MATERIALES Y MÉTODOS ]]>
RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES AGRADECIMIENTOS BIBLIOGRAFÍA ESTIMATION OF OPERATION VARIABLES OF A BIOREACTOR WITH Azadirachta indica A. Juss. CELLS
Walter Muñoz Cruz1; Oscar Alejandro Vanegas Monterrosa2; Andrés Alberto Guzmán Rosas3; Jacqueline Capataz Tafur4; Rodrigo Alberto Hoyos Sánchez5 y Fernando Orozco Sánchez6
1 Ingeniero Químico. Laboratorio Centrolab. Calle 57 A No. 48-51. Medellín, Colombia. <wmunoz@unalmed.edu.co>
2 Ingeniero Químico. Director de Investigación y Desarrollo. ALSEC, S.A. Carrera 54 No. 79 B Sur 55. La Estrella, Colombia. <oscaralejandrov@yahoo.com>
3 Ingeniero Químico. Auxiliar de Investigación. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias, A.A. 3840, Medellín, Colombia.
4 Ingeniera Química. Auxiliar de Investigación. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias. A.A. 3840 , Medellín, Colombia. <jcapata@tifon.unalmed.edu.co>
5 Profesor Asociado. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias Agropecurias. A.A. 1779, Medellín, Colombia.<rhoyos@unalmed.edu.co> ]]>
6 Profesor Asistente. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias. A.A. 3840, Medelín, Colombia. <feorozco@unal.edu.co >
Recibido: Septiembre 15 de 2005; aceptado Abril 14 de 2006.
RESUMEN
Se estudiaron las variables de operación de un biorreactor de tanque agitado para el cultivo de células en suspensión de Azadirachta indica A. Juss. Se utilizó carboximetilcelulosa, CMC 0,7 % p/v, para estimar el coeficiente de transferencia de oxígeno, kLa, entre 120 – 400 rpm y entre 0,05 – 0,6 vvm, obteniéndose valores de 0,5 - 8,0 h-1. El kLa para suspensiones de A. indica en erlenmeyers fue de 0,6 - 1,2 h-1. Con los resultados anteriores se definieron las condiciones de operación del biorreactor y se evaluó el crecimiento de células de A. indica a 200 rpm y 0,2 vvm de aire, alcanzando 9,2 g cel secas/l. El crecimiento celular no fue limitado por el suministro de oxígeno. Los tamaños de aglomerados celulares cultivados en erlenmeyers con bafles agitados magnéticamente y en biorreactor fueron similares, pero menores que los obtenidos en erlemeyers con agitación orbital. El presente estudio establece parámetros para la operación de biorreactores con A. indica y confirma que los medios con CMC pueden utilizarse para estimar variables operacionales en biorreactores.
Palabras claves: biorreactores, Azadirachta indica, cultivo de células vegetales, kLa.
ABSTRACT
Operation variables of a stirred tank bioreactor were studied in order to culture cell suspension of Azadirachta indica A. Juss Carboximethylcelulose, CMC 0,7 % w/v, was used to estimate the coefficient of oxygen transfer, kLa, between 120 - 400 rpm and 0,05 - 0,6 vvm, obtaining values of 0,5 - 8,0 h-1. The kLa for suspension cultures of A. indica in erlenmeyers was 0,6 - 1,2 h-1. Based upon the previous results, the operation conditions of the bioreactor were defined and cell growth of A. indica was evaluated at 200 rpm and 0,2 vvm of air, reaching 9,2 g dry cell/l. Celular growth was not limited by dissolved oxygen. The sizes of cell agglomerates magnetically stirred in erlemeyers with bafles and in the bioreactor were similar, but smaller that those obtained in erlenmeyers with orbital agitation. The present study establishes parameters for operation of bioreactors with A. indica and confirms that CMC can be used to estimate operational variables in bioreactors.
Key words: bioreactors, Azadirachta indica, plant cell culture, kLa.
