CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS BIBLIOGRAFÍAPLANT TRANSFORMATION MEDIATED BY AGROBACTERIUM: "APPLIED NATURAL GENETIC ENGINEERING"
Ana Milena Valderrama Fonseca1; Rafael Arango Isaza2 y Lucia Afanador Kafuri3
1 Investigadora. Unidad de Biotecnología Vegetal UNALMED-CIB Corporación para Investigaciones Biológicas, CIB. Medellín, Colombia. <avalderrama@cib.org.co>
2 Profesor Asociado. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias. A. A. 3840. Medellín, Colombia. <rafaelarango@epm.net.co>
3 Profesora Asociada. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias Agropecuarias. A. A. 3840. Medellín, Colombia. <lafanado@unalmed.edu.co>
Recibido: Febrero 3 de 2005; aceptado: Abril 26 de 2005.
Agrobacterium tumefaciens tiene la capacidad de transferir ADN entre reinos diferentes. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos de la biología vegetal, agricultura y biotecnología. En este artículo se describen los procesos por los cuales Agrobacterium realiza la transferencia de ADN a la planta, puntualizando en 7 eventos fundamentales para la interacción A. tumefaciens-planta y esta dirigido a profesionales de las áreas biológicas que estén interesados en actualizarse en el tema. El conocimiento básico sobre el mecanismo de transferencia del ADN ha permitido el desarrollo de vectores para la introducción de genes foráneos, dentro de los cuales se describen los 2 tipos de vectores utilizados en la actualidad: co-integrados y binarios. Así mismo se detallan algunos factores importantes que median la transformación y algunas de las principales aplicaciones de la transformación de plantas y hongos mediada por Agrobacterium.
Palabras clave: Transformación genética, Agrobacterium tumefaciens, ingeniería genética, biotecnología vegetal.
ABSTRACT
Agrobacterium tumefaciens has the ability to transfer DNA between different kingdoms. This finding has had a great impact in several fields of plant biology, agriculture and biotechnology. This review describe the mechanisms by which Agrobacterium transfer DNA to the plant, emphasizing 7 fundamental steps in the A. tumefaciens-plant interaction, to provide an opportunity for professionals in the biological sciences to familiarize themselves with the topic. Basic knowledge about the DNA transfer mechanism has allowed the development of various vectors for the introduction of foreign genes, among which two classes that are currently used are described: co-integrative and binary vectors. Furthermore, detail some important factors that mediate transformation and some of the principal applications of the transformation of plants and fungi by means of Agrobacterium.
Key Words: Genetic transformation, Agrobacterium tumefaciens, genetic engineering, plant biotechnology.
INTRODUCCIÓN
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
BIBLIOGRAFÍA
]]> INTRODUCCIÓN
Chilton et al. (1977) demostraron la presencia de un pequeño fragmento de ADN de la bacteria A. tumefaciens cuando aislaron tumores axénicos de la agalla de la corona en tabaco. Con estos experimentos se demostró la capacidad de esta bacteria de transferir ADN entre reinos diferentes. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos de la biología vegetal, agricultura y biotecnología.
Agrobacterium tumefaciens y sus especies relacionadas como A. rhizogenes y A. vitis son patógenos reconocidos de plantas y tienen la capacidad de integrar establemente parte de su material genético dentro del genoma de su hospedero (Tzfira y Citovsky, 2000). Desde el año 1970 hasta nuestros días se ha venido estudiando en detalle el mecanismo por el cual A. tumefaciens induce la formación de tumores en plantas y el conocimiento adquirido ha sido fundamental para su uso como herramienta en la ingeniería genética de plantas. Así mismo, esta interacción ha dado pie a formular modelos de señalización celular, transporte célula a célula, importe nuclear de proteínas y ADN y mecanismos de integración genómica (Tzfira y Citovsky, 2000).
