compuesto que estimula la germinación de semillas, por la erosión de la cubierta de la semilla y el aumento en la permeabilidad del oxígeno.
]]> En la fase de imbibición, el embrión logra un incremento en el tamaño y a su vez, una coloración verde acentuada, dando origen al rompimiento de la testa y al inicio de la fase de germinación (figura 3C), la cual inicia al finalizar la semana 4, donde el desarrollo se da de en forma muy equilibrada, alcanzando el mayor porcentaje de germinación en el medio MS+AC con un 67.53%, resultado que presenta diferencia significativa (p≤0.05; tukey con HSD) con el medio MS+ AIA. (tabla 5, fase II).Así mismo Thompson et al., (2006), afirmaron que el uso adecuado de las concentraciones de NaOH en la desinfección, influye directamente en la inducción a la germinación de las semillas de orquídeas, como lo alcanzado en esta investigación. Adicionalmente, una baja germinación en las semillas no se deberá atribuir al poco efecto de escarificación generado en las mismas, sino al periodo de latencia como lo afirma Flórez y Pedroza, (2006); por otro lado, Vasudevan y Staden (2010) afirma que la disponibilidad del agua en el medio de cultivo puede llegar a influir en el desarrollo óptimo de esta fase.
La formación de protocormo y de rizoidez (figura 3D y E), se desarrolló notablemente en los medios suplementados con componentes orgánicos, resultado que coincide con lo descrito por Kitsaki et al., (2004), quien afirma que el uso de aditivos orgánicos potencializa el medio de cultivo, por tal motivo, se puede establecer que los componentes orgánicos usados en el establecimiento de semillas del hibrido de Phalaenopsis, permiten que las semillas crezcan de una forma rápida y logren almacenar reservas, posibilitando una mayor sobrevivencia en invernadero.
Los tratamientos sin componentes orgánicos muestran la talla más baja en la formación de plántulas (figura 3F), esto coincide con lo descrito por Rodríguez et al. (2000), en Phaphiopedillum caudatum, donde se observaron los mejores resultados al agregar al medio de cultivo agua de coco, esto manifiesta lo dicho por Nongrum et al., (2007) y Abbas et al. (2011), quienes afirmaron que la adición de componentes orgánicos al medio de cultivo ejerce un efecto benéfico en la germinación y el desarrollo de tejidos celulares, formando plántulas de Coelogyne ovalis y Grammatophyllum scriptum. De igual manera Shina et al. (2004), obtuvieron los mayores tamaños de brotes de Vanda, al agregar 10% de agua de coco.
La germinación y desarrollo de plántulas de híbridos de Phalaenopsis, en general, presentó la mejor germinación en el medio de cultivo MS+AC, encontrando diferencias significativas, resultado que no coincide con lo descrito por (Salazar y Cancino, 2012), donde el mejor porcentaje de germinación se desarrolló en el medio de cultivo suplementado con jugo de piña para las especies de Prosthechea vespa y Sobralia klotzscheana, posiblemente debido a que todas las especies tienen diferentes necesidades nutricionales, por tal motivo, se ve la necesidad de estudiar las condiciones para cada especie como lo afirma Ruiz et al., (2008), en donde Dutra et al., (2009); Basker et al., (2010); Kauth et al., (2011), implementaron diferentes medios de cultivos para la preservación de orquídeas.
Por otra parte, Pedroza (2009), demostró que la adición de AIA (0,5 mg/L) al medio de cultivo MS promovía las fases del desarrollo de Epidendrum elongatum, así mismo, autores como Manrique et al., (2005); Coello et al., (2010) resaltan la importancia de la GA3, en la germinación y el crecimiento de las orquídeas, sin embargo cabe considerar, que a pesar de la dificultad en el análisis de su composición y la poca información en la literatura acerca de los efectos que tienen los componentes orgánicos, como el agua de coco y el jugo de piña, estos son ricos en energía, vitaminas, aminoácidos y fitohormonas (Kitsaki et al., 2004; Yam y Arditti, 2008; Yong et al., 2009). En esta investigación se reporta que la adición de estos aditivos orgánicos al medio MS mejora la eficacia de éste, y por lo tanto, permite un mayor crecimiento y desarrollo de los híbridos de Phalaenopsis.
Conclusiones
La prueba de tetrazolio permitió evidenciar la pérdida de viabilidad de las semillas de Phalaenopsis, demostrando la eficacia de este método para predecir la capacidad de germinación de esta especie de orquídea. Y a su vez, concluir que la concentración y el tiempo de inmersión, son directamente proporcionales a la disminución de la viabilidad del tejido embrionario.
El medio MS suplementado con agua de coco tuvo una mayor eficacia en la germinación y formación de plántulas en el híbrido de Phalaenopsis. Demostrando que la adición de compuestos orgánicos en los medios de cultivo in vitro es de suma importancia para obtener grandes volúmenes de material vegetal, contribuyendo de esta manera al uso de componentes orgánicos como posible sustituto de las hormonas sintéticas debido a los bajos costos de rentabilidad que presentan estos suplementos orgánicos por su fácil adquisición.
Agradecimientos
]]> A la universidad Francisco de Paula Santander por el financiamiento del proyecto FINU titulado: Evaluación de la germinación in-vitro de Phalaenopsis hibrida, (Orchidaceae); a Yuri Osorio por su asistencia técnica. A la Ingeniera Alina Sigarroa por administrar el dinero del proyecto FINU.Referencias bibliográficas
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