MATERIALES Y MÉTODOS ]]>
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
AGRADECIMIENTOS
BIBLIOGRAFÍA
Los cultivos de células vegetales son una alternativa atractiva para la producción de metabolitos secundarios de alto valor agregado. Estos cultivos han sido estudiados para la obtención de compuestos fitoquímicos que tienen actividad antimicrobial, antibiótica, insecticida o farmacéutica. Presentan amplias ventajas frente a la producción agrícola convencional ya que son independientes de la geografía, variaciones estacionales y ambientales, interferencias políticas y pueden suministrar un producto de calidad uniforme o pueden utilizarse para procesos de biotransformación (Kargi y Rosenberg 1987, Seki et al. 1997, Ramachandra y Ravishankar 2002). Se ha logrado incrementar considerablemente la productividad de los compuestos anteriores, estableciendo cultivos de suspensiones celulares en biorreactores (Tanaka 1987, Huang, Shen y Chan 2002, Ramachandra y Ravishankar 2002). Las suspensiones de células vegetales tienden a crecer en forma de aglomerados y aumentan la viscosidad del medio de cultivo; la presencia de estos aglomerados crea cultivos celulares altamente densos que impiden el paso de nutrientes y de oxígeno, interrumpiendo el desarrollo normal de las células. En la operación con células a nivel industrial es necesario agitar y airear, sometiendo así a las células a estrés hidrodinámico el cual también afecta su normal crecimiento. Otros factores decisivos en el cultivo de suspensiones celulares, son las características operacionales y de diseño de los biorreactores, dimensiones, sistema de aireación, etc. y en especial el tipo de agitador, de gran influencia en el crecimiento celular y en la formación de algunos productos de interés (Tanaka 1987, Hooker, Lee y Gynheung 1989, Pepin et al. 1995). Así, trabajos de este tipo exigen el estudio de la respuesta biológica de las células en situaciones de estrés hidrodinámico (Scragg, Allan y Lekie 1988, Yokoi et al. 1993, Meijer et al. 1994, Tanaka 2000). Debido a los altos costos de las suspensiones de células vegetales, algunas investigaciones pueden realizarse utilizando medios sintéticos. El uso de soluciones de carboximetilcelulosa (CMC) como sustituto del medio celular se basa en similitudes encontradas en otras investigaciones (Wang y Zhong 1996). Estas soluciones son de bajo costo, fácil manipulación y permiten obtener viscosidades constantes y mayores a las de las suspensiones vegetales (Wang y Zhong 1996, Doran 1999).
Las suspensiones celulares se comportan como fluidos altamente pseudoplásticos, en concentraciones desde 9 hasta 13 g/l en peso seco, al igual que el CMC 0,7 % p/v; las propiedades reológicas de estas soluciones ya han sido evaluadas y comparadas (Tanaka 1987, Wang y Zhong 1996).
La especie Azadirachta indica produce importantes metabolitos secundarios con actividad antialimentaria y biopesticida sobre una amplia gama de insectos (Parrota y Chaturvedi 1994). La producción de metabolitos de células vegetales se ha logrado por medio de cultivos celulares en recipientes agitados y reactores (Kearney, 1994, Kuruvilla, Komaraiah y Ramakrishna 1999). En la presente investigación se estimó el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, kLa, en diferentes condiciones de operación: un biorreactor agitado usando un medio sintético de CMC y erlenmeyers con suspensiones celulares de A. indica. Además, se comparó el tamaño de los aglomerados con relación al crecimiento celular de A. indica desarrollado en erlenmeyers y en biorreactor.
MATERIALES Y MÉTODOS
Formación de callos y suspensiones celulares. Se formaron callos friables a partir de hojas de A. indica sembradas en un medio de cultivo compuesto con sales de Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962), IBA 4,0 mg/l, BAP 1,0 mg/l, glicina 2 mg/l, vitaminas, sacarosa 30 g/l y phytagel 1,75 g/l, con un pH 5,8 (Kearney 1994). Para el establecimiento de las suspensiones celulares se usó el mismo medio que para la obtención de callos pero sin phytagel. Las suspensiones se conservaron en oscuridad a 25 °C y agitación continua sobre un agitador orbital a 120 rpm. Los medios de cultivo se esterilizaron en una autoclave a 120 °C durante 20 minutos.
]]> Cinética de crecimiento. Las curvas de crecimiento en erlenmeyers y biorreactor fueron construidas en un periodo de 30 días y los experimentos se realizaron por duplicado. Se evaluó el crecimiento mediante la determinación de peso seco de la biomasa contenida en 10 ml de medio, secando durante 24 horas a 60 ºC (Torres, 1989). La curvas de crecimiento construidas para las suspensiones celulares se modelaron en su fase exponencial para hallar el tiempo de duplicación de las células (td) y la velocidad específica de crecimiento (m). La ecuación que describe esta etapa es:
X: Concentración de biomasa en la fase exponencial (g célula seca /l).
