Epidemiología y bioinformática en el estudio de la Leucemia Linfoma de Células T del Adulto asociada a la infección con VLHT-1

Using epidemiology and bioinformatics for studying HTLV-1 infection-associated adult T-cell leukemia

Mercedes Salcedo-Cifuentes¹, Oscar Restrepo² y Felipe García-Vallejo¹

1 Laboratorio de Biología Molecular y Patogénesis. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Escuela de Bacteriología y Laboratorio Clínico. Escuela de Ciencias Básicas. Facultad de Salud. Universidad del Valle. Cali. Colombia. mercysal2003@yahoo.com y labiomol@gmail.com.
2 Escuela de Ingeniería de Sistemas. Faculta de Ingenierías. Universidad del Valle. Cali. Colombia. orestrepov@gmail.com.

Recibido 31 Mayo 2010/Enviado para Modificación 20 Enero 2011/Aceptado 5 Febrero 2011

RESUMEN

Objetivos Establecer la relación entre el número de provirus VLHT-1 y las características de la cromatina adyacente en casos de Leucemia Linfoma de Células T del Adulto.
Metodología Se realizó una revisión sistemática y un metaanálisis de la literatura publica que considero como variables de estudio los provirus por cromosoma y características estructurales y funcionales de la cromatina adyacente a los sitios de integración. La concordancia entre los resultados de la evaluación que emitieron dos expertos fue evaluada con el coeficiente de Spearman Rho. Se evaluó el sesgo de publicación mediante el gráfico de embudo y el estadígrafo Egger. De acuerdo con los resultados de la evaluación de la heterogeneidad se aplicó el modelo de efectos fijos para la combinación de los resultados de las integraciones que ocurrieron en: secuencias codificantes y secuencias codificantes de acuerdo con su función molecular. ]]> Resultados La concordancia entre expertos evaluadores fue de 0,7. No se encontró sesgo de publicación. Se determinó homogeneidad entre los estudios seleccionados (p>0,05). El provirus VLHT-1 se integró en secuencias en regiones teloméricas y subteloméricas. La combinación de los resultados mostró una integración sitio dirigida hacia regiones codificantes del genoma humano (p<0,05).
Conclusión En su conjunto los resultados permiten concluir que la integración proviral no es al azar en LCCTA; ésta ocurrió en regiones reguladoras o de control; que explicarían algunos de los proceso moleculares involucrado en leukomogénesis.

Palabras Clave: Virus Linfotrópico de Células T Humanas Tipo 1, integración viral, genoma humano, epidemiología, bioinformática, Leucemia-Linfoma de Células T del Adulto (fuente: DeCS, BIREME).

ABSTRACT

Objectives Establishing a correlation between the number of HTLV-1 provirus and the characteristics of the genomic environment in ATL cases.
Methodology A systematic search was made of publications as well as a meta-analysis of the pertinent literature considering proviruses per chromosome and structural and functional characteristics of flanking chromatin regions as variables. The concordance of experts' study was evaluated by Spearman Rho correlation. Publication bias was analysed by funnel plot and the Egger statisgrapher. A fixed effects model was applied according to heterogeneity evaluation to combine the results of integration occurring in coding sequences as well as coding sequences according to their molecular function.
Results The expert concepts' Kappa index was 0.7 and no publication bias was observed. The meta-analysis result was homogeneous (p>0.05). HTLV-1 integration was directed towards several chromosomes' telomeric and subtelomeric regions. The combination of published results in the articles which were analysed supported the hypothesis of integration events being site-directed towards coding regions of the human genome (p<0.05). Moreover, the groups of genes having enzymatic and receptor functions was statistically significant.
Conclusion The results led to concluding that HTLV-I integration in the ATLL cases analysed here was not random but was directed towards regulatory regions. Such results could help to explain the role of some processes involved in leukemogenesis.

Keys Words: HTLV-1, proviral integration, human genome, genomic epidemiology, bioinformatics, ATLL (source: MeSH, NLM).