Durante el proceso de infección A. tumefaciens introduce en la célula vegetal una parte de su ADN (ADN de transferencia) el cual es integrado dentro del genoma de la planta. Los genes del ADN-T son expresados en su hospedero e inducen la formación de tumores y la síntesis de unos derivados de aminoácidos llamados opinas los cuales son aprovechados por la bacteria. El ADN-T esta localizado en el plásmido Ti (Plásmido inductor de tumor), que además contiene los genes vir que son necesarios para la transferencia e incorporación del fragmento de ADN en el genoma de la planta. La especie A. rhizogenes produce el crecimiento vigoroso de las raíces infectadas mediante un mecanismo semejante al de A. tumefaciens. En este caso el plásmido que contiene el ADN-T es llamado Ri (plásmido inductor de raíces).
Un hallazgo crucial que permitió el diseño de vectores para la transformación genética de plantas mediante el uso de especies de Agrobacterium es el hecho que sólo las secuencias borde del ADN-T son requeridas para que la transferencia se lleve a cabo (Garfinkel et al., 1981; Zambryski et al., 1983). Algunos o todos los genes bacterianos del ADN-T pueden ser removidos originando vectores desarmados, los cuales pueden transformar células vegetales sin los síntomas generales de la infección bacteriana.
La inserción de nuevos genes y sus elementos reguladores en el ADN-T ha permitido la transformación genética de plantas susceptibles con genes de importancia agronómica. Esto a su vez ha servido para el estudio de la función y expresión de genes, y para el desarrollo de plantas con nuevas características (Gelvin, 2003). El principio de transferencia de ADN con A. tumefaciens y A. rhizogenes ha sido útil para la transformación de especies de plantas dicotiledóneas; sin embargo, ciertas condiciones experimentales deben ser establecidas para que el sistema de transformación funcione bien en nuevas especies vegetales. Las monocotiledóneas no son generalmente susceptibles a A. tumefaciens; aunque se ha logrado la transferencia de genes a especies monocotiledóneas de importancia económica como el arroz (Cheng et al., 1998), banano (May et al., 1995), maíz (Ishida et al., 1996), trigo (Cheng et al., 1997) y caña de azúcar (Arencibia et al., 1998) entre otros.
En este artículo se describen los procesos por los cuales Agrobacterium realiza la transferencia de ADN a plantas, el desarrollo de vectores desarmados útiles para la transformación de plantas y las condiciones experimentales que afectan su integración. Así mismo, se dará una descripción de las principales utilidades y aplicaciones del uso de la transformación genética de plantas mediante Agrobacterium.
Mecanismo de transferencia de ADN-T mediado por Agrobacterium. El mecanismo de transferencia del ADN-T a la célula vegetal esta determinado por la interacción molecular entre la bacteria y la planta, especialmente por el intercambio de señales de tipo proteico. Aunque el proceso de transferencia del ADN-T de A. tumefaciens ha sido ampliamente estudiado, aún no han sido descifrados completamente los mecanismos moleculares por los cuales éste es transferido a la planta. Se han obtenido mutantes de Arabidopsis que son resistentes a la transformación con Agrobacterium (mutantes rat) con los cuales se espera entender el papel de los genes y proteínas de la planta que median el proceso de transformación (Zhu et al., 2003). Tzfira y Citovsky (2000) describen siete eventos fundamentales para la interacción A. tumefaciens-planta:(i) reconocimiento y adherencia; (ii) identificación de señales de la planta; (iii) activación de genes vir; (iv) generación del ADN-T; (v) exportación del ADN-T hacia la planta; (vi) importación del ADN-T dentro del núcleo de la planta; (vii) integración del ADN-T dentro del genoma del hospedero.
Reconocimiento y adherencia. El aislamiento de mutantes de A. tumefaciens incapaces de adherirse a células vegetales ha permitido identificar algunos genes cromosomales necesarios para esta interacción como lo son chvA, chvB, pscA y att. De otro lado, las moléculas de la planta reconocidas por Agrobacterium han sido poco caracterizadas pero se cree que pueden actuar moléculas parecidas a la vitronectina de células animales (Wagner y Matthysee, 1992). La producción de especies de Arabidopsis thaliana mutantes para la unión con A. tumefaciens podrá ayudar a identificar proteínas y carbohidratos que estén involucrados en esta unión (Naam et al., 1999).
