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<article-id pub-id-type="doi">10.15446/rev.colomb.biote.v16n1.44284</article-id>
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<article-title xml:lang="es"><![CDATA[Producción de etanol a partir de yuca en condiciones de alta concentración de sólidos (VHG)]]></article-title>
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<abstract abstract-type="short" xml:lang="en"><p><![CDATA[This research exposes the fermentative medium and initial sugar concentration effect on ethanol production in batch systems, when used glucose syrups derivatives of cassava (Manihot esculenta), as a carbon source. The experimental design was factorial and analyzes the productivity of bioethanol in four different fermentation media, two of which were supplemented with cassava flour sugared. The initial sugar concentrations tested on these substrates were 250, 300 and 350 g / L. These fermentative treatments were inoculated with a commercial ethanolic variety of S. cerevisiae at a concentration of 0.05% (w / v). The process conditions included a final volume of 150 mL, incubation at 35 ° C for 48 hours , constant stirring at 150 rpm and pH between 4.0 and 4.5. The saccharified from this cassava variety showed be excellent substrate for the bioethanol production, achieving increases of 550% in terms of volumetric productivity over the control experiment, the above, allowed us to achieve final concentrations of ethanol of 14.7% v / v, yields product / substrate of 0.5 g / g, and productivities of 2.4 g / L / h. Most interesting is that these kinetic parameters were achieved with the simplest fermentation medium evaluated, the mean was compound of saccharified as a carbon source and as a sole source of nutrition, and its initial concentration of sugars was 250g / L; the above shows the ability of these substrates for ethanol production purposes.]]></p></abstract>
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</front><body><![CDATA[  <font face="verdana" size="2">     <p><a href="http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v16n1.44284" target="_blank">http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v16n1.44284</a></p>     <p align="right"><font face="verdana" size="2"><b>ART&Iacute;CULO CORTO</b></font></p>     <p><font size="4"><b>Producci&oacute;n de etanol a partir de yuca en condiciones de alta concentraci&oacute;n de s&oacute;lidos (VHG). </b></font></p>     <p><font size="3">Ethanol production from cassava using very high gravity conditions (VHG)</font></p>     <p><font size="3">T&iacute;tulo corto: Producci&oacute;n de etanol a partir de harina de yuca var. Copiblanca</font></p>     <p><i>Mabel Betariz Esquivia Mercado<sup>1</sup>, Hader Ivan Casta&ntilde;o Pel&aacute;ez<sup>2</sup>, Luc&iacute;a Atehortua Garc&eacute;s<sup>3</sup>, Alejandro Acosta C&aacute;rdenas<sup>4</sup> y Carlos Eduardo Mej&iacute;a G&oacute;mez<sup>5</sup>.</i></p>    <p> <sup>1</sup> M.Sc. Grupo de Biotrasformaci&oacute;n. Universidad de Antioquia. Calle 67 No. 53-108/Bloque 5 Laboratorio 226. Medell&iacute;n, Colombia. <a href="mailto:mbem19@ gmail.com">mbem19@ gmail.com</a>    <br>  <sup>2</sup> M.Sc. Facultad de Administraci&oacute;n. Polit&eacute;cnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid. Carrera 48 No. 7-151. Medell&iacute;n, Colombia. <a href="mailto:hcastano954@gmail.com">hcastano954@gmail.com</a>    <br>  <sup>3</sup> PhD. Grupo de biotecnolog&iacute;a Vegetal. Universidad de Antioquia. Calle 70 No. 52 - 21, A.A. 1226. Medell&iacute;n, Colombia. <a href="mailto:latehor@gmail.com">latehor@gmail.com</a>    ]]></body>
<body><![CDATA[<br>  <sup>4</sup> M.Sc. Grupo de Biotrasformaci&oacute;n. Universidad de Antioquia. Calle 67 No. 53-108/Bloque 5 Laboratorio 226. Medell&iacute;n, Colombia. <a href="mailto:aleacosta45@gmail.com">aleacosta45@gmail.com</a>    <br>  <sup>5</sup> M.Sc. Grupo de Biotrasformaci&oacute;n. Universidad de Antioquia. Calle 67 No. 53-108/Bloque 5 Laboratorio 226. Medell&iacute;n, Colombia. <a href="mailto:mcemg@udea.edu.co">mcemg@udea.edu.co</a>    <br>  </p>     <p>Recibido: octubre 5 de 2013   Aprobado: abril 25 de 2014</p> <hr>    <p><b>Resumen</b></p>     <p>La investigaci&oacute;n realizada eval&uacute;a el efecto del medio fermentativo y la concentraci&oacute;n de az&uacute;cares iniciales sobre la producci&oacute;n de etanol en sistemas batch, cuando se emplean sacarificados de harina de yuca (<i>Manihot esculenta</i>), como fuente de carbono. El dise&ntilde;o experimental ejecutado fue de tipo bifactorial de efectos fijos y analiza la productividad de bioetanol en cuatro medios fermentativos diferentes, dos de los cuales se suplementaron con sacarificados de harina de yuca variedad Copiblanca. Las concentraciones de az&uacute;cares iniciales evaluadas en estos sustratos fueron de 250, 300 y 350 g/L. Estos tratamientos fermentativos fueron inoculados con una variedad etanolog&eacute;nica comercial de <i>S. cerevisiae</i> a una concentraci&oacute;n de 0.05% (p/v). Las condiciones de proceso incluyeron un volumen final de 150 mL, una incubaci&oacute;n a 35&deg;C por 48 horas, agitaci&oacute;n constante de 150 rpm y pH entre 4.0 y 4.5. Los sacarificados provenientes de esta variedad de yuca usados como fuente de carbono, mostraron ser excelentes sustratos para la obtenci&oacute;n de etanol. Se evidenciaron aumentos de m&aacute;s del 500% en t&eacute;rminos de productividad volum&eacute;trica con respecto al control experimental y se alcanzaron concentraciones finales de etanol del 14.7%v/v, asociadas a rendimientos producto/sustrato de 0,48 g/g y productividades de 2,4 g/L/h. Estos par&aacute;metros cin&eacute;ticos fueron logrados con el medio fermentativo m&aacute;s simple evaluado, medio compuesto por los sacarificados como fuente de carbono y como &uacute;nica fuente nutricional, bajo concentraciones de az&uacute;cares iniciales de 250g/L; lo que demuestra la aptitud de estos sustratos para efectos de producci&oacute;n etan&oacute;lica. </p>     <p><b>Palabras clave</b>: Bioetanol, sacarificados de harina de yuca, fermentaciones con alto contenido de s&oacute;lidos.