La infección por el Virus Linfotrópico Humano tipo 1 (VLHT-1), es un problema actual de salud pública global (1), ya que infecta de 15 a 20 millones de personas en todo el mundo (2), siendo Centroamérica, América del Sur y el Caribe áreas con una alta prevalencia de la infección en las cuales se observan conglomerados de regiones endémicas (3). Colombia registra seroprevalencias del 1,0 % al 2,0 %; aunque algunas zonas del Pacífico y de la región Caribe se han obtenido valores de 7,5 % y 10,0 % respectivamente (4). Este retrovirus se puede transmitir de dos maneras: horizontalmente (sexual, sangre y hemoderivados) (5) y verticalmente (madre al niño) principalmente por la leche materna (6).

Inicialmente se determinó que aquellas regiones del ADN humano con Kco/t más bajos eran las preferidas para la integración del cADN viral (9). Posteriormente, se identificó que el provirus se integraba con prelación en las bandas R, con mayor frecuencia en ciertos cromosomas y loci que diferían según la condición clínica y enfermedad asociada (10,11). DE los estudios de secuencias de nucleótidos de aquellas regiones del genoma humano adyacentes al provirus VLHT-1, se observó una alta densidad de islas CpG y elevado contenido en G:C (4,12). En su conjunto, todos estos resultados han permitido plantear la hipótesis que la integración proviral no es un evento al azar, si no que es un proceso en el cual, algunas características de la cromatina estarían condicionando la selección de los sitios de integración (13-16).

Esta hipótesis ha sido acogida por varios investigadores quienes además de análisis experimentales han apoyado sus hallazgos en estudios bioinformáticos realizados con la información registrada en las bases de datos de la secuencia del genoma humano de dominio público (17-19). La información actual es que el provirus tiene una tendencia ha integrarse en los cromosomas de gran tamaño (14,17,18,21), en regiones con alta densidad de islas CpG y de genes involucrados en el control del ciclo celular, apoptosis y transducción de señales (14,16-18,20). Sin embargo, el poder de estos estudios ha sido limitado por el pequeño número de sitios de integración estudiados. Adicionalmente, para algunos investigadores (19,20) la distribución genómica de los sitios de integración no ha sido ampliamente estudiada en el contexto de la infección persistente in vivo, en donde las células infectadas se someten a fuerzas de selección adicionales, tales como la respuesta inmune, lo cual podría influenciar la residencia de la partícula viral en la región seleccionada inicialmente para su integración. Por estas razones se planteó realizar, una revisión sistemática y un meta-análisis, con el fin de analizar la relación existente entre el número de integraciones provirales en regiones especificas del genoma humano y las características de su ambiente genómico en casos de Leucemia Linfoma de Células T del Adulto.

MATERIAL Y MÉTODO

Revisión de Literatura
La búsqueda y selección de los artículos fue conducida simultáneamente para estudios que combinaran en su metodología tanto técnicas moleculares como de análisis bioinformáticos con el objetivo de caracterizar las regiones adyacentes a la integración del VLHT-1 en casos Leucemia Linfoma de Células T del Adulto (LLCTA). Las palabras claves que orientaron la búsqueda bibliográfica en las bases de datos de PubMed, OVID y MEDLINE desde el 2002 hasta el 2008 fueron: HTLV-1, Viral Integration, Adult T-cell leukemia/lymphoma, "Ligation Mediated Polymerase Chain Reaction" -LMPCR- e "Inverse Polymerase Chain Reaction -IPCR- dos metodologías comúnmente utilizadas para amplificar regiones de genoma adyacentes a LTR provirales.

Criterios de inclusión de los trabajos preseleccionados
Se incluyeron en esta investigación: trabajos originales publicados en revistas de reconocida trayectoria registrados en bases de datos en inglés y español. Células mononucleares de sangre periférica o aspirado de nódulos recolectados a partir de pacientes con diagnóstico confirmado de LLCTA, las secuencias vecinas al sitio de integración del provirus, fueron la fuente de las unidades de análisis. Los métodos experimentales usados para la extracción de las secuencias adyacentes al provirus debían ser IPCR o LMPCR. Además, los análisis bioinformático debían considerar como fuente de información las bases de datos del GeneCard (http://www-bimas.cit.nih.gov/cards//index.shtml) y de Genoma Browser (http://www.genome.ucsc.edu/). Como criterio final para la inclusión de los estudios en el meta-análisis, se consideró que los resultados bioinformáticos partieron de homologías ≥90 % en una ventana de apertura de 100 a 500 Kb.