Identificación de señales producidas por la planta. Se han identificado dos sensores proteicos, VirA y VirG, que reaccionan específicamente con la presencia de exudados de plantas heridas y que además promueven la activación transcripcional de los genes vir (Winans et al., 1994). La proteína de membrana VirA interactúa de forma directa o indirecta con compuestos fenólicos producidos por las plantas como lignina, precursores de flavonoides y acetosiringona (Stachel et al., 1985). La proteína citoplasmática VirG es fosforilada por VirA y permite la transducción de señales que activan los genes vir (Jin et al., 1990a). Compuestos como la glucosa y galactosa también inducen los genes vir por la unión a receptores codificados cromosomalmente como ChvE que interactúa con VirA y transmite la señal (Shimoda et al., 1993).
]]> La proteína sensora ChvG hace parte del complejo cromosomal ChvG/ChvI que es importante para la virulencia de A. tumefaciens. Se ha demostrado que ChvG interviene en la regulación de genes inducibles en presencia de pH ácidos como aopB, katA, virB y virE. Ya que ChvG regula genes inducibles a cierto pH se presume que ChvG es un sensor que puede detectar directa o indirectamente la acidez extracelular (Li et al., 2002). Activación de genes vir. Los genes vir constituyen un operón con 8 genes principales (virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG y virH) regulados por una secuencia promotora que contiene 12 pares de bases conservadas a la que se une específicamente la proteína VirG fosforilada. La fosforilación de la proteína VirG es requerida para la activación de los genes vir (Jin et al., 1990b). Generación del ADN-T. La producción del ADN-T se da por la acción de las proteínas VirD2 y VirD1, que actúan como endonucleasas, uniéndose al plásmido Ti en los bordes del ADN-T relajándolo y haciendo cortes en la cadena del ADN-T sin sentido (Filichkin y Gelvin, 1993; Scheiffele; Pansegrau y Lanka, 1995; Wang et al., 1987). Después de hacer el corte, la proteína VirD2 se une covalentemente al extremo 5’ del ADN-T hasta su transferencia a la planta (Howard et al., 1989). El ADN-T es cubierto por proteínas de unión al ADN de cadena sencilla (SSB) que permiten su transporte. Las proteínas VirE2 también se unen al ADN-T y posiblemente cubren la cadena formando junto con VirD2 un complejo de transferencia (Howard y Citovsky, 1990; Zupan y Zambryski, 1997). Estudios más recientes sugieren que el complejo proteínas Vir:ADN-T se forma dentro del citoplasma de la célula hospedera; donde el ADN-T viaja al citoplasma vegetal asociado con VirD2 de forma independiente y la proteína chaperona VirE1 exporta al citoplasma la proteína VirE2. Una vez ha llegado al citoplasma de la célula hospedera el complejo VirE1- VirE2 se disocia y se forma otro complejo entre VirE2 y el ADN-T (Deng et al., 1999; Sundberg y Ream, 1999; Zhou y Christie, 1999).Exportación del ADN-T. Agrobacterium utiliza un mecanismo similar a la conjugación para la transferencia de su ADN-T oncogénico. Esta transferencia es mediada por el sistema de secreción tipo IV (T4SS). Este transportador es crítico para los procesos de patogénesis ya que exporta factores de virulencia importantes a través de la membrana de la bacteria (Burns, 2003; Yeo y Waskman 2004). El sistema tipo IV exporta diferentes tipos de proteínas entre las cuales se pueden definir tres componentes: el operón VirB/VirD4 que es requerido para la transferencia del ADN a la planta hospedera, el sistema Trb que codifica para la transferencia por conjugación del plásmido Ti entre células de Agrobacterium, y el sistema AvhB que media la transferencia del T-ADN en ausencia de las proteínas VirB y el sistema Trb (Chen et al., 2002).
El T4SS de Agrobacterium tumefaciens está compuesto por 11 proteínas codificadas por el operon VirB y al menos una proteína del operon VirD (VirD4). Esta última proteína actúa como acoplante entre T4SS y el T-DNA/VirD2 (Cascales y Christie, 2004). VirB1 permite disolver la membrana de peptidoglicano de la pared bacteriana y puede participar en el contacto célula a célula (Baron et al., 1997; Christie, 1997); VirB3 y VirB4 promueven el ensamblaje del pili de virulencia (Zupan; Ward y Zambryski, 1998); VirB6 media la formación de los complejos VirB7 y VirB9 requeridos para la biogénesis del pili T y del canal de secreción (Jakubowski; Krishnamoorthy y Christie, 2003); VirB10 se ubica transmembranalmente y su función es desconocida, y finalmente VirD4 es requerida para la formación del pili de virulencia (Fullner; Lara y Nester, 1996).