</p>     <p><b>Abstract</b></p>     <p>This research exposes the fermentative medium and initial sugar concentration effect on ethanol production in batch systems, when used glucose syrups derivatives of cassava (<i>Manihot esculenta</i>), as a carbon source. The experimental design was factorial and analyzes the productivity of bioethanol in four different fermentation media, two of which were supplemented with cassava flour sugared. The initial sugar concentrations tested on these substrates were 250, 300 and 350 g / L. These fermentative treatments were inoculated with a commercial ethanolic variety of <i>S. cerevisiae</i> at a concentration of 0.05% (w / v). The process conditions included a final volume of 150 mL, incubation at 35 &deg; C for 48 hours , constant stirring at 150 rpm and pH between 4.0 and 4.5. The saccharified from this cassava variety showed be excellent substrate for the bioethanol production, achieving increases of 550% in terms of volumetric productivity over the control experiment, the above, allowed us to achieve final concentrations of ethanol of 14.7% v / v, yields product / substrate of 0.5 g / g, and productivities of 2.4 g / L / h. Most interesting is that these kinetic parameters were achieved with the simplest fermentation medium evaluated, the mean was compound of  saccharified as a carbon source and as a sole source of nutrition, and its initial concentration of sugars was 250g / L; the above  shows the ability of these substrates for ethanol production purposes.</p>     <p><b>Key words</b>: Bioethanol, cassava flour saccharified, very high-gravity fermentations.</p> <hr>    ]]></body>
<body><![CDATA[<p><b>Introducci&oacute;n</b></p>     <p>La avanzada crisis ambiental y la futura crisis energ&eacute;tica y econ&oacute;mica, pueden ser enfrentadas con la producci&oacute;n de biocombustibles, la cual ser&iacute;a exitosa si se establecen tempranamente pol&iacute;ticas que regulen su alcance y que protejan aspectos tan importantes como la seguridad alimentaria de las comunidades involucradas en la explotaci&oacute;n de los recursos renovables destinados para tal prop&oacute;sito.</p>     <p>Debe tenerse en cuenta que no son solo ambientales los beneficios de los combustibles ecol&oacute;gicos tales como el biodiesel y el bioetanol, ya que alrededor de estas interesantes estrategias de energ&iacute;a alternativa, se tejen importantes unidades de negocios, que promueven el desarrollo rural e impactan positivamente el empleo en el campo; muestra de ello es Brasil, pa&iacute;s que se vio obligado con la crisis de los precios del petr&oacute;leo en la d&eacute;cada de los setenta a cambiar las fuentes convencionales de abastecimiento energ&eacute;tico, creando toda una industria del etanol que en el a&ntilde;o 2000 alcanz&oacute; los 700.000 empleos a partir de uso de biomasa procedente de la ca&ntilde;a, Men&eacute;ndez (2001). Experiencias como estas son seguidas por pa&iacute;ses que le han apostado a la producci&oacute;n de alcohol carburante a partir de biomasa vegetal, tales son los casos de EEUU con los cultivos de ma&iacute;z, India con la ca&ntilde;a de az&uacute;car y Tailandia con biomasa de yuca, Lan <i>et al.</i> (2007).</p>     <p>Son diversas las estrategias fermentativas asociadas a la producci&oacute;n de etanol a partir de biomasa vegetal; sin embargo, una de las mejor calificadas por sus interesantes ahorros energ&eacute;ticos e h&iacute;dricos, eficiente autocontrol microbiano y altas concentraciones finales de etanol, ha sido el modelo fermentativo bajo condiciones de alto contenido de s&oacute;lidos; modelo caracterizado por fermentaciones a contracciones superiores de 270 g/L Bai <i>et al.</i> (2004). La aplicaci&oacute;n de este modelo ha ofrecido resultados satisfactorios en materia de producci&oacute;n etan&oacute;lica, logrando porcentajes finales de etanol y rendimientos producto/sustrato que oscilan entre 12 a 18%v/v y 0.45 a 0.49 g/g respectivamente, a partir de sustratos amil&aacute;ceos procedentes de trigo son regularmente suplementados con fuentes de nitr&oacute;geno y micronutientes espec&iacute;ficos, Jones <i>et al.</i> (1994). Las optimizaciones de este tipo de medios de cultivo han sido evaluadas, a fin de disminuir los tiempos de fermentaci&oacute;n y los costos de producci&oacute;n por concepto de la suplementaci&oacute;n nutricional, punto en el que el sorgo dulce ha ofrecido una interesante alternativa; recientes reportes revelan que solo con la suplementaci&oacute;n de la fuente de nitr&oacute;geno, este sustrato ofrece  porcentajes de etanol pr&oacute;ximos al 15%v/v y rendimientos producto/sustrato entre 0.49 y 0.5 g/g, bajo cin&eacute;ticas de fermentaci&oacute;n cercanas a las 56 horas, (Nuapeng <i>et al.