Xo: Concentración de biomasa al iniciar la fase exponencial (g célula seca /l).
m: Velocidad específica de crecimiento (día-1).
t: Tiempo transcurrido en la fase exponencial (días).
El tiempo de duplicación se obtiene de la relación td = ln2/µ (Duarte, 1998).
Características del biorreactor. Se utilizó un biorreactor de7 litros (Applikon) con un volumen de trabajo de 2,5 litros. El diámetro interno del tanque era de 0,16 m, se empleó un impulsor de 0,048 m de diámetro del tipo propela marina, 3 bafles de 0,009 m de ancho y un aireador poroso con 0,01 m de diámetro.
Coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno. Se realizaron los experimentos para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno, kLa, tanto en erlenmeyers con suspensiones celulares como en biorreactor con CMC 0,7 % p/v. Se estudió el efecto de la velocidad de agitación, el flujo de aire y sus posibles interacciones sobre el kLa mediante un diseño factorial de tres niveles y dos factores (32). Se realizó el experimento con dos repeticiones, para calcular el error, con un orden aleatorio, para un total de 18 ensayos. Así, se seleccionaron las velocidades de agitación de 120, 250, 400 rpm y aireación de 0,05; 0,10 y 0,60 vvm. La transferencia de oxigeno fue determinada por el método dinámico desgaseando (gassing out), en el cual el oxigeno primero fue desplazado del medio empleando nitrógeno gaseoso, luego la fase gaseosa sobre la superficie líquida se reemplazó por aire (no se burbujeó dentro del recipiente) y para asegurar que las fases gaseosa y líquida tuvieran un buen contacto, se agitó magnéticamente la fase líquida. Luego se midió el oxígeno disuelto en la fase líquida. Para esto se emplearon erlenmeyers de 500 ml cubiertos con algodón; el volumen de trabajo fue de 100 ml los cuales se inocularon conservando una relación 1:3. En el biorreactor se empleó el mismo método a diferencia de que el ingreso de aire se hizo burbujeando (Van Suijdam, Kossen y Joha 1978). El valor de kLa fue calculado como la pendiente de la gráfica ln [1 – C/100] vs tiempo, siendo C el porcentaje de O2 disuelto en la solución.
]]> Tamaño de agregados celulares. Para estudiar el efecto de la agitación sobre el tamaño de los aglomerados, se comparó el tamaño de suspensiones incubadas en erlenmeyers en un agitador orbital, con suspensiones incubadas en erlenmeyers con bafles y agitadas magnéticamente usando una barra recubierta de teflón, ambas a 120 rpm. Se midió el tamaño de los aglomerados mediante una serie de tamices con tamaños de malla 100, 60, 50, 40, 14 y 8 equivalentes a 149, 250, 297, 420, 840, 1410 y 2380 µm respectivamente (United States Pharmacopeia Convention 2002). Una vez tamizada la suspensión, se lavó la biomasa con 500 ml de agua destilada y luego fue secada a una temperatura de 60 °C durante 24 horas. Los resultados se presentan como un porcentaje del peso total seco obtenido de células. Estos resultados se compararon con observaciones realizadas al cultivo en el biorreactor.
Coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno. La Figura 1 presenta los valores de kLa promedios para el medio sintético en el biorreactor. Mediante el análisis de varianza del kLa, debido a los factores flujo de aire y velocidad de agitación, se determinó que la velocidad de agitación, el flujo de aire y la interacción entre estos dos factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre esta variable respuesta, con un nivel de confianza del 99 % (**). La interacción puede apreciarse de la siguiente manera: a bajos niveles de aireación, la velocidad de agitación tiene poco efecto sobre el kLa y a baja velocidad de agitación, la aireación tiene poco efecto sobre esta respuesta, y viceversa en los niveles altos.
Figura 1. Valores promedios de kLa para el medio con CMC 0,7 % p/v en un biorreactor agitado de 7 l.