El mecanismo de translocación de las proteínas VirB/D4 no es conocido en detalle, pero se sabe que tienen una señal de translocación en el extremo c-terminal cuya característica principal es poseer una carga neta positiva con una secuencia consenso R-X(7)-R-X-R-X-R-X-X(n) (Vergunst et al., 2005).
Importación nuclear del complejo – T. La importación al núcleo del complejo VirD2-complejoT se da en conjunto con el transporte de las proteínas VirE2, VirF y VirE3 (Schrammeijer et al., 2003). Las proteínas VirD2 y VirE2 son las que median directamente el proceso de importe nuclear del complejo-T (Citovsky; Warnick y Zambryski, 1994; Herrera-Estrella; Van Montagu y Wang, 1990; Tinland et al., 1992). En la célula vegetal, VirD2 y VirE2 pueden interactuar con proteínas chaperonas que permiten el importe nuclear del complejo-T y su integración. Las proteínas chaperonas RocA, Roc4 y CypA al parecer mantienen la conformación de VirD2 durante el importe nuclear del complejo-T y su integración (Deng et al., 1998). El importe nuclear del complejo T es asistido por proteínas celulares del hospedero como VIP1 que interactúa específicamente con VirE2. Elevados niveles de VIP1 en el hospedero lo hacen más susceptible a la transformación con Agrobacterium (Tzfira; Vaidya y Citovsky, 2002). También se ha encontrado que VirE3 puede simular la función de VIP1, actuando como un adaptador entre VirE2 y la Karioferina a celular asistiendo el importe nuclear del complejo TDNA-VirE2. Debido a que VIP1 no es una proteína abundante y representa un factor limitante para la transformación, Agrobacterium puede haber desarrollado un sistema para complementar, al menos parcialmente, la función de VIP1(Lacroix et al., 2005).
Integración del ADN-T. La integración del ADN-T dentro del cromosoma de la planta esta mediada por la proteína VirD2 que contiene dominios con actividad para la recombinación y ligación (Argos et al.,1986; Tinland et al., 1995). El estudio de mutantes de Arabidopsis resistentes a la transformación con A. tumefasciens sugiere la participación de histonas H2A en la integración del ADN-T (Mysore; Nam y Gelvin, 2000).
Desarrollo de vectores desarmados. El conocimiento básico sobre el mecanismo de transferencia del ADN-T ha permitido el desarrollo de vectores para la introducción de genes foráneos en plantas cultivadas. Ya que los genes que codifican para la síntesis de opinas y auxinas no son necesarios para la transferencia del ADN-T, permite que esta región pueda ser reemplazada por genes de interés sin afectar el proceso de transferencia. Los vectores a los que se les ha removido la región interna del ADN-T son conocidos bajo el término de “desarmados”.
El hecho de que los genes vir, para que sean funcionales, no necesitan estar en el mismo plásmido que el ADN-T y de que el plásmido Ti tiene un tamaño de 200 kilobases, a forzado el desarrollo de estrategias para reducir el tamaño de estos vectores. Hasta el momento se han desarrollado 2 tipos de estrategias: las que utilizan vectores co-integrados y las que utilizan vectores binarios.
Vectores co-integrados. Estos vectores son construidos por la recombinación entre un plásmido Ti desarmado que contiene el borde izquierdo y un pequeño vector que contiene el gen de interés flanqueado por el borde derecho y una región homóloga al borde izquierdo. La recombinación se lleva a cabo por un evento de entrecruzamiento de regiones homólogas de los dos plásmidos. Un ejemplo de este sistema es el plásmido de Agrobacterium co-integrado R772: pTiB6 (Hille et al., 1983). Algunos vectores co-integrados han sido modificados para tener una recombinación sitio específica como el sistema cre/lox (Vergunst; Jansen y Hooykaas,1998). En este sistema la cepa de Agrobacterium contiene un plásmido que codifica para una recombinasa, una secuencia para el control de su expresión, genes vir y un sitio de recombinación. Este plásmido se recombina con otro plásmido, que contiene el gen de interés flanqueado por el borde derecho, generando un plásmido co-integrado sitio específico.
