DOI: http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.47683

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Métodos de conservación para actinobacterias con actividad solubilizadora de fósforo

Preservation methods for actinobacterias with phosphate solubilizing activity

Tatiana Ortiz^*, Valeria Ocampo^**, Luis Daniel Prada^***, Marcela Franco-Correa^****

^* Microbióloga Industrial M.Sc. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia,
tatsortiz.ortiz@gmail.com
^** Microbióloga Industrial. Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia,
ocampov1946@gmail.com ]]> ^*** Microbiólogo Industrial M. Sc. UNIDIA, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia,
luisd09@hotmail.com
^**** Microbióloga PhD. GBAI, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Colombia,
franco@javeriana.edu.co

Recibido: noviembre 18 de 2015 Aprobado: octubre 26 de 2016

Resumen

El objetivo de esta investigación fue evaluar diferentes métodos de conservación para actinobacterias solubilizadoras de fósforo debido a la poca información de métodos específicos reportados para estos microorganismos. Los métodos de conservación se evaluaron a 3 diferentes periodos de tiempo; largo, mediano y corto plazo, usando métodos de congelación y liofilización; arcilla, sílica, arena y transferencia periódica, respectivamente. Para ello se usaron 15 aislamientos de 3 localidades diferentes (La Vega, Maní y Tota) y un banco de referencia de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana. Se prepararon todos los inóculos en solución salina al 0,85% (p/v) y se ajustaron a una concentración de 10⁸ cel/mL, seguido a ello se inocularon los viales de cada método de conservación con sus respectivos crioprotectantes, glicerol 20% (v/v), 30% (v/v) para congelación y skim milk 18% (p/v) para liofilización. Los métodos a mediano plazo se ejecutaron de igual manera, el inóculo se agregó a 10 perlas de arcilla, 10 g de arena y 5 g de sílica, posteriormente se almacenaron a 4 °C. El método de corto plazo se evaluó en agar avena (15 g/L). La evaluación se realizó mediante recuento directo en cámara de Neubauer por la técnica de azul de tripán, además de la caracterización macroscópica y microscópica de cada aislamiento en transferencia periódica. Se estableció que la actividad solubilizadora de fósforo se mantuvo más estable en los métodos de glicerol 30 % (p/v) y liofilización según el análisis estadístico.

Palabras clave: Viabilidad, crioprotectantes, banco, liofilización, crioconservación.

Abstract

The aim of this research was to evaluate different methods of preservation for actinobacteria with phosphate solubilization activity due to there are a few specific methods reported for these organisms. The methods were evaluated at three different time periods; long, medium and short-term and employing methods as cryopreservation and dry-freezing; clay, silica and sand; and periodically plating, respectively. Therefore 15 isolates from 3 different locations (La Vega, Maní and Tota) and a bank reference from Livestock Research Unit of the Pontificia Universidad Javeriana were used. All inocula were prepared in 0.85% saline solution (w/v) which were adjusted to a concentration of 10⁸ cells/mL, followed each vial was inoculated with their respective storage cryoprotectants , glycerol 20% (v/v), 30% (v/v) to freeze and 18% skim milk (w/v) for dry-freezing. Medium-term methods were performed similarly; the inoculum was added to 10 clay beads, 10 g of sand and 5 g of silica and then stored at 4 °C. The short-term method was evaluated in oatmeal agar (15 g/L). The evaluation was performed by direct counting in a Neubauer chamberusing trypan blue staining technique, in addition to macroscopic and microscopic characterization of each isolate in periodic plating. It was established that the phosphorus solubilizing activity was more stable in glycerol 30% (w/v) and lyophilization for statistical analysis.

Introducción

Para la elección de un método de conservación se deben tener en cuenta cuatro aspectos fundamentales: mantener el 70% de las células viables, la pureza, la estabilidad genética al final de la conservación de los aislamientos (García & Uruburu, 2001) y los costos que implica el proceso (Parra et al., 2006). Existen diversos métodos de conservación entre los que se encuentran congelación y liofilización; sílica gel, arcilla y arena; y transferencia periódica, clasificándose según el tiempo en largo, mediano y corto plazo respectivamente. Es necesario entonces, encontrar métodos que permitan la conservación de microorganismos que presentan características de gran interés, como producción de metabolitos secundarios o en este caso la solubilización de fósforo.