</i>, 2011; Chan <i>et al.</i>, 2013). Parte del &eacute;xito de estas estrategias fermentativas depende del tipo de cultivo amil&aacute;ceo empleado y su contenido propio de nutrientes, variable que juega un papel determinante en la viabilidad t&eacute;cnico-econ&oacute;mica de los modelos evaluados y que definen su adaptaci&oacute;n a las realidades del sector industrial alcoholero.</p>     <p>La industria del etanol en Am&eacute;rica Latina es promisoria dada la biodiversidad de sus cultivos amil&aacute;ceos y la riqueza y extensi&oacute;n de sus tierras disponibles para uso agr&iacute;cola. Colombia es uno de los pa&iacute;ses de mayor productividad en materias primas de enorme peso en la producci&oacute;n futura de biocombustibles con cultivos que incluyen ca&ntilde;a de az&uacute;car, sorgo dulce, remolacha, ma&iacute;z, cebada y yuca, Bochno (2008). Este &uacute;ltimo cultivo ha sido propuesto por el Ministerio de Minas y Energ&iacute;a, despu&eacute;s de la ca&ntilde;a azucarera, para la obtenci&oacute;n de bioetanol de primera generaci&oacute;n; decisi&oacute;n que no es gratuita, ya que tiene la capacidad de tolerar la sequ&iacute;a y los suelos degradados, con lo que ha asegurado su importancia econ&oacute;mica a nivel mundial. La yuca se adapta a diferentes condiciones agro ecol&oacute;gicas, clim&aacute;ticas y su cultivo requiere de poca tecnolog&iacute;a, adem&aacute;s presenta bajo costo de producci&oacute;n, poca mano de obra requerida, alta estabilidad de sus rendimientos y un largo per&iacute;odo de cosecha. Soportado en estas ventajas agroindustriales, el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural en  2001 inicia el proyecto &quot;&quot;Alianzas Productivas para la Paz&quot;, bajo el cual se estudiaron 40 variedades yuca, de estas se seleccionaron 12 exponentes a abril de 2003 y son las que actualmente se tienen sembradas en m&aacute;s de 110 hect&aacute;reas en Mutat&aacute; - Urab&aacute; Antioque&ntilde;o. Entre las variedades seleccionadas como clones de altos rendimientos se cuentan Copiblanca, Copiroja, la Ver&oacute;nica y Ginn&eacute;s con las que se puede lograr hasta 25 t/ha, MADR (2001).</p>     <p>En resonancia a este llamado socio-econ&oacute;mico y medioambiental, y con el fin de contribuir al fortalecimiento de la cadena productiva de la yuca, se desarrolla el presente estudio aplicado cuyo prop&oacute;sito es evaluar la aptitud de los sacarificados de harina de yuca variedad Copiblanca (clon seleccionado como de alto rendimiento de acuerdo a los &uacute;ltimos estudios del CIAT en el Urab&aacute; Antioque&ntilde;o), para efectos de su bio-conversi&oacute;n a etanol con una cepa comercial de demostrada capacidad etanolog&eacute;nica, cuando se emplean condiciones de alto contenido de s&oacute;lidos.</p>     <p><b>Materiales y m&eacute;todos</b></p>     <p><b>Microorganismos y condiciones de cultivo</b></p>     <p>Los microorganismos empleados fueron dos variedades nativas de <i>S. cerevisiae</i> obtenidas por estudios de bioprospecci&oacute;n microbiana para estos prop&oacute;sitos y facilitadas por el Laboratorio de Biotrasformaci&oacute;n de la Universidad de Antioquia, y una variedad etanolog&eacute;nica comercial de <i>Saccharomyces cerevisiae</i> (cuya referencia no es reportada en este trabajo). Las condiciones de manejo incluyeron su mantenimiento bajo temperaturas de refrigeraci&oacute;n en placas de agar PDA (Papa Dextrosa Agar) y su respectiva reactivaci&oacute;n en caldos YM (Yeast Medium), para su posterior inoculaci&oacute;n en los medios alternativos evaluados.</p>     <p><b>Selecci&oacute;n de la cepa etanolog&eacute;nica</b></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p>La selecci&oacute;n de la cepa de <i>S. cerevisiae</i> incluy&oacute; criterios de etanol-tolerancia y producci&oacute;n etan&oacute;lica en medio est&aacute;ndar modificado YM (Yeast Medium). Se manej&oacute; la misma composici&oacute;n nutricional del medio base, s&oacute;lo que la fuente de carbono fue reemplazada en origen y concentraci&oacute;n por sacarificados de harina de yuca variedad Copiblanca a 100g/L en t&eacute;rminos de az&uacute;cares fermentables, respectivamente, a fin de generar un reto osmolar primario con la fuente de carbono de inter&eacute;s para el presente estudio. Las condiciones de cultivo incluyeron el uso de Erlenmeyers de 250 mL, en donde los vol&uacute;menes finales fueron de 150 mL mantenidos en condiciones de anaerobiosis, se manej&oacute; una agitaci&oacute;n de 150 rpm y una temperatura de 35 &#186;C. El pH del proceso fermentativo oscil&oacute; entre 4.0 y 4.5 y el in&oacute;culo de levadura utilizado fue del 0.05% (p/v). El tiempo de cultivo evaluado fue de 24 horas con muestreo &uacute;nico a final de proceso.</p>     <p><b>Preparaci&oacute;n de hidrolizados de harina de yuca variedad Copiblanca </b></p>     <p>Se realizaron suspensiones de harina de yuca variedad Copiblanca al 40% p/v, a las cuales se les ajust&oacute; el pH a 5.5 previa adici&oacute;n de Ca<sup>2+</sup> a 30 ppm. Las suspensiones fueron licuadas durante 2.5 horas a una temperatura de 83&#186;C, empleando para tal fin una amilasa comercial Termamyl&reg; 120 L a una diluci&oacute;n de 0.5 mL/L. Posteriormente el material licuado fue llevado a un pH de 4.5 por adici&oacute;n de NaOH y sometido a sacarificaci&oacute;n durante 6 horas a 60&#186;C, la enzima utilizada en este proceso fue una amiloglucosidasa comercial AMG&reg; 300L a una concentraci&oacute;n de 1.5 mL/L. Ambas enzimas con actividades de 120 KNU/g y 300 AGU/ml respectivamente, son ofrecidas por Novozymes a trav&eacute;s de Coldanzimas Ltda. en Colombia. Los sacarificados obtenidos fueron objeto de an&aacute;lisis bromatol&oacute;gico.