Vectores binarios. Estos son los vectores más usados para la transformación de plantas y se encuentran en una gran variedad. En este sistema Agrobacterium tiene dos vectores: uno que contiene la región del T-ADN con el gen de interés y otro vector que contiene la región vir. Los vectores binarios Ti tienen sitios de replicación para Escherichia coli y A. tumefaciens, permitiendo el desarrollo de técnicas de manipulación in vitro en E. coli (Hellens y Mullineaux, 2000). Dentro de los vectores simples binarios se encuentran pBIN 19, pC22, pGA482, pPCV001, pGreen y pCAMBIA entre otros. Su principal diferencia radica en el tamaño, el número de sitios de restricción del ADN-T, la presencia de genes reporteros, los orígenes de replicación y el antibiótico de selección en bacterias y plantas (Hellens y Mullineaux, 2000).
]]> Se han realizado modificaciones de estos vectores mediante la introducción en el cromosoma de Agrobacterium ya sea la región del ADN-T o la región vir. Cuando la región T está integrada en el cromosoma, la region vir es parte el plásmido Ti y viceversa. Estos vectores binarios modificados han permitido la transformación de plantas de las familias Amaryllidaceae (como cebolla y ajo) y Liliaceae (como espárragos) (http://www.cambiaip. org).Otras modificaciones también han permitido obtener cepas hipervirulentas de Agrobacterium capaces de mediar la transformación de cereales. Las cepas hipervirulentas contienen en el vector binario un cassette extra de genes vir B, C y G (Khanna y Daggard, 2003). La construcción de vectores binarios con sitios de reconocimiento de endonucleasas permite el ensamblaje de cassettes flanqueados por estas secuencias, para la construcción de vectores de transformación de plantas que contienen múltiples cassettes de expresión. Este sistema permitió la transformación y expresión de seis genes en Arabidopsis thaliana (Goderis et al., 2002). En la actualidad están disponibles una amplia variedad de vectores Ti que los investigadores pueden escoger de acuerdo a sus necesidades y capacidad tecnológica.
Factores que median la transformación. Existen diferentes factores que intervienen en la transformación de plantas mediada por Agrobacterium determinando el éxito o fracaso en la transferencia del gen de interés y su posterior integración y expresión. Estos factores varían de acuerdo a la especie vegetal pero se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: edad de la planta, tipo de tejido a transformar, cepa de Agrobacterium seleccionada para transformar, tiempo y condiciones de inoculación del tejido con Agrobacterium, densidad y período de precultivo de la bacteria y presencia de necrosis en el tejido de la planta causada por Agrobacterium (Grevelding et al., 1993; Salas et al., 2001; Chakrabarty et al., 2002, Ko et al., 2003).
Con el objetivo de inducir la expresión de los genes vir y facilitar la transformación se han utilizado diferentes inductores de la transformación como son los compuestos glucosa, acetosiringona y azacitidina; los resultados en el porcentaje de plantas transformadas varían de acuerdo a la especie vegetal evaluada y a la concentración utilizada (Chakrabarty et al., 2002; Boase; Butler y Borst, 1998). Recientemente se ha descrito que la exposición de líneas celulares de Nicotiana tabacum, A. thaliana y Ageratum conyzoides a sustancias inhibidoras de la síntesis de purinas y pirimidinas como la azaserina y acivicina eleva hasta 180 veces la frecuencia de transformación en comparación con aquellas líneas que no habían sido tratadas con estos compuestos. Los mecanismos moleculares involucrados en esta respuesta son desconocidos. (Roberts et al., 2003).