El fósforo es un macronutriente esencial para el desarrollo de las plantas, sin embargo no se encuentra frecuentemente en formas disponibles en el suelo, por lo cual las plantas no pueden usarlo para su desarrollo. Existen diversas formas de transformar fosforo no disponible, en formas disponibles como la solubilización mediante la producción de ácidos orgánicos la cual libera fosforo inorgánico como ortofosfatos, que pueden ser asimilados por las plantas para su crecimiento. Existen diferentes microorganismos capaces de solubilizar fósforo como las actinobacterias, bacterias Gram positivas filamentosas, ampliamente distribuidas en distintos tipos de ambientes como el suelo y agua, aunque también se pueden encontrar en el hombre; son microorganismos heterótrofos, aerobios y su temperatura óptima de crecimiento es de 25 - 30°C (Franco, 2008), sin embargo, se han reportado pocos métodos de conservación para actinobacterias, por lo tanto el objetivo de este trabajo es definir un método adecuado de conservación para actinobacterias que presenten actividad solubilizadora de fósforo.

Metodología

Se seleccionaron 15 aislamientos (Prieto et al., 2015) de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana para el estudio, las cuales presentaron actividad solubilizadora de fósforo según Prada, Prieto & Franco (2014).

Métodos de largo plazo (1 año de conservación)

Se usó un liofilizador LABCONCO FREEZE DRY SISTEM / FREE ZONE 4.5 el cual se mantuvo una temperatura de -50°C, se usaron viales con una capacidad volumétrica de 2,5 mL y como crioconservante Skim Milk al 18% (p/v), se prepararon inóculos en solución salina al 0,85% (p/v) a una concentración de10⁸ cel/mL (García & Uruburu, 2001). Para ello se realizaron recuentos en cámara de Neubauer, efectuando una tinción de viabilidad con azul de tripán al 0,05% para evidenciar las células vivas de células muertas (Cardona et al., 2005). Finalmente, el inóculo con el crioconservante se ajustó en una proporción 1:1 y se almacenaron a una temperatura de 4°C (García & Uruburu, 2001). Para su reactivación se tomaron 0,5 mL de solución salina con una jeringa de 3 mL y se agregaron al liófilo homogenizando la solución, posteriormente se realizó el recuento en cámara de Neubauer para determinar la viabilidad y una tinción de Gram para confirmar la pureza.

Congelación

Métodos de mediano plazo (6 meses de conservación)

Arena estéril

Es un sustrato el cual se ha estudiado para conservación de hongos específicamente patógenos (Nakasone et al., 2004), sin embargo, en este estudio se probó con actinobacterias, para ello se tomaron 10 g de arena que se depositaron en viales con capacidad de 50 mL y se esterilizaron a 120°C durante 15 minutos. Por otra parte se realizó un recuento en cámara ajustando el inóculo como se reportó anteriormente. Se tomó 1 mL del inóculo y se agregó a 10 g de arena estéril para almacenarlos a una temperatura de 4°C (García & Uruburu, 2001). Para su reactivación se tomó 1 g de la muestra y se agregó a 9 mL de solución salina, se realizó un recuento directo en cámara.

Sílica gel

Se tomaron 5 g de Sílica y se introdujeron en viales con capacidad de 50 mL, se esterilizaron a 180°C durante 90 min, finalmente se dejaron enfriar y se colocaron en una bandeja con hielo durante 24 horas (Perkins, 1962) (Nakasone et al., 2004); posteriormente se realizó el recuento en cámara de Neubauer para ajustar la concentración del inóculo. Se agregaron 0,7 mL del inóculo a 5 g de Sílica y se almacenaron a 4°C (García & Uruburu, 2001). Para la reactivación se tomó 1 g de Sílica y se realizó un recuento directo en cámara.