La Figura 2 presenta los valores de kLa para las suspensiones celulares a diferentes concentraciones de biomasa cultivadas en erlenmeyer y se observa la tendencia general del kLa a disminuir con el aumento de la concentración celular. Los valores mínimos de kLa determinados a nivel de erlenmeyer con suspensiones de A. indica (0,6 h-1), son próximos a los valores de kLa determinados en la solución de CMC en biorreactor a 0,05 vvm, dando resultados acordes con el de una suspensión celular con concentraciones entre 16 y 18 g células secas/l. Los valores de kLa en flujos de aire de 0,05 y 0,10 vvm y velocidades inferiores a 250 rpm fueron muy similares a los valores de kLa obtenidos en erlenmeyers, Figura 2 (0,6 - 1,2 h-1).
Figura 2. Variación de kLa en cultivos de células en suspensión de A. indica, en erlenmeyers con agitación orbital a 120 rpm.
Estos resultados concuerdan cuando se opera a flujos inferiores a 0,10 vvm y 100 rpm para soluciones de CMC de iguales características (Wang y Zhong 1996). El orden de magnitud de los resultados en CMC fue similar al obtenido para los cultivos de suspensiones celulares de Stizolobium hassjoo Piper & Tracy (Huang, Shen y Chan 2002), Nicotiana tabacum L., Cudrania tricuspidata (Carr.) Bur. ex Lavalle. (Doran 1999) y Taxus chinensis (Pilg.) (Zhong et al. 2002) en biorreactores de 2,5 l a 5,0 l. A 400 rpm se observa que es mayor el incremento de kLa para pequeños cambios en el flujo de aire desde 0,05 a 0,1 vvm, esto sugiere que se podría mantenerse un cultivo celular a velocidades mayores de agitación con bajos flujos de aire. Se ha encontrado que las células de Taxus chinensis son fuertemente afectadas de manera negativa por altas velocidades de aireación (0,2 y 0,4 vvm y se logró obtener mayor concentración de biomasa a 0,05 vvm, y una velocidad específica de crecimiento mayor (0,082 d-1) conservando los niveles de oxígeno disuelto superiores al 25 % (Pan, Wang y Zhong 2000). Los niveles más altos en concentración de biomasa y del aminoácido L-3,4-dihidroxifenilalanina, L-DOPA, se obtuvieron en suspensiones de Stizolobium hassjoo a 0,06 vvm, a la vez que el efecto de un incremento en la velocidad de agitación no fue tan significativo en la producción de biomasa y del metabolito (Huang, Shen y Chan 2002). A velocidades de flujo tan bajas como 0,05 vvm, no se logró romper la resistencia a la difusión de oxígeno en un medio altamente viscoso como la solución de trabajo de CMC. Esto podría explicar la tendencia casi horizontal de esta línea (0,05 vvm) en la Figura 1.
]]> Cinéticas de crecimiento. La Figura 3 presenta la curva de crecimiento de A. indica en erlenmeyers. La velocidad específica de crecimiento en la fase exponencial fue de 0,09 día-1 y el tiempo de duplicación correspondiente de 7,7 días. Se alcanzó una concentración celular de 4,7 g células secas/l.
Figura 3. Curva de crecimiento de suspensiones celulares de A. indica en erlenmeyers con agitación orbital a 120 rpm.