La transferencia del ADN-T en algunos explantes ha sido fuertemente disminuida por la producción por parte de la planta de especies reactivas de oxígeno las cuales probablemente activan procesos de muerte celular programada o necrosis tisular generando una barrera de células muertas alrededor del tejido infectado. Aunque estos compuestos promueven el necrosamiento del tejido, se han introducido diferentes inhibidores de enzimas que participan en este proceso para aumentar los porcentajes de plantas transformadas. Algunos tratamientos anti-necróticos aplicados durante el proceso de transformación incluyen la adición de agentes reductores, inhibición por calor de enzimas que participan en el proceso oxidativo, reducción del pH y la adición de inhibidores de enzimas. Los compuestos más ampliamente utilizados son: inhibidores de etileno (AgNO3), inhibidores de oxidasas y peroxidasas (Quelantes de cobre y hierro, compuestos tiólicos como L-cisteína, tiosulfato de sodio y glutation, DTT) (Olhoft et al., 2001; Olhoft y Somers 2001; Chakrabarty et al., 2002).
Estudios sobre el proceso de tumorogénesis han revelado que el desarrollo del tumor producido por Agrobacterium no se obtiene a altas temperaturas debido a un cambio conformacional de la proteína VirA que ocurre a temperaturas cercanas a 32 °C (Jin et al., 1993). Otros estudios mostraron que aunque la inducción óptima de los genes vir es a 25 °C la transferencia del ADN-T fue óptima a una temperatura de 19 °C (Fullner; Lara y Nester, 1996). Estos trabajos resaltan la importancia de la temperatura de co-cultivo durante la transformación. La temperatura óptima para el co-cultivo depende del tipo de planta y explante, y se resalta que es mejor el uso de temperaturas cercanas o inferiores a 25 °C. Además, temperaturas por encima de 25 °C causan un mayor necrosamiento del tejido y una reducción en la tasa de transformación (Salas et al., 2001; Chakrabarty et al., 2002).
En general las condiciones de luz durante el co-cultivo varían considerablemente si se compararan diferentes protocolos de transformación de plantas y este factor no ha sido evaluado ampliamente. Zambre et al. (2003) utilizaron callos de Phaseolus acutifolius y segmentos de raíz de A. thaliana en co-cultivo con Agrobacterium con diferentes condiciones de luz como oscuridad continua, fotoperíodo 16h luz/8h oscuridad y luz continua. En este estudio se concluyó que la actividad del gen GUS esta altamente correlacionada con el período de luz, siendo mayor la actividad cuando se utilizó luz continua para los dos tipos de explantes.
Principales aplicaciones de la transformación mediante Agrobacterium
Transformación de plantas. El conocimiento de las bases moleculares por las cuales A. tumefaciens transfiere su ADN-T al genoma de la planta ha sido fundamental para el desarrollo de la ingeniería genética de plantas. Los primeros reportes científicos de plantas transgénicas son del año 1983 con el desarrollo de plantas de tabaco (Herrera-Estrella et al., 1983), de Nicotiana plumbaginifolia (Bevan; Flavell y Chilton, 1983), de petunia (Fraley et al., 1983) y girasoles (Murai et al., 1983) resistentes al antibiótico kanamicina.
Estas primeras plantas fueron usadas en el laboratorio pero en investigaciones posteriores se ha logrado producir plantas transgénicas con características comerciales importantes como la resistencia a herbicidas, insectos y virus, control de la maduración de frutos, plantas con resistencia a condiciones adversas como desecación (Dai et al., 2001), alcalinidad, salinidad (Moyhanti et al, 2002) y frío (Huang et al., 2002). Las plantas transgénicas también han sido muy útiles para el estudio de la sobreexpresión de genes de defensa en la planta (Kanzaki et al., 2002), evaluación de promotores inducibles por patógenos (Malnoy et al., 20003), bioensayos de hipersensibilidad para facilitar la clonación y análisis funcional de nuevos genes R y Avr (Kamoun; Hamada y Huitema, 2003), entre muchos otros.