Arcilla

Se tomaron 3 g de Sílica y se colocaron en un vial de 50 mL, seguido a ello se colocó algodón sobre la Sílica. En otro vial se colocaron 10 perlas de arcilla y se mandaron a esterilizar con calor seco a 180°C durante 2 horas. Por otra parte se realizó el recuento en cámara de Neubauer para ajustar la concentración del inóculo, posteriormente se colocaron las perlas de arcilla en el inóculo durante 5 minutos en condiciones de esterilidad, luego se colocaron las perlas de arcilla previamente inoculadas en el vial que contiene la Sílica, se sellaron y se almacenaron a 4°C (García & Uruburu, 2001). Para su reactivación se tomaron todas las perlas de cada vial y se realizó un recuento directo en cámara.

Método de corto plazo

Transferencia periódica

Cuantificación de la actividad solubilizadora de fósforo

Se tomó un Erlenmeyer de 100 mL al cual se le adicionaron 18 mL de medio NBRIP con fosfato tricálcico (Ca₃(PO₄)₂) en una concentración de 5g/L como fuente de fosforo insoluble y 2 mL de inóculo ajustado a una concentración de (10⁸ cel/mL), seguido a ello se incubaron a 23°C y 120 rpm durante 5 días. Luego del tiempo de incubación, cada una de las muestras se llevó a centrifugar por 15 minutos a 5000 rpm, posteriormente se tomó el sobrenadante y se realizó la cuantificación de la actividad solubilizadora de fósforo de los aislamientos que presentan mayor solubilización según lo establecido por Prada, Prieto & Franco (2014) las cuales son Streptomyces MCR24, Streptomyces T3A y Streptomyces T3C; este proceso se realizó por triplicado; la cuantificación se realizó con el test SPECTROQUANT de Merck® (Murphy & Riley, 1962) efectuando lo propuesto por el protocolo 365.2 de la EPA Phosphorous, All forms (colorimetric, ascorbic acid and single reagent, midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 880 nm). Para el desarrollo de esta prueba se preparó una curva patrón cuya solución estándar fue 0.01 mg de P (KH₂PO₄)/mL.

Análisis estadístico

Los resultados se analizaron mediante una prueba de varianza simple (ANOVA) y una prueba de Tukey para comparación de medias con un α de 0,05. Se realizaron tres réplicas por ensayo. Como herramienta informática se utilizó el programa SPS 11,0 para software de Windows®.

Análisis de costos

La estimación de los costos de la investigación se realizó mediante la sumatoria de todos los insumos y materiales usados por cada tratamiento evaluado, a su vez se incluyó el costo de un operario. Cada uno de los valores presentados en la tabla 4 implica un banco de conservación equivalente a 100 unidades por cada método.

Resultados

Se seleccionaron los mejores aislamientos con actividad solubilizadora de fósforo de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana, según los resultados obtenidos por Franco (2008) y Prada, Prieto & Franco (2014); dichos aislamientos se sometieron a siete diferentes tratamientos de conservación divididos en largo, mediano y corto plazo.

En cuanto al método de corto plazo, transferencia periódica, se realizaron caracterizaciones morfológicas en las cuales se evidenció que ninguno de los aislamientos presentaron cambio alguno durante el transcurso del tiempo, sin embargo la actividad solubilizadora de fósforo fue baja obteniendo resultados de 9,05 a 20,84 ppm para los aislamientos seleccionados en comparación con los valores obtenidos por Prada, Prieto & Franco (2014).

Para evaluar la actividad solubilizadora de fósforo se tomaron 3 aislamientos de actinobacterias que presentaron la mayor actividad solubilizadora (396 y 526 ppm) en estudios previamente realizados (Streptomyces MCR24, Streptomyces T3A y Streptomyces T3C) (Prada et al., 2014). Mediante un análisis de varianza ANOVA de un factor, con un α de 0,05 y posteriormente una prueba de Tukey se determinó el mejor método de conservación relacionado con la preservación de la actividad para cada uno de los aislamientos. En la tabla 3, se observan los diferentes tratamientos evaluados y la concentración de fósforo soluble en ppm de cada aislamiento. Los resultados demostraron que para Streptomyces MCR24 existen diferencias estadísticamente significativas en cuanto a los métodos de conservación evaluados siendo glicerol 30% (p/v) el mejor tratamiento, Streptomyces T3A no presenta diferencias significativas ya que los datos presentaron un comportamiento similar, sin embargo, se eligió la media más alta la cual corresponde al tratamiento de liofilización. Streptomyces T3C muestra que hay diferencias significativas entre los métodos, dónde liofilización y glicerol (30%) fueron los métodos que tuvieron mejor efecto en el mantenimiento de la actividad fisiológica de interés que fue la solubilización de fósforo (tabla 3).

