1 Grupo de Estudio en Parasitología y Micología Molecular (GEPAMOL). Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad del Quindío. Armenia, Colombia.
Fecha de recibido: 18/03/2008; fecha de aceptado: 08/05/2008
Resumen
]]> Antecedentes. Los métodos convencionales para a identificación de levaduras del género Candida requieren mucho tiempo, necesitan cantidad importante de la muestra y, en muchos casos, es necesario realizar cultivo.Objetivos. Evaluar un par de cebadores para la identificación de levaduras del género Candida y demostrar su potencial aplicación para el diagnóstico de infecciones intraoculares.
Materiales y métodos. Se utilizaron 17 cepas de referencia, 29 aislamientos clínicos de flujo vaginal, 7 muestras de humor acuoso y una de humor vítreo. Evaluamos tres métodos para el rompimiento de la pared celular: congelación descongelación, sonicación, y la enzima liticasa. Para la purificación del ácido nucleico, se utilizó en los tres casos el estuche comercial Wizard Genomics; en la reacción de PCR, el estuche comercial Go Taq Green Master Mix y los iniciadores ITS3 e ITS4 a una concentración de 0,5 µM.
Resultados. De los tres métodos el que mejor resultados ofreció fue el uso de enzima liticasa más el estuche comercial. Con los iniciadores ITS3 e ITS4 fue posible identificar las levaduras únicamente a nivel de género y no se presentó reacción cruzada con otros microorganismos comúnmente encontrados en diferentes muestras de tejido humano. La sensibilidad fue de 100 fg. Se lograron identificar por PCR todos los aislamientos a partir de flujo vaginal y de una muestra de humor acuso. Para las demás muestras de humor acuoso el diagnóstico fue para otros agentes causales, entre ellos, Toxoplasma sp.
Conclusión. Consideramos que ésta es una metodología adecuada, la cual permite identificar levaduras del género Candida on gran sensibilidad y reproducibilidad.
Palabras clave: Candida spp., reacción en cadena de la polimerasa, PCR, uveítis, ITS, diagnóstico.
Abstract
Background. Conventional methods for Candida identification are time consuming, require high amounts of the sample and in several cases the culture is mandatory.
Aims. To evaluate two primers for the identification of Candida and to demonstrate their application for intraocular infections.
Materials and methods.
17 Candida reference strains, 29 vaginal samples, 7 samples of aqueous humor and one of vitreous humor were studied. Three methods to lyse the Candida wall were analyzed: freezing-thawing, sonication and the use of lyticase. For nucleic acid purification the Wizard Genomics kit was used; in the PCR the commercial kit Go Taq Green Master Mix and the primers ITS3 and ITS4 were used. ]]> Results. The best method for lysis was the enzymatic lysis with lyticase. The primers ITS3 and ITS4 identified all the Candida strains and there were no cross-reaction with other microorganisms. The sensitivity of the PCR was 100 fg. All the samples of vaginal flux and Candida strains were identified and only one sample of aqueous humor was positive for the genus Candida. In the other samples of aqueous humor toxoplasmosis was the definitive diagnosis.Conclusion. PCR amplification for Candida is a sensitive and specific technique for the diagnosis.
Key words: Candida spp., polymerase chain reaction, PCR, uveitis, TS, diagnostic
Introducción
El género Candida está constituido por más de 180 especies, distribuidas alrededor de todo el mundo y que ocupan diferentes nichos (1-3). Son comensales de algunos miembros del reino animal y del vegetal, y pueden aislarse de objetos inanimados y del medio ambiente. Algunas de estas especies son comensales del hombre, comúnmente aisladas en la microbiota normal de la piel, las mucosas, el tubo digestivo y el sistema genitourinario (4), de los cuales, Candida albicans es la especie más representativa del género y puede ser aislada en cerca de 70% de la población sana (5).
De las especies de este género, se considera que sólo 18 son patógenos y son el agente causal de la candidiasis, una enfermedad que tiene la capacidad de comprometer múltiples tejidos, órganos y sistemas del ser humano. Su potencial patógeno varía en forma considerable y el microorganismo más frecuente es C. albicans, especie del género capaz de generar con mayor frecuencia enfermedad mortal en pacientes inmunocomprometidos (6).
C. albicans es aislada en 85% a 90% de los casos de candidiasis vaginal. Esta enfermedad afecta el 70% a 80% de las mujeres, por lo menos, una vez durante su vida y, de ellas, entre 40% y 50% experimentan recurrencias (7). Con el aumento de las enfermedades que comprometen al sistema inmune, como sida, cáncer y terapia postoperatoria, y de los pacientes receptores de órganos, se ha generado el escenario perfecto para que muchas de las especies que eran comensales del humano se conviertan en patógenos oportunistas del mismo.