</p>     <p><b>Medios de fermentaci&oacute;n</b></p>     <p>Se evaluaron dos medios de fermentaci&oacute;n, cada uno de los cuales cont&oacute; con su respectivo control; los medios estudiados fueron: <i>Sacarificado de harina de yuca variedad Copiblanca</i> (MS), el cual fue obtenido por la licuefacci&oacute;n y posterior sacarificaci&oacute;n de la harina de yuca, siendo el sacarificado obtenido el &uacute;nico nutriente empleado en este medio. <i>Medio Formulado</i> (MF), cuya composici&oacute;n fue obtenida por balance estequiom&eacute;trico empleando para ello la constituci&oacute;n bioqu&iacute;mica de la levadura. En este balance se consider&oacute; el nitr&oacute;geno, potasio y magnesio propio de las materias primas empleadas. La fuente de carbono fue suplementada a partir de los sacarificados de harina de yuca; las fuentes de nitr&oacute;geno y micronutrientes fueron suplementadas por sales de uso convencional en la industria alcoholera (ver <a href="#t1">tabla 1</a>).</p>     <p align="center"><a name="t1"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20t1.jpg"></a></p>     <p>Los controles manejados hacen referencia al <i>Control del Sacarificado</i> (CS), que emplea como fuente de carbono y &uacute;nico constituyente glucosa anhidra y al <i>Control del Medio Formulado</i> (CF), este present&oacute; la misma composici&oacute;n que el medio obtenido por formulaci&oacute;n (MF), sin embargo la fuente de carbono fue suplementada por glucosa anhidra.</p>     <p>Los niveles de concentraci&oacute;n de az&uacute;cares iniciales (CAI) objeto de evaluaci&oacute;n fueron: 350, 300 y 250 g/L en t&eacute;rminos de glucosa, tanto para los medios suplementados con sacarificado como para aquellos que se trabajaron con glucosa anhidra.</p>     <p><b>Condiciones de fermentaci&oacute;n</b></p>     <p>Las fermentaciones fueron llevadas a cabo en sistemas discontinuos para lo cual se hizo uso de Erlenmeyers de 250 mL, en donde los vol&uacute;menes de fermentaci&oacute;n fueron de 150 mL mantenidos en condiciones de anaerobiosis, se manej&oacute; una agitaci&oacute;n de 150 rpm y una temperatura de 35&#186;C. El pH del proceso fermentativo oscil&oacute; entre 4.0 y 4.5 y el in&oacute;culo de levadura utilizado fue del 0.05% (p/v). Las cin&eacute;ticas de fermentaci&oacute;n se evaluaron durante 48 horas con muestreos cada 8 horas. </p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p><b>Muestreo y an&aacute;lisis de muestras</b></p>     <p>Los muestreos se realizaron por extracci&oacute;n de 5mL del fermentado manteniendo las condiciones de anaerobiosis; del volumen extra&iacute;do 1mL fue usado para cuantificaci&oacute;n de biomasa por peso seco, el material restante fue sometido a centrifugaci&oacute;n a 4000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante obtenido fue empleado para determinaci&oacute;n de az&uacute;cares reductores por DNS y para an&aacute;lisis de glucosa por GOD-PAD; la cuantificaci&oacute;n de etanol, fue realizada por HPLC empleando un cromat&oacute;grafo Agillent 1200 y  una columna BioRad Aminex HPX-87H (300x 7.8 mm), la fase m&oacute;vil manejada fue una soluci&oacute;n de 0.012 N de &aacute;cido sulf&uacute;rico con un flujo de 0.5 mL/min y una temperatura de 65&deg;C , para las lecturas fue utilizado un detector de &iacute;ndice de refracci&oacute;n. Los estudios de viabilidad se apoyaron en la t&eacute;cnica de azul de trip&aacute;n. Las c&eacute;lulas con capacidad proliferativa se cuantificaron por siembra en PCA con el consecuente c&aacute;lculo de UFC/mL.</p>     <p>Los sacarificados fueron sometidos a an&aacute;lisis de prote&iacute;nas por el m&eacute;todo 968.05 de la  AOAC, la determinaci&oacute;n de cenizas solubles fue realizada por el m&eacute;todo 923.03 de la AOAC, la cuantificaci&oacute;n de la fibra soluble se realiz&oacute; por el m&eacute;todo 31.012 de la AOAC. La determinaci&oacute;n de oligosac&aacute;ridos desde DP2 a DP10 (cadenas de glucosa de 2 unidades hasta 10 unidades), fue realizada por HPLC con una columna BioRad Aminex HPX-87P (300x 7.8 mm), la fase m&oacute;vil fue agua MilliQ desgasificada con un flujo de 0.5 mL/min y una temperatura de 85&deg;C, las lecturas se hicieron en un detector de &iacute;ndice de refracci&oacute;n.</p>     <p>En las harinas, la determinaci&oacute;n de almid&oacute;n post-hidr&oacute;lisis &aacute;cida se realiz&oacute; por el m&eacute;todo 906.03 de la AOAC. Los an&aacute;lisis de grasa y humedad se realizaron por los m&eacute;todos 925.45 y 920.39 referidos en la AOAC, respectivamente.</p>     <p><b>Dise&ntilde;o experimental y an&aacute;lisis estad&iacute;stico</b></p>     <p>El dise&ntilde;o experimental utilizado es de tipo bifactorial de efectos fijos, cuyos factores fueron la concentraci&oacute;n de az&uacute;cares inicial (CAI) y el tipo de medio de fermentaci&oacute;n, los cuales fueron evaluados a 3 y 4 niveles respectivamente.