En la tabla 4 se observan algunos valores resaltados en negrilla, los cuales indican en la viabilidad y actividad solubilizadora de fósforo los valores más altos; y en costos, los valores más bajos o más económicos por cada tratamiento.

Discusion de resultados

Debido a la gran variedad que presentan los microorganismos no se ha reportado un método óptimo de conservación para éstos en general, incluso para un grupo particular de microorganismos como las actinobacterias, estas bacterias son conocidas por su importancia biotecnológica y biológica en diversos campos, hecho relacionado con su alta diversidad metabólica y presencia en diversidad de nichos ecológicos (Franco & Chavarro, 2016). Aun así, son limitadas las investigaciones relacionadas con la forma de almacenamiento de los miembros de este grupo, por lo cual de manera común se hace uso de los métodos de conservación de otros grupos bacterianos para preservarlos. En muchas ocasiones esto puede funcionar, pero no es idóneo generalizar ni someter estos microorganismos a las mismas condiciones de conservación que los otros filum, debido a que este grupo presenta características fenotípicas, fisiológicas y genéticas propias que hacen posible determinar un adecuado método de conservación. Además, la conservación de las actinobacterias tiene como objetivo mantener sus características originales por las cuales fueron seleccionadas, lo que no siempre es posible pues se han reportado frecuentemente re-arreglos génicos así como otros mecanismos genéticos (transferencia horizontal de genes) que pueden modificar las características deseables durante sus periodos de almacenamiento, hecho que se aprecia en algunas ocasiones fenotípicas y especialmente por cambios de caracteres morfológicos (Leblond et al., 1990), (Birch et al., 1990), (Ventura et al., 2007).

En el presente estudio no se apreció ningún cambio morfológico, macroscópico o microscópico, en los microorganismos evaluados durante los periodos de almacenamiento, lo cual sugiere que los métodos usados brindan estabilidad génica. Sin embargo, a pesar de no encontrar rasgos morfológicos que sugieran alteraciones genéticas, el uso de la transferencia periódica ha demostrado perdida en la actividad solubilizadora de los microorganismos al ser comparados con otros métodos y sus reportes previos (Prada et al., 2014) lo que invalida la transferencia como método de conservación. Este hecho resalta la importancia de la estandarización y uso de métodos a mediano y largo plazo para la adecuada conservación de estas actinobacterias de importancia biotecnológica.

En la tabla 1, se observa que los microorganismos de este estudio no presentan afinidad por un método en específico. En las evaluaciones a largo plazo, por ejemplo, el 46% de los aislamientos presentaron mayor afinidad con glicerol al 20% (p/v) aunque la diferencia porcentual en cuanto a liofilización no es significativa, ya que el 33% de los aislamientos se ajustaron mejor a éste método el cual ha sido ampliamente reportado (Burguet et al., 2012) (Chen et al., 2006). Esto se debe al fuerte impacto que reciben las células por el proceso de sublimación que disminuye notablemente el porcentaje de viabilidad de los microorganismos por causas de estrés sobre la celula, (Bozoglú et al., 1987) (Prakash et al., 2013). Así mismo, este proceso se puede ver afectado por la concentración del crioprotectante, algunos autores como García & Uruburu (2001) reportan el uso de Skim Milk al 18% (p/v) como la concentración óptima para la protección del microorganismo, sin embargo ésta puede ser un factor limitante de la viabilidad debido al proceso de ultracongelación, al cual son sometidos antes de ser liofilizados. Por otra parte la crioconservación ha sido reportada como un buen método de conservación (Hubalek, 2003) tanto para bacterias como para hongos, sin embargo es un método que afecta tanto la viabilidad como la actividad dependiendo de la temperatura y concentración del crioprotectante utilizado, el glicerol es un compuesto que en altas concentraciones, mayores a 30%, se puede volver tóxico para las células puesto que penetra la membrana celular. Como se observa en la tabla 1, tres aislamientos de los quince evaluados presentan buenos resultados con este método, por lo tanto es adecuado como método de conservación. Al ser la actividad solubilizadora de fósforo uno de los factores que se debe mantener durante el periodo de la conservación en la tabla 3 se puede observar que el glicerol 30% (p/v) es el método que presenta mayor mantenimiento de la actividad fisiológica de los microorganismos, dando como resultado una mayor concentración de fósforo soluble al transcurrir un año de conservación para los 3 aislamientos, esto quizás se debe a que la congelación rápida influye en la preservación de la actividad la cual está proporcionalmente ligada a la viabilidad.