C. albicans es la mayor causa de candidiasis invasiva y es uno de los patógenos aislados con mayor frecuencia de la sangre de pacientes en su período postoperatorio y de pacientes inmunocomprometidos, durante las últimas dos décadas (6-9).
Las infecciones causadas por hongos no suelen presentar un cuadro prodrómico definido, que permita identificar o definir el agente causal. Además, se carece de métodos diagnósticos, rápidos y sensibles, lo que resulta en un manejo inapropiado de la infección (4). Los métodos comúnmente usados, basados en el cultivo, poseen una sensibilidad estimada de 50% y requieren, por lo menos, de 48 horas para dar un diagnóstico (10).
Desde la aparición de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la década del 80, se han venido llevando a cabo muchos esfuerzos para conseguir un par de iniciadores que permitan identificar cada una de las especies de importancia médica del género Candida, pero hasta el momento no ha sido posible. Gracias a que la PCR es una técnica versátil, se han desarrollado variantes de la misma; entre ellas, la más usada por su gran sensibilidad y el acceso rápido a los resultados, es la PCR en tiempo real. Es posible encontrar varias publicaciones en las que se usa la PCR en tiempo real y varios juegos de iniciadores, con el fin de diferenciar las especies del género Candida de importancia médica (11-15).
]]> Para la identificación molecular de organismos patógenos se han usado diferentes secuencias como blanco, entre ellas, genes de ADN mitocondrial y genes que codifiquen para ARN ribosómico. Los genes de ARNr 18s,5.8s y 26s, son en esencia idénticos en longitud y secuencia en todas las especies. Sin embargo, la longitud de la región ITS (internal transcribed spacer, o espaciador interno del transcripto) depende de la especie. La región ITS se localiza entre los genes de ARNr 18s y 26s, y está dividida en la región ITS1 entre los genes 18s y 5.8s; y la región ITS2, entre los genes ARNr 5.8s y 26s. Por esta razón, son secuencias que se han utilizado como marcadores moleculares para la identificación de géneros y especies de hongos (16).R. Wahyuningsih et al. utilizaron los cebadores ITS3 e ITS4 –que tienen como blanco la región ITS – en una PCR con gran sensibilidad para la detección de ADN de levaduras del género Candida, a partir de muestras de sangre. En este estudio no se determinaron los pesos moleculares para cada una de las especies utilizadas, y tampoco se usaron cepas de referencia como método de referencia para la validación de este método (17).
Es de suma importancia identificar el agente causal de la candidiasis (18), ya que muchas de estas especies presentan resistencia innata a los tratamientos antimicóticos (8). El desarrollo de un diagnóstico, rápido y sensible resultaría en una adecuada prescripción médica del tratamiento antimicótico temprano, beneficiando al paciente y mejorando su pronóstico y calidad de vida. Esto es de particular importancia en la candidiasis ocular en pacientes inmunocomprometidos, en los cuales la presentación clínica es similar a la de muchos otros tipos de infección.
Con el siguiente trabajo pretendemos,por una parte,evaluar la capacidad de los iniciadores ITS3 e ITS4 para diferenciar las especies de importancia médica del género Candida (ya que en la literatura no se reporta ningún trabajo en el que se evalúe la capacidad de estos iniciadores para diferenciar las especies de éste género) y, por otra, aplicar la PCR con estos iniciadores en el diagnóstico de candidiasis en muestras de humor acuoso, con el fin de valorar su utilidad para la detección de infección intraocular.
Materiales y métodos
Muestras clínicas.Se recolectaron dos tipos de muestras: fluidos intraoculares y muestras de flujo vaginal. Se obtuvieron 29 aislamientos a partir de flujo vaginal de mujeres que consultaron por vaginitis, en tres centros de atención de Armenia, que fueron positivas para candidiasis vaginal, por cultivo en Sabouraud con cloramfenicol y con prueba de tubo germinal positivo, las cuales se utilizaron para determinar la utilidad de la técnica para diferenciar entre especies del género Candida.
Se utilizaron siete muestras de humor acuoso y una muestra de humor vítreo de pacientes que consultaron al centro de salud de la Universidad del Quindío, por pérdida en la agudeza visual y lesiones oculares. En todos los pacientes estaba indicado el procedimiento de paracentesis de la cámara anterior para toma de muestra de humor acuoso con el fin de realizar el diagnóstico etiológico; de ellos, sólo un paciente era positivo para VIH. Los pacientes a quienes se les tomó la muestra fueron informados del estudio y firmaron el correspondiente consentimiento.