Comparando las Figuras 1 y 2, y con el propósito de garantizar un adecuado suministro de oxígeno, en cuanto a la capacidad de transferencia de oxígeno (kLa), se seleccionaron las siguientes condiciones de operación para la fermentación en el biorreactor: 120 rpm - 0,4 vvm de aire y 200 rpm - 0,2 vvm. Estas condiciones de operación corresponden a un valor aproximado de kLa de 1,5 h-1 usando el medio sintético, es cercano al mayor valor de kLa evaluado a nivel de erlenmeyers para suspensiones de células vegetales y con él se esperaba que el crecimiento celular no fuera limitado por poca disponibilidad de oxígeno disuelto debido a un bajo coeficiente de transferencia de oxígeno. Sin embargo en las primeras condiciones (120 rpm y 0,4 vvm) se presentó una gran sedimentación de los aglomerados celulares y sólo se incrementó la biomasa 1,5 veces durante el cultivo (datos no mostrados). Esto indica que para la operación del biorreactor, además del kLa, debe garantizarse una adecuada dispersión de sólidos y un suficiente oxígeno disuelto para el crecimiento celular. Adicionalmente, el flujo de aire usado pudo producir un arrastre de metabolitos gaseosos como el CO2 y el etileno, los cuales juegan un papel importante en el metabolismo de las células vegetales (Pan, Wang y Zhong 2000, Huang, Shen y Chan 2002). Los resultados obtenidos para la operación del biorreactor a 200 rpm y 0,2 vvm se muestran en la Figura 4. Debido a que no se disponía de un electrodo de oxígeno autoclavable, se hizo una medición del sustrato (azúcares reductores) para evaluar si el crecimiento era limitado por el sustrato o por otra variable en el cultivo. Así, se observó que el crecimiento se detuvo cuando se agotó el sustrato, indicando esto, que el oxígeno no fue el factor limitante para el crecimiento celular. En estas condiciones de operación se alcanzó una concentración de biomasa de 9,2 g células secas/l, la velocidad específica de crecimiento en la fase exponencial fue de 0,18 día-1 y el tiempo de duplicación correspondiente de 3,8 días.
Figura 4. Cinética de crecimiento y consumo de sustrato de suspensiones celulares de A. indica en biorreactor agitado a 200 rpm y 0,2 vvm.
No es claro porqué se obtuvo menor crecimiento en erlenmeyer con respecto al biorreactor, ya que debido al estrés hidrodinámico se esperaría lo contrario. El menor crecimiento a nivel de biorreactor con respecto a erlenmeyers se ha reportado en diferentes cultivos como Beta vulgaris L. (Rodríguez et al. 2004) o Taxus chinensis (Pan, Wang y Zhong 2000). El poco crecimiento de A. indica en erlenmeyer probablemente se debió a la insuficiente adaptación de las células al medio líquido. Por el contrario, el material biológico usado en los ensayos del biorreactor tenía mayor edad y una mejor adaptación a la fase líquida. Este fenómeno se ha observado en otros cultivos; así, suspensiones de E. cinerea requirieron inóculos de seis meses de edad antes de adaptarse completamente al medio de cultivo líquido (Orozco, Hoyos y Arias 2002). Otros investigadores han alcanzado concentraciones de biomasa entre 5,5 y 13,0 g células secas/l, en medios dosificados con kinetina y 2,4 D y variando el contenido de fósforo y nitrógeno en el medio de cultivo (Raval et al, 2003), pero no especifican las características morfológicas o la edad de los cultivos.
Tamaño de agregados celulares. La Figura 5 presenta el tamaño de los aglomerados celulares en diferentes condiciones estudiadas. Los resultados se presentan en porcentaje del peso seco total obtenido. Se observa que las suspensiones agitadas magnéticamente en erlenmeyers con bafles, tuvieron tamaños de agregados significativamente menores. Estos alcanzaron una concentración de 2,47 g células secas/l.
Figura 5. Tamaño de agregados celulares de A. indica, 16 días de cultivo en biorreactor, 25 días en erlenmeyers con agitación orbital y con agitación magnética y bafles. 120 rpm, 25ºC y oscuridad.
CONCLUSIONES
Las soluciones de CMC pueden ser utilizadas para estudiar variables operacionales de un biorreactor, como kLa, flujo de aire, velocidades de agitación o tiempo de mezclado en biorreactores. Utilizando esta solución, se mostró que la velocidad de agitación y el flujo de aire tuvieron un efecto significativo sobre el kLa y se propusieron algunas condiciones de operación de un biorreactor de tanque agitado para cultivar células de A. indica. A 200 rpm y flujo de aire 0,2 vvm se alcanzó una concentración celular de 9,2 g células secas/L. Sin embargo, el kLa no debe ser el único criterio a tener en cuenta en las estimación de variables de operación de un biorreactor y también debe considerarse la concentración de oxígeno disuelto, la sedimentación celular y el estrés hidrodinámico. Además, los aglomerados de las suspensiones celulares de A indica mostraron ser sensibles al estrés generado por la agitación y la aireación.
Los autores expresan su agradecimiento a Luisa Fernanda Quintero Cardona, por su apoyo en los experimentos realizados y a los Laboratorios de Bioconversiones y de Crecimiento y Desarrollo de las Plantas de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín.
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