Los métodos a mediano plazo se seleccionaron debido a que han sido reportados para microorganismos que se encuentran generalmente en el suelo, las matrices presentes en este medio forman asociaciones físicas con las Actinobacterias, tales como arenas o arcillas pueden contribuir a los buenos resultados en cuanto a viabilidad. El 86% de los aislamientos presenta mayor afinidad en arena como matriz de conservación como se observa en la tabla 2. La arena tiene un tamaño de 0,10 a 0,25 mm (Hodgson, 1987) lo cual limita el paso de agua, aire, entre otros factores que pueden beneficiar el crecimiento (Glyan & Gary, 1999) de las Actinobacterias, por lo tanto permite la conservación de dichos microorganismos sin influir en su cinética de crecimiento. Por otra parte ningún aislamiento presentó afinidad por el método de sílica gel aunque ha sido reportado como método de conservación y en repetidas ocasiones presenta buenos resultados fenotípicos y de estabilidad genética como en estudios realizados con Escherichia coli HB101 por Sidyakina y Golimbet (1991) o el trabajo de Álvarez, Pieckenstain, Desimone, Estrella, Ruíz & Díaz (2010), los cuales mencionan una eficiente protección y preservación de Mesorhizobium spp. de importancia agroindustrial por tener la capacidad de fijar nitrógeno. Aun cuando es reportado que los microorganismos Gram positivos tienden a sobrevivir más los procesos de preservación en sílica gel que microorganismos Gram negativos (Trollope, 1975), esto no se vió reflejado en este estudio, como se observa en la tabla 2, esto se da porque es un material sintético fabricado a partir de silicato sódico, un compuesto desecante que elimina por completo la humedad y puede afectar la viabilidad celular y al mismo tiempo la actividad. Por otro lado la arcilla al ser un compuesto natural como la arena, permite la conservación de la viabilidad como se observa en la tabla 2, aunque solo dos aislamientos presentaron alta afinidad por este método ya que es un compuesto el cual ha cambiado sus propiedades físicas originales al ser sometido a un proceso térmico, lo que aumenta su porosidad y por lo tanto permite la conservación del microorganismo en dicha matriz.

El análisis de costos determinó que el método de glicerol al 20% correspondiente a largo plazo y arcilla de mediano plazo, fueron los métodos más económicos de cada uno de los tiempos evaluados, aunque no presentaron los mejores resultados de viabilidad y actividad solubilizadora, la concentración de fósforo soluble no disminuyó más del 32%, lo que permite inferir que los métodos evaluados son eficaces y su elección se debe realizar según el interés que se tenga al momento de llevar a cabo la conservación.

Conclusión

Aun cuando los métodos de liofilización fueron muy efectivos en este estudio y son a su vez recomendados por "The American Type Culture Collection" o autores como Yocheva et al., 2002, los resultados de este estudio concluyen que los métodos de conservación más eficientes en general para la conservación de actinobacterias solubilizadoras de fósforo fueron los de crioconservación con glicerol al 30%, el uso de este método de crioconservación es rápido, de bajo costo y apropiado para largos periodos de conservación, lo cual coincide con lo reportado por Rifaat (2009).Por otro lado el método con arena arrojó los mejores resultados en cuanto a viabilidad, mantenimiento de la actividad y costo siendo ideal para usar en el momento de estar trabajando de manera activa con algún aislamiento en particular. Sin embargo se logró evidenciar que no todos los microorganismos se conservan manteniendo las respectivas cualidades evaluadas de la misma manera, por lo cual se sugiere de ser posible, conservar cada microorganismo con el método que preserve dichas cualidades de interés de la forma más efectiva.

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