</p>     <p>Las variables de respuesta analizadas fueron rendimiento etan&oacute;lico y productividad volum&eacute;trica de etanol, v&iacute;a An&aacute;lisis de Varianza, para lo que se emple&oacute; el paquete estad&iacute;stico Statgraphics plus v 5.1.</p>     <p><b>Resultados y discusi&oacute;n</b></p>     <p><b>Cepa etanolog&eacute;nica seleccionada</b></p>     <p>La viabilidad post-fermentaci&oacute;n fue considerada como el indicador de tolerancia al etanol, el cual es bioqu&iacute;micamente mas t&oacute;xico que el adicionado al medio de cultivo, esto debido al paso trans-membranal obligatorio, propio de los procesos de excreci&oacute;n de este producto metab&oacute;lico,  Bai <i>et al.</i> (2008).</p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p>La producci&oacute;n etan&oacute;lica fue medida en t&eacute;rminos del rendimiento Yp/s (g etanol/g glucosa), obtenido en fermentaciones de 24 horas bajo concentraciones de az&uacute;cares iniciales de100g/L. </p>     <p>Los resultados mostraron que la cepa de mejor desempe&ntilde;o etan&oacute;lico y mayor etanol-tolerancia fue la variedad comercial de <i>Saccharomyces cerevisiae</i>, con valores de rendimiento y viabilidad post-fermentaci&oacute;n de 0.5g/g y 88% respectivamente. Los datos de esta evaluaci&oacute;n comparativa se muestran en la <a href="#t2">tabla 2</a>.</p>     <p align="center"><a name="t2"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20t2.jpg"></a></p>     <p><b>Sacarificado de harina de yuca variedad Copiblanca obtenido</b></p>     <p>La harina de yuca variedad Copiblanca llevada hasta procesos de sacarificaci&oacute;n, permiti&oacute; la obtenci&oacute;n de jarabes de glucosa cuya composici&oacute;n se muestra en la <a href="#t3">tabla 3</a>. El sustrato bio-convertible a etanol presente en las harinas de yuca var. Copiblanca, corresponde a su fracci&oacute;n de almid&oacute;n, la cual fue valorada en un 78.7% p/p base seca. El contenido de humedad fue del 13.6%, prote&iacute;na del 4.4%, fibra 4.1%, cenizas del 1,9% e insolubles del 6.8 %, base h&uacute;meda. No se encontraron az&uacute;cares libres en la harina de yuca empleada. </p>     <p align="center"><a name="t3"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20t3.jpg"></a></p>     <p>La conversi&oacute;n enzim&aacute;tica de la fracci&oacute;n de almidones presentes en la harina de yuca a az&uacute;cares fermentables por la levadura, corresponde al 97%; el 3% restante se hall&oacute; en forma de az&uacute;cares reductores con cadenas iguales o superiores a 4 unidades de glucosa (Dp4 a Dp10). </p>     <p>Los sacarificados procedentes de la harina de yuca variedad Copiblanca sometida a procesos de hidr&oacute;lisis enzim&aacute;tica, presentaron en materia de az&uacute;cares fermentables, solo mon&oacute;meros (glucosas), ya que hubo ausencia de maltosas y maltotriosas, siendo el siguiente oligosac&aacute;rido de menor tama&ntilde;o presente en los sacarificados obtenidos, las maltotetrosas cuya estructura no es compatible para su bioasimilaci&oacute;n por <i>S. cerevisiae</i>, Zhu <i>et al.</i> (2005), por esta raz&oacute;n la base de c&aacute;lculo para los rendimientos producto/sustrato se redujo solo a la glucosa como &uacute;nico az&uacute;car presente en nuestros sacarificados te&oacute;ricamente fermentable por la levadura.</p>     <p>Por cada unidad de glucosa, se obtienen 2 unidades de etanol, por lo que se afirma que te&oacute;ricamente por cada 180 gramos de glucosa se generan 92 gramos de etanol, resumi&eacute;ndose lo anterior en un rendimiento esperado del 0.51 g/g como consecuencia de la estequiometria propia de esta biorreacci&oacute;n. Por lo que los hallazgos anteriores permiten afirmar que por cada gramo de harina de yuca variedad Copiblanca, se obtienen 0.43 gramos de etanol.</p>     <p><b>Efectos del medio de cultivo y la concentraci&oacute;n de az&uacute;cares iniciales sobre la producci&oacute;n de etanol</b></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p>La generaci&oacute;n de etanol a partir de sacarificados de harina de yuca presenta resultados asociados a amplios rangos de producci&oacute;n, en donde se hacen claros los efectos de la concentraci&oacute;n de az&uacute;cares iniciales, as&iacute; como el tipo de medio de fermentaci&oacute;n empleado (ver <a href="#f1">figura 1</a>). </p>     <p align="center"><a name="f1"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20f1.jpg"></a></p>     <p>Particularmente, el uso de los sacarificados de harina de yuca como fuente de carbono y &uacute;nica fuente nutricional (MS), muestra un impacto positivo en la producci&oacute;n de etanol, debido a que no presenta efectos inhibitorios sobre la viabilidad celular, (aspecto de vital importancia en la industria de etanol, que regularmente emplea el re-uso de la biomasa de levadura para efectos de nuevas fermentaciones) y en la productividad etan&oacute;lica.</p>     <p>Un indicador indirecto de la inhibici&oacute;n metab&oacute;lica de la levadura, es el grado de asimilaci&oacute;n de la fuente de carbono y su consecuente desviaci&oacute;n hacia etanol y/o biomasa, par&aacute;metro medido en t&eacute;rminos de glucosa residual; para el caso, a mayor glucosa residual, menor grado de asimilaci&oacute;n, lo que revelar&iacute;a una mayor inhibici&oacute;n microbiana. Este par&aacute;metro se muestra altamente sensible dependiendo del tipo de medio fermentativo empleado y la concentraci&oacute;n de az&uacute;cares iniciales evaluada (ver <a href="#t4">tablas 4</a>, <a href="#t5">5</a> ,<a href="#t6">6</a> y <a href="#t7">7</a>).