Análisis de las muestras de flujo vaginal. Las muestras fueron tomadas por el personal del centro de salud con escobillón estéril, el cual se depositó dentro de un tubo de ensayo con solución salina estéril. Al recibirse la muestra en el laboratorio, en presencia de mecheros los escobillones fueron tomados y frotados suavemente sobre placas de Petri con agar Sabouraud y cloramfenicol (0,5 g/L) (Scharlau Microbiology, Barcelona, España). Cada una de las cajas de Petri fue incubada a 37°C por 24 horas o menos si había aparición temprana de colonias sugestivas de Candida spp. Posteriormente, para la identificación de aislamientos, las colonias se sometieron a examen directo al microcopio. Si la morfología observada correspondía a blastoconidias, éstas eran repicadas en medio agar Sabouraud y cloramfenicol por aislamiento en estría múltiple.
Se hizo prueba de tubo germinal a todos estos cultivos en los que hubo crecimiento de colonias. Para ello, las colonias aisladas de cada una de las muestras se emulsionaron en 0,5 ml de suero humano y se incubaron por 2 horas en baño de maría a 37 °C, para luego ser observadas en el microscopio con aumento de 100X. La identificación bioquímica se hizo con los estuches comerciales RapID Yeast Plus System (Remel) y API 20 C AUX (BioMérieux), y se siguieron las indicaciones del fabricante. Una vez las muestras fueron identificadas, se tomó de cada una un inóculo de 4 colonias y se almacenaron en crioviales de 2 ml que contenían una solución de glicerol al 10% (glicerol al 87%, Merck) en congelador a -70 °C (Revco, USA).Cepas de referencia.Para determinar cuál era el peso molecular esperado del fragmento obtenido después de la PCR para cada especie, se utilizaron las siguientes cepas de referencia: C. albicans P121580 TCC28516, C. albicans IP1332 – ATCC26275, C. albicans IP118079 – ATCC2091, C. parapsilosis M 0500396, C. parapsilosis M 0500506, C.krusei ATCC6258, C. glabrata IP2114993-ATCC66032, C.tropicalis M 0500391, C. tropicalis M 500391, C.tropicalis M 0500362, C. tropicalis M 0500390, C. dubliniensis M 0500378 rugosa, C. dubliniensis, M 0500378, C. guillermondi 3483, C. guillermondi 3948, y C. famata 4868 y C. famata 3484.
Extracción y purificación del ADN de los aislados de Candida spp.
]]> Para la extracción de ADN se probaron diferentes métodos con el fin de digerir la pared celular.Congelación-descongelación. Se tomaron 10 µl de células de Candida spp. con un asa microbiológica y se suspendieron en 1 ml de agua destilada. La muestra se congeló a -80 ºC durante 5 minutos, luego se calentó 65ºC durante minutos; este ciclo se repitió cinco veces (19,20).
Sonicación. Se tomaron 10 µl de células de Candida spp. con un asa microbiológica y se suspendieron en 1 ml de agua destilada. La muestra se cubrió con hielo y luego se sonicó a 30 Hertz por 30 segundos. Este paso se repitió tres veces (20.21).
Digestión enzimática con liticasa. Se tomaron 10 µl de células, luego se lavaron con agua destilada y se resuspendieron en 293 µl de EDTA 50 mM, más 7 µl de liticasa 1U/µl. Se incubaron a 37ºC durante una hora (22).
Para la purificación del ADN, después de digerida la pared celular, se utilizó el estuche comercial Wizard Genomics, de la casa comercial Promega (USA) y se siguieron las especificaciones del fabricante (23).
Cuantificación del ADN. Se tomaron 10 µl de ADN, se resuspendieron en 990 µl de solución tampón de ADN de rehidratación (estuche comercial Wizard Genomics ) y se midió la absorbancia de la muestra a 260 nm. La concentración se determinó teniendo en cuenta que una densidad óptica (OD) e 1, s igual a 50 µg/ml.
Reacción en cadena de la polimerasa. Para la reacción se empleó el estuche comercial Go Taq Green Master Mix de la casa comercial Promega (USA) y se siguieron las indicaciones del fabricante para un volumen final de 20 µl más 5 µl de ADN muestra. El cebador sentido ITS3 (5 ´-GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC-3´) corresponde al gen 5.8S ARNr y el cebador inverso ITS4 (5´-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3´) corresponde al gen 28S ARNr. La concentración de los iniciadores fue de 0,5 µM. Los fragmentos esperados oscilan entre 300 y 500 pb.