Obtención y análisis de los trabajos
De forma independiente, dos expertos evaluaron la pertinencia de la preselección calificando, mediante un formulario estándar, la calidad científica, la comparabilidad de las técnicas experimentales empleadas por cada grupo de autores y la de las muestras origen de las secuencias en estudio considerando la clasificación de adecuada, inadecuada o incierta, de acuerdo con los criterios del "lymphoma study groups Japonés"7. Aplicando el coeficiente de Spearman Rho (p<0,05), se evaluó la concordancia entre los resultados de las valoraciones individuales de cada uno de los expertos.

Variables sometidas a estudio y procesamiento de datos
La variable de efecto valorada fue: número de integraciones provirales. Las variables independientes fueron secuencias codificantes y no codificantes; secuencias codificantes según función molecular; secuencias repetitivas y asignación cromosómica. El análisis estadístico se llevó a cabo usando el paquete estadístico StatDirects®.

RESULTADOS

Con la estrategia de búsqueda y selección de los trabajos preestablecida se encontraron cinco artículos (Tabla 1). Uno de ellos, el de Miyazaki-2007 (21), fue eliminado para el análisis final por considerar que el número de sitios de integración tenía una representación muy baja en el total de integraciones combinadas (7/139). La concordancia en la valoración de cada uno de los expertos, mediante el Índice Kappa Kohen fue de 0,7.

La proporción combinada de integraciones en secuencias codificantes fue del 33,4 % (IC 95 %=27,6-39,4 %) (Tabla 2). El gráfico en embudo ("funnel plot") (Figura 1) no mostró sesgo de publicación, este resultado fue corroborado con la prueba de asimetría de Egger, (7,44 IC95 %: -9,40-24,28; p=0,1976). Se observó una baja heterogeneidad en la proporción de integraciones provirales en secuencias codificantes (I2=88,9 %; CI95 %=70,4 % a 93,9 %), por lo cual se aceptó trabajar con el modelo de efectos fijos para evaluar la proporción combinada (Figura 2). Adicionalmente, los resultados del meta-análisis según función molecular permitieron establecer que había homogeneidad entre las integraciones provirales orientadas hacia secuencias codificantes con función enzimática y receptora en los cuatro trabajos finalmente seleccionados (Figura 3). La distribución cromosómica de las integraciones globales mostró una tendencia hacia los cromosomas grandes y medianos (81,4 % del total de las integraciones combinadas). Varias de las integraciones se ubicaron dentro o vecinos a: cuatro clúster de histonas (cromosomas 1, 2, 6 y 22); dos clúster de oncogenes localizados en los cromosomas 6 y 8; un clúster de genes reguladores (cromosoma 14), genes codificantes para interferón y proteínas estimuladoras del interferón (cromosoma 16) y el gen de la ubiquitina (cromosoma 21). Este último corresponde a un gen que participa en la remodelación de la cromatina por mecanismo epigenético.

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Al comparar la distribución de integraciones del cADN VLHT-1 dentro de secuencias codificantes con aquella de secuencias codificantes del genoma humano según Venter (22), no se observaron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).

El mayor porcentaje de secuencias adyacentes a provirus reportadas por los cuatro autores correspondieron a secuencias que intervienen en transducción de señal (25,45 %), metabolismos celular (18,2 %), división y ciclo celular (11,8 %) y apoptosis celular (11,0 %) (Figura 4). Con base en la coincidencia de los hallazgos de los cuatro autores incluidos en el análisis final, se hizo una búsqueda detallada en la base de datos del GeneCard de las características de los genes identificados por medio de análisis bioinformático en las regiones adyacentes a provirus (Tabla 3).