</p>     <p align="center"><a name="t4"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20t4.jpg"></a></p>     <p align="center"><a name="t5"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20t5.jpg"></a></p>     <p align="center"><a name="t6"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20t6.jpg"></a></p>     <p align="center"><a name="t7"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20t7.jpg"></a></p>     <p>La <a href="#f2">figura 2</a> permite identificar el medio sacarificado  con una CAI de 250 g/L (MS 250), como el medio m&aacute;s favorable para la producci&oacute;n de etanol y expone una comparaci&oacute;n de los rendimientos para cada medio de fermentaci&oacute;n empleado. La producci&oacute;n etan&oacute;lica medida en t&eacute;rminos de concentraci&oacute;n final de producto resulta ser interesante cuando se trabaja como medio de fermentaci&oacute;n el sacarificado de harina de yuca sin suplementar (MS), alcanzando porcentajes del 14.7% v/v. Este valor se encuentra en el l&iacute;mite superior de lo convencionalmente esperado, dado que las producciones etan&oacute;licas en sistemas batch oscilan  entre 3.2 a 12.7%v/v, S&aacute;nchez <i>et al.</i> (2005).</p>     <p align="center"><a name="f2"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20f2.jpg"></a></p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p>Productividades de 2.42 g/Lh, asociadas a concentraciones de etanol de 14.7%v/v, son experimentadas con los sacarificados de harina de yuca variedad Copiblanca sin ning&uacute;n tipo de adici&oacute;n de sales o enzimas reductoras de viscosidad. La composici&oacute;n qu&iacute;mica del sustrato es suficiente para soportar la producci&oacute;n de etanol, ya que estos resultados se obtuvieron en el medio sacarificado. Lo anterior, puede deberse a que estos sacarificados presentan otros componentes que incluyen derivados proteicos, cenizas y sales, los cuales contribuyen al adecuado desarrollo de la levadura en estado de anaerobiosis, facilitando el curso de la v&iacute;a metab&oacute;lica fermentativa (ver <a href="#t3">tabla 3</a>). El uso de otro tipo de harinas, m&aacute;s que del componente amil&aacute;ceo de manera independiente, ha mostrado resultados interesantes. Procesos de sacarificaci&oacute;n fermentaci&oacute;n simult&aacute;nea (SSF) de masas de papa con 304 g/l de carbohidratos disueltos, uso de enzimas reductoras de viscosidad y suplementaci&oacute;n del medio con sales, alcanzaron concentraciones de etanol de 16.61 %v/v y rendimientos de 89.7%, Srichuwong <i>et al.</i> (2009).</p>     <p>Por otro lado, Lim <i>et al.</i>, en 2013 alcanzaron concentraciones de etanol de 14.92% v/v, fermentando masas de papa en condiciones de alta concentraci&oacute;n de s&oacute;lidos (28% p/v). En este estudio se usaron tambi&eacute;n enzimas reductoras de viscosidad y se suplement&oacute; el medio con sulfato de amonio. Los resultados fueron similares a los encontrados en este proyecto. Resultados obtenidos con otros sustratos como la patata en condiciones de alta concentraci&oacute;n de s&oacute;lidos, tambi&eacute;n son correspondientes a nuestros hallazgos; Cao <i>et al.</i>, en 2011 manejaron condiciones de proceso SSF con concentraciones de carbohidratos de 284 g/l, alcanzando concentraciones de 15.5% v/v y rendimientos de etanol del 87.8%. Mejores resultados fueron los obtenidos por Zhang <i>et al.</i>, en 2010, utilizando xilanasa para reducir la viscosidad del medio; en este caso la concentraci&oacute;n final de etanol obtenida fue del 17% v/v, a partir de medios con 300 g/l de carbohidratos.</p>     <p>Otras experiencias con harina de yuca incluyen las reportadas por Yingling, <i>et al.</i>, en 2011, que alcanzaron concentraciones de 18.46% p/p (22 %v/v), fermentando masas de yuca en condiciones SSF, concentraciones muy superiores a las alcanzadas en este proyecto; mostrando las ventajas de los estudios de optimizaci&oacute;n multiobjetivo en los procesos fermentativos. Este hecho pone de manifiesto la necesidad de incorporar t&eacute;cnicas de optimizaci&oacute;n a nuestros resultados y mejorar los rendimientos y concentraciones finales de etanol, adem&aacute;s de explorar la posibilidad de evaluar la estrategia de proceso de sacarificaci&oacute;n y fermentaci&oacute;n simult&aacute;nea.</p>     <p>Sin embargo, se observa que los sacarificados de harina de yuca var. Copiblanca suplementados con sales de acuerdo a formulaci&oacute;n estequiom&eacute;trica (MF) no favorecen la producci&oacute;n etan&oacute;lica, aunque debe tenerse en cuenta que las concentraciones de az&uacute;cares y s&oacute;lidos disueltos manejadas en la experimentaci&oacute;n fueron altas, lo que se traduce en fuertes osmolaridades dentro de los medios fermentativos, las cuales aumentan cuando la fuente de carbono es suplementada con sales de convencional uso en fermentaci&oacute;n (adici&oacute;n de sales a los sacarificados de harina de yuca). Este aumento de osmolaridad puede superar la tolerancia de la levadura frente a esta variable, lo que explicar&iacute;a el comportamiento de los resultados obtenidos. Lo anterior indica que los modelos de suplementaci&oacute;n deber&iacute;an manejar fuentes complementarias de alto valor nutricional espec&iacute;fico en materia de nitr&oacute;geno y micronutrientes y que a su vez aporten la menor osmolaridad posible; tal es el caso de la suplementaci&oacute;n con matrices biol&oacute;gicas tipo extracto de levadura en bajos niveles y que ofrecen un ajuste nutricional adecuado para efectos de la producci&oacute;n de bioetanol y el incremento de sus par&aacute;metros cin&eacute;ticos, Nuapeng <i>et al.