ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

ACTIVIDAD ANTAGÓNICA DE TRICHODERMA ASPERELLUM (FUNGI: ASCOMYCOTA) A DIFERENTES TEMPERATURAS

ANTAGONIST ACTIVITY OF TRICHODERMA ASPERELLUM (FUNGI: ASCOMYCOTA) AT DIFFERENT TEMPERATURES

Harold A. Vargas-Hoyos¹; Ever A. Rueda-Lorza²; Elizabeth Gilchrist-Ramelli³

2 Corporación para Investigaciones Biológicas, Unidad de Fitosanidad y Control Biológico. Medellín (Antioquia), Colombia. arueda@cib.org.co.

3 Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia (Sede Medellín). Medellín (Antioquia), Colombia. elygilchrist@hotmail.com.

Recibido: noviembre 2011. Aceptado: mayo 2012.

Resumen

El género Trichoderma (Fungi: Ascomycota: Sordariomycetes: Hypocreaceae) contiene especies con gran capacidad antagónica. Se ha determinado a la temperatura puede ser un factor limitante para el crecimiento de dichas especies. La evaluación in vitro puede sugerir su desempeño en campo, lo que permite evidenciar aislamientos viables para el uso en control biológico. En este trabajo se evaluó el efecto de la temperatura sobre el crecimiento y la actividad antagónica de 27 aislamientos de Trichoderma spp. sobre Rhizoctonia sp. (Fungi: Agaricomycetes) y Colletotrichum sp. (Fungi: Sordariomycetes). De ellos, 16 y 9 presentaron inhibición ≥ 70% contra Rhizoctonia sp. y Colletotrichum sp., respectivamente. Los aislamientos T46, T84, T92 y T109 alcanzaron inhibición ≥75% para ambos fitopatógenos. Los aislamientos T46 y T109 fueron evaluados por su antagonismo frente a Rhizoctonia sp. a las temperaturas: 4, 10, 15, 20, 25, 30 °C. A excepción de 4 °C, en todas las temperaturas evaluadas, la inhibición del crecimiento del fitopatógeno fue ≥ 75%. A 30 °C, ambos antagonistas inhibieron el crecimiento de Rhizoctonia sp. T46 en un 94% y T109 en un 95%. Se demostró actividad biológica en todas las temperaturas, confirmando el potencial antagónico de este microorganismo.

Palabras clave: antagonismo in-vitro, temperatura, Colletotrichum spp., Rhizoctonia spp., Trichoderma spp.

Abstract

The genus Trichoderma (Fungi: Ascomycota: Sordariomycetes: Hypocreaceae) contains species with high antagonistic capacity. It has been determined that the temperature can be a limiting factor for growth of these species. Evaluation in vitro may suggest their field performance, allowing evidence of viable isolates for use in biological control. In this paper, 27 isolates of Trichoderma spp. were assayed using a dual culture against Rhizoctonia sp. (Fungi: Agaricomycetes) and Colletotrichum sp. (Fungi: Sordariomycetes). From those, 16 and 9 showed an inhibition ≥ 70% against Rhizoctonia sp. and Colletotrichum sp., respectively. The isolates T46, T84, T92, and T109 achieved