Para a PCR se programó un ciclo inicial de 94ºC por 5 minutos, 35 ciclos con una temperatura de desnaturalización de 94ºC por 1 minuto, una temperatura de anillado de 56 ºC por 30 segundos, una temperatura de extensión de 72ºC por 30 segundos y un ciclo final a 72ºC por 7 minutos.
Análisis de resultados y estimación de pesos moleculares. Los productos de la PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 2%. Para la estimación de los pesos moleculares de los fragmentos, se utilizó el programa UnScan Densitometer, version 5.1 (Sil ? Corporation, USA), teniendo como patrón de peso molecular el plásmido Puc18 digerido con Haelll escalonado de 100 pb hasta 1.000 pb, de la casa comercial New ngland BioLabs USA).
]]> Especificidad de la PCR. Para determinar la especificidad de los cebadores se usó ADN de diferentes organismos: ADN de humano, Klebsiella pneumonidae, Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Toxoplasma gondii, Mus musculus y C. albicans.Sensibilidad de la PCR. Para determinar la sensibilidad de la PCR, se hicieron diluciones seriadas de ADN de C. albicans y luego se hizo amplificación para determinar cuál era la concentración mínima de ADN requerida para obtener productos de amplificación.
Resultados
Extracción de ADN. De los métodos utilizados para obtener ADN de las levaduras del género Candida, sólo fue posible obtener concentraciones de ADN visibles en una electroforesis de agarosa con lisis enzimática y el estuche comercial Wizard Genomics.
Sensibilidad y especificidad de la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores ITS3 e ITS4. Para determinar la sensibilidad de la PCR, se tomaron concentraciones de ADN de la cepa de referencia de C. albicans IP121580 – ATCC28516 desde 10 ng a 1 fg. Se logró obtener amplificados hasta diluciones de 100 fg (figura 1). Del ADN de diferentes organismos utilizado para determinar la especificidad de la PCR, sólo fue posible obtener amplificados a partir del ADN de la especies del género Candida (figura 2).Debido a que no contábamos con aislamientos ni cepas de referencia de otros géneros de levaduras,para descartar posibles reacciones cruzadas, se realizó un BLAST (Basic Local Alignment Tool ) en la página http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi sin encontrar valores significativos de E, lo que quiere decir que en la base de datos no hay secuencias con las cuales los iniciadores ITS3 e ITS4 anillen. Además,se accedió a las secuencias ITS de organismos como Cryptococcus spp. y Pichia spp., con el fin de hacer alineamientos con el programa ClustalW http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. En ambos casos se encontró que por lo menos 10 de los nucleótidos no coincidían con la secuencia blanco. Para el caso de Aspergillus spp., l fragmento esperado es de 600 pb.
Estimación del peso molecular de los fragmentos obtenidos para cada especie evaluada en este estudio.Todas las muestras de vaginitis por Candida, según cultivo y prueba de tubo germinal, fueron positivas por PCR de las secuencias ITS. El análisis con el programa UnScan ermitió estimar el peso molecular de las bandas obtenidas. La variación en los valores obtenidos no excedió el 10% entre lecturas. Al analizar los tamaños promedios obtenidos para cada cepa de referencia, se observó que no es posible diferenciar entre cepas de especies de C. albicans por este método, pues los tamaños de los fragmentos obtenidos son similares entre ellas y el rango de variabilidad se cruza entre una lectura y otra (tabla 1).
]]>
Resultados en muestras de humor acuoso. Todas las siete muestras de humor acuoso fueron negativas para C. albicans excepto una. De las muestras negativas, el diagnóstico clínico fue toxoplasmosis ocular en 4 y en la otras 2 no se especificó el diagnóstico. Una de las muestras de humor acuoso fue positiva para Candida spp. Este paciente presentó mejoría al ser tratado con anfotericina B endovenosa (figura 3).
Discusión
La PCR es una técnica de biología molecular que se ha introducido en la medicina como método diagnóstico. La identificación del agente causal de la candidiasis, independientemente del origen de la muestra, es de suma importancia para un tratamiento oportuno y adecuado del paciente,con miras a mejorar su pronóstico. La PCR ofrece una alternativa para un diagnóstico rápido y eficiente. Sin embargo,en Candida se ha presentado una gran dificultad para lograr una adecuada extracción del ADN.