</i> (2010); sin embargo, este tipo de fuentes suplementarias est&aacute;n asociadas a altos costos, punto que debe ser analizado para valorar la viabilidad t&eacute;cnica de su aplicaci&oacute;n a escala industrial.</p>     <p>Con un p-valor de 0.000, el medio fermentativo confirma un efecto estad&iacute;sticamente significativo sobre la productividad de etanol, la anterior afirmaci&oacute;n  e emite con un  95,0% de confianza. Esto es totalmente coherente con lo observado en la <a href="#f2">figura 2</a>, en donde es claro el positivo impacto de los sacarificados de harina de yuca sin suplementar (MS), sobre los par&aacute;metros cin&eacute;ticos de la fermentaci&oacute;n etan&oacute;lica (ver <a href="#f3">figura 3</a>).</p>     <p align="center"><a name="f3"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20f3.jpg"></a></p>     <p>Por otro lado la concentraci&oacute;n de az&uacute;cares iniciales (CAI), evidencia el favorecimiento pr&aacute;ctico de la producci&oacute;n etan&oacute;lica conforme baja su nivel; este comportamiento puede explicarse dado que al disminuir la concentraci&oacute;n de az&uacute;cares iniciales disminuye el efecto inhibitorio por sustrato generado por los az&uacute;cares presentes en los hidrolizados de harina de yuca. Lo anterior confirma que las mejores condiciones para la producci&oacute;n de etanol incluyen el medio sacarificado sin suplementar (MS), cuando se trabaja con concentraciones iniciales de az&uacute;cares de 250g/L (ver <a href="#f4">figura 4</a>). </p>     <p align="center"><a name="f4"><img src="img/revistas/biote/v16n1/v16n1a20f4.jpg"></a></p>     <p><b>Conclusiones</b></p>     <p>Los sacarificados de harina de yuca como fuente &uacute;nica nutricional mostraron ser un interesante sustrato, ya que la producci&oacute;n de etanol bajo su uso fue a&uacute;n mayor que cuando se emple&oacute; suplementaci&oacute;n con sales fermentativas y glucosa anhidra, esta &uacute;ltima es de f&aacute;cil consumo por la levadura al tratarse de un mon&oacute;mero y es considerada como la fuente de carbono est&aacute;ndar para este tipo de biorreacciones, Monsalve <i>et al.</i> (2006); logr&aacute;ndose aumentos de  m&aacute;s del 500% en t&eacute;rminos de productividad volum&eacute;trica con respecto a este control.</p>     ]]></body>
<body><![CDATA[<p>El uso de los hidrolizados de harina de yuca sin suplementar (MS), como medio alternativo para la fermentaci&oacute;n etan&oacute;lica demostr&oacute; favorecer en alto grado los rendimientos y productividades de etanol, los cuales oscilaron entre 0.48-0.30 g/g y 2.4-1.9 g/Lh, respectivamente, llevando estos par&aacute;metros a los l&iacute;mites superiores de lo reportado por la literatura para procesos batch. Estos niveles se obtienen en sustratos amil&aacute;ceos sin suplementar, es decir, con el medio m&aacute;s simple de los evaluados en este trabajo experimental (MS).</p>     <p>Los hallazgos del estudio realizado evidencian la aptitud de los sacarificados de harinas de yuca como medios fermentativos interesantes para la producci&oacute;n de bioetanol  a trav&eacute;s de  variedades comerciales de <i>S. cerevisiae</i>.</p>     <p><b>Agradecimientos</b></p>     <p>El presente trabajo fue posible gracias a la colaboraci&oacute;n t&eacute;cnica del Grupo de Biotransformaci&oacute;n de la Universidad de Antioquia y el Grupo de Biotecnolog&iacute;a de la Universidad de Antioquia. Los autores tambi&eacute;n expresan su agradecimiento a FUNDAUNIBAN, la Secretaria de Agricultura de Antioquia y el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR) por la financiaci&oacute;n del proyecto.</p>     <p><b>Referecias bibliogr&aacute;ficas</b></p>     <!-- ref --><p>1 Bai F., Anderson W., Young M. 2008. Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks. Biotechnology Advances. 26: 89-105.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000088&pid=S0123-3475201400010002000001&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --> </p>     <!-- ref --><p>2 Bai F., Chen L., Zhang Z., Anderson W., Young M. 2004. Continuous ethanol production and evaluation of yeast cell lysis and viability loss under very high gravity medium conditions. Journal of Biotechnology 110 (3): 287-293.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000090&pid=S0123-3475201400010002000002&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --> </p>     <!-- ref --><p>3 Bochno H. 2008. Investigaci&oacute;n en Materias Primas para Biocombustibles. Taller II Plan BIOCOM.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000092&pid=S0123-3475201400010002000003&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>4 Cao Y., Tian H., Yao K., Xuan Y. 2011. Simultaneous saccharification and fermentation of sweet potato powder for the production of etanol under conditions of very high gravity. Frontiers of Chemical Science and Engineering. 5 (3): 318-324.