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DISCUSIÓN

De acuerdo con hallazgos previos (8,14,23), tanto la integración como la transcripción del genoma viral inducirían cambios conformacionales en la estructura de la cromatina hospedera que podrían explicar algunos de los procesos patológicos de la leucemia. En este sentido se ha determinado que en las etapas tempranas de la infección, la transcripción en la célula hospedera es controlada por el efecto de la proteína Tax (8); mientras que la replicación viral tardía es controlada por proteínas accesorias del virus entre las que se incluye la p30 (24).

La tendencia a la integración subtelomérica y telomérica registradas en el meta-análisis, pueden ser determinantes de la estabilidad cromosómica y la carcinogénesis (26). En el LLCTA se detiene el acortamiento crítico por la activación de la Telomerasa y de sus proteínas de enlace (TRF1, TRF2 y TIN2) (27). Dicha activación es dirigida, en estadios tempranos de la infección, por la proteína Tax (8). En los procesos crónicos se ha observado que la activación es mediada por la expresión de Interleukina 2 (IL2) (28, 29), localizado en el locus 4q26.28 que en este estudio mostró varios sitios de integración proviral. Surge como una explicación probable a este hecho, que la presencia de estos provirus podría generar un efecto trans-activador a distancia (8,27).

En el análisis sobre los genes localizados en aquellas regiones en las que se registró un elevado número de provirus, se pudo caracterizar el potencial papel de algunos de ellos en la oncogénesis asociada. El que codifica para la Isoforma 1 de la Ankirina Eritrocitaria (ANK1) es un gen cuya unión a la proteína tax podría inhibir la formación del complejo IKB-NF-KB promoviendo la traslocación nuclear de la actividad de este complejo que conllevaría a una estimulación de la proliferación de los linfocitos T.

Este proceso explicaría la acción de la proteína oncogénica del virus en etapas tempranas de la infección; sin embargo hay reportes que muestran como el mismo efecto parecería mantenerse por la acción de proteínas accesorias del genoma retroviral como p12 y p13 (30,31). Adicionalmente, el gen también podría involucrarse en la transmisión viral célula a célula por formación de sinsitios (32). Así mismo la presencia de otros genes adyacentes a provirus como el ARL15 ("ADP-ribosylation factor-like 5") es importante pues liga GTP que activa la expresión de las proteínas Ras (33); el gen de Sintenina (SDCBP), que codifica para proteínas que participan en los procesos de transmisión de señales a nivel de citoesqueleto (32). El factor 8 regulador del interferón (IRF-8), el cual pertenece a un grupo de proteínas reguladoras de la respuesta inmune (34,35); el gen USP25 relacionado no solo con la degradación de proteínas sino también con procesos de control celular, tráfico de proteínas y remodelación de la cromatina, entre otros (36); todos ellos estarían participando de redes de expresión de genes cruciales para el control de procesos asociados con la leukomogènesis y de descontrol del ciclo celular que se asocian con LLCTA.

Identificar las posibles redes alteradas por la integración del provirus así como las características del ambiente genómico local, proporcionaría información de la enfermedad que no es directamente discernible a partir de las secuencias únicas de los genes encontrados en los sectores cromatínicos preferidos por el provirus. Aquí está lo interesante de los estudios de la genómica aplicada, en donde el diseño de técnicas experimentales, computacionales y la aplicación de diferentes modelos epidemiológicos permiten extraer la información biológica contenida en la estructura y dinámica de la red o redes de genes y el ambiente asociado al síndrome linfoproliferativo maligno con el cual cursa aproximadamente el 4% de la población infectada por el VLHT-1 (2,4,8).

Agradecimientos: A todos los pacientes con Leucemia Linfoma de células T del Adulto (LLCTA)/VLHT-1 que participaron en los estudios incluidos en este subanálisis, quienes con su colaboración permitieron ampliar el conocimiento de la LLCTA en el contexto de la infección por el VLHT-1 a nivel mundial. Este trabajo se realizo en el marco de un proyecto financiado por Vicerrectoria de Investigaciones de la Universidad del Valle, bajo el acta de trabajo y compromiso CI-1576

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