De los métodos utilizados para la digestión de la pared celular de las levaduras del género Candida, se evaluaron dos físicos (sonicación y congelación-descongelación). Con estos no se logró la digestión de la pared celular, posiblemente debido a la fuerza y elasticidad de la pared celular que le es conferida por sus componentes ß(1-3)-D-glucán, ß(1-6)-D-glucán, quitina y manoproteínas. Estos componentes contribuyen a que la levadura posea una membrana fuerte y elástica, resistente a múltiples condiciones ambientales (26).
El método que brindó mejores resultados fue el que empleó la enzima liticasa, de producción comercial y purificada a partir del sobrenadante de cultivos de Cellulosimicrobium cellulans, una bacteria Gram positiva. Esta enzima tiene actividad de endoglucanasa y proteasa, que le permite degradar ß(1-3)-D-glucán, ß(1-6)-D-glucán, al igual que otras proteínas de la membrana celular (23). Para la purificación del ADN, se utilizó el estuche comercial Wizard Genomics, el cual es de amplio uso para la purificación de ácidos nucleicos, con una buena eficiencia y pureza en poco tiempo.
Para obtener amplificaciones a partir del ADN de cepas del género Candida, se requiere una concentración mínima de ADN muestra de 100 fg, lo cual hace de la PCR una técnica muy sensible; esto se debe a que en el genoma de las levaduras de este género se presentan, aproximadamente, 100 copias por genoma de la secuencia ITS (26).Las diferencias entre los tamaños de los fragmentos o las secuencias de las regiones ITS1-5.8S ADNr-ITS2, región ITS1 y ITS2, se han usado para detectar e identificar hongos.
]]> En el presente trabajo, se evaluaron las posibles diferencias en el tamaño de las bandas observadas entre diferentes especies del género Candida, para determinar si son marcadores moleculares específicos para especies (26,16). Sin embargo, no fue posible diferenciarlas según el peso molecular obtenido, ya que, usando diferentes cepas de freferencia de la misma especie, obtuvimos diferentes pesos moleculares y, de la misma manera, diferentes especies presentaban fragmentos con pesos moleculares muy similares, lo cual está de acuerdo con lo reportado previamente (27). Estos autores compararon el sistema API20C con la secuencia de los productos de PCR obtenidos con los cebadores ITS3 e ITS4 y encontraron que esta secuencia es muy polimórfica dentro de aislamientos de la misma especie. Es necesario identificar secuencias específicas para especies en el futuro.En este estudio se empleó ADN de diferentes organismos para determinar si con los cebadores ITS3 ITS4 se presentaba reacción cruzada con alguno de ellos. No se presentaron reacciones cruzadas, gracias a que las secuencias ITS permiten identificar organismos que en algunos casos se encuentran filogenéticamente muy emparentados (28).
Además de las cepas de referencia usadas en nuestro estudio, logramos identificar levaduras del género a partir de muestras de flujo vaginal que hacían parte de la colección de cepas del Centro de Investigaciones Biomédicas de la Universidad del Quindío. Todos estos aislamientos habían sido ya identificados como levaduras del género Candida por cultivo microbiano, prueba de tubo germinal y el estuche comercial API 20. Éstos permitieron la validación clínica de la PCR como método diagnóstico para infecciones del género Candida a partir de muestras clínicas que han sido pasadas por cultivo microbiológico.
Algunos autores han reportado las levaduras del género Candida como la principal causa de infección ocular micótica de origen endógeno en pacientes inmunosuprimidos. Sin embargo, las características clínicas de estas lesiones son muy similares a las manifestadas por otros organismos, como T. gondii, citomegalovirus y bacterias (30). Por esta razón, la PCR es de gran valor, gracias a su gran sensibilidad y especificidad, que permiten identificar de manera rápida a Candida spp. como agente causal de la infección ocular y prescribir un tratamiento adecuado para la infección. Este es el primer trabajo en el cual se usan los cebadores ITS3 e ITS4 para el diagnóstico de candidiasis a partir de muestras de humor acuoso.
En conclusión, la PCR con los cebadores ITS3 e ITS4 es muy sensible y permite identificar hongos del género Candida a partir de muestras con poca concentración de levaduras. Los cebadores ITS3 e ITS4 son muy buenos marcadores moleculares de género; sin embargo, no permiten tener resolución a nivel de especie.
Correspondencia: Alejandra de la Torre, Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad del Quindío, Av. Bolívar 12N, Armenia (Quindío), Colombia, Tel/Fax +57 67 460168. E-mail:gepamol2@uniquindio.edu.co
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