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000094&pid=S0123-3475201400010002000004&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>5 Chan P., Laopaiboon L., Jaisil P., Laopaiboon P. 2013. High Level Ethanol Production by Nitrogen and Osmoprotectant Supplementation under Very High Gravity Fermentation Conditions. Electronic Journal of Energy. 6: 884-899.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000096&pid=S0123-3475201400010002000005&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>6 Jones A., Ingledew W. 1994. Fuel Alcohol Production: Optimization of Temperature for Efficient Very-High-Gravity Fermentation. Applied and Environmental Microbiology. 60 (3):1048-1051.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000098&pid=S0123-3475201400010002000006&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>7 Lan T., Nguyen T., Gheewala S., and Garivait, S. 2007. Full Chain Energy Analysis of Fuel Ethanol from Cassava in Thailand. Environmental Science & Technology. 41 (11): 4135-4142.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000100&pid=S0123-3475201400010002000007&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>8 Lim Y., Jang J., Kim K. 2013. Production of high concentration of ethanol from potato tuber by high gravity fermentation. Food Science and Biotechnology. 22 (2): 441-448.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000102&pid=S0123-3475201400010002000008&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>9 Loapaiboon L., Sunan N., Penjit S., Preekamol K., Pattana L. 2009. Ethanol production from sweet sorghum juice using very high gravity technology: Effects of carbon and nitrogen supplementations. Bioresource Technology. 100: 4176-4182.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000104&pid=S0123-3475201400010002000009&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --> </p>     <!-- ref --><p>10 MADR. 2001. Proyecto Alianzas Productivas para la Paz. Documento Conpes 3111. Rep&uacute;blica de Colombia, Departamento Nacional de Planeaci&oacute;n.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000106&pid=S0123-3475201400010002000010&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --> </p>     <!-- ref --><p>11 Men&eacute;ndez E. 2001. &quot;&quot;Energ&iacute;as renovables, sustentabilidad y creaci&oacute;n de empleo. Una econom&iacute;a impulsada por el sol&quot;. Madrid. Ed. Men&eacute;ndez P&eacute;rez, E.; Los libros de la catarata y Fundaci&oacute;n 1&#186; de Mayo, p 31.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000108&pid=S0123-3475201400010002000011&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --> </p>     <!-- ref --><p>12 Monsalve J., Medina V., Ruiz A. 2006. Producci&oacute;n de Etanol a partir de Cascara de Banano y de Almid&oacute;n de Yuca. DYNA. 73 (150): 21-27.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000110&pid=S0123-3475201400010002000012&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>13 Nuanpeng S., Laopaiboon L., Srinophakun P., Klanrit P.,  Jaisil P., Laopaiboon P. 2011. Ethanol production from sweet sorghum juice under very high gravity conditions: Batch, repeated-batch and scale up fermentation. Electronic Journal of Biotechnology. 14 (1): 1-12.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000112&pid=S0123-3475201400010002000013&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>14 S&aacute;nchez O., Cardon, J. 2005. Producci&oacute;n Biotecnol&oacute;gica de Alcohol Carburante II: Integraci&oacute;n de Procesos. Revista Virtual Interciencia. 30(11) 679-686.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000114&pid=S0123-3475201400010002000014&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>15 Srichuwong S., Fujiwara M., Wang X., Seyama T., Shiroma R., Arakane M., Mukojima N., Tokuyasu K. 2009. Simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of very high gravity (VHG) potato mash for the production of ethanol. Biomass and Bioenergy. 33 (5): 890-898.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000116&pid=S0123-3475201400010002000015&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>16 Yingling B., Li C., Honglin W., Xiwen Y., Zongcheng Y. 2011. Multi-objetive optimization of bioethanol production during cold enzyme starch hydrolysis in vey high gravity cassava mash. Bioresources Technology. 102(17): 8077-8074.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000118&pid=S0123-3475201400010002000016&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>17 Zhang L., Chen Q., Jin Y., Xue H., Guan J. 2010. Energy-saving direct ethanol production from viscosity reduction mash sweet potato at very hihg gravity (VHG). Fuel Processing Technology. 91: 1845-1850.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000120&pid=S0123-3475201400010002000017&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p>     <!-- ref --><p>18 Zhu S., Wu Y., Yu Z., Zhang X., Wang C., Yu F., Jin Z., Zhao Y., Xue Y. 2005. Simultaneous Sachharification and Fermentation of Microwavve/alkali pretreated rice straw to ethanol. Biosystem Engineering. 92 (2):229-235.    &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[&#160;<a href="javascript:void(0);" onclick="javascript: window.open('/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000122&pid=S0123-3475201400010002000018&lng=','','width=640,height=500,resizable=yes,scrollbars=1,menubar=yes,');">Links</a>&#160;]<!-- end-ref --></p></font>     ]]></body><back>
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