]]> Adicionalmente la transformación mediada por Agrobacterium ha permitido la expresión y producción de interleukina-2 y la producción de vacunas en plantas (Jani et al., 2002; Gao et al., 2003; Yu y Langridge, 2003; Park y Cheong, 2002), producción de plantas utilizadas en procesos de fitoremediación (Gisbert et al., 2003, French et al., 1999) y mejoramiento del contenido nutricional de algunos alimentos (Zhang et al., 2003).Transformación de hongos. La transformación mediada por Agrobacterium no ha sido solamente utilizada para la transformación y mejoramiento de plantas sino que también ha tenido aplicaciones en el área de micología. Se han transformado hongos filamentosos como Aspergillus niger, Fusarium venenatum, Trichoderma reesei, Colletotrichum gloeosporioides, Neurospora crassa, la seta Agaricus bisporus (de Groot et al., 1998), hongos ectomicorrizales (Combier et al., 2003) y hongos patógenos humanos como Coccidiodes immitis (Abuodeh et al., 2000) y Paracoccidiodes brasiliensis (Leal et al., 2004). La transformación mediada por Agrobacterium además de permitir la integración de genes foráneos puede ser usada para diferentes estudios moleculares como el marcaje de genes por mutagénesis insercional (Brown y Holden., 1998), la disrupción de genes por la adición de secuencias homólogas (Gouka et al., 1999) y la posibilidad de producir fenotipos alterados.
Transformación genética medida por A. rhizogenes. A. rhizogenes ha sido utilizado para la formación e incremento de pelos radicales que han sido apropiados para la producción de metabolitos secundarios por su estabilidad y alta producción. Entre los metabolitos secundarios producidos en raíces transformadas se encuentran terpenoides (Ayadi y Tremouillaux-Guiller, 2003) hiosciamina y escopolamina (Moyano et al., 2003). Los cultivos de raíces transformadas son una fuente potencial de compuestos farmacéuticos (Sevon y Oksman-Caldentey., 2002). A. rhizogenes se ha utilizado para la introducción de genes en raíces de resistencia a nemátodos en caña de azúcar (Cai et al., 2003). De igual forma puede tener aplicación para procesos de fitoremediación con la producción de raíces capaces de remover uranio de soluciones acuosas (Eapen et al., 2003).
Transformación genética medida otras bacterias. Hasta hace muy poco Agrobacterium era el único genero conocido con la capacidad para transferir genes en las plantas. Sin embargo muy recientemente se ha demostrado que otras especies de bacterias incluyendo, Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium mieloti y Mesorhizobium loti pueden volverse competentes para integrar genes en las plantas si se les introduce un plasmido Ti desarmado y un vector binario. (Broothaerts, et al, 2005) Es posible que en el futuro, otras bacterias se conviertan en una alternativa para la transferencia de genes en las plantas.
Aunque los mecanismos de transferencia del ADN-T se han estudiado intensamente durante estas 2 últimas décadas, todavía hay algunos aspectos que es necesario aclarar, especialmente los mecanismos de integración del ADN-T en el genoma de la planta receptora y la interacción de las proteínas bacterianas transportadas a la célula vegetal con aquellas encargadas de realizar los procesos de recombinación, reparación y replicación del ADN celular. De otra parte, el genoma de la cepa de Agrobacterium tumefancies C58, antecesora de las cepas que se usan actualmente para transformación, esta publicado y analizado desde el 2001(Wood; Setubal y Kaul, 2001 y Goodner et al, 2001) Esta información sin duda ayudará enormemente a seguir dilucidando los mecanismos moleculares de la transferencia de genes realizado por este género de bacterias a las plantas.
Desde el punto de vista más práctico, con el descubrimiento reciente de que, al menos en algunos modelos, los inhibidores de síntesis de purinas mejoran considerablemente los porcentajes de transformación, se ha abierto un camino para mejorar considerablemente la eficiencia de los métodos disponibles y posiblemente se logre incrementar el número de especies (no necesariamente plantas) susceptibles a ser transformadas por Agrobacterium.
Han pasado 20 años desde que se lograron producir las primeras plantas transgénicas y es realmente impresionante la gran variedad de aplicaciones y usos que se la ha dado a esta tecnología. Aplicaciones tan exóticas de las plantas transgénicas como por ejemplo su utilización para la descontaminación de campos contaminados con diversos xenobióticos (Eapen et al., 2003; Gisbert et al., 2003; French et al., 1999) o para la producción de diversos metabolitos (Ayadi y Tremouillaux-Guiller, 2003; Moyano et al., 2003; Sevon y Oksman-Caldentey., 2002) no deja de sorprender gratamente. Se espera que en el futuro la humanidad aprenda a utilizar y convivir armónicamente con una tecnología que bien utilizada puede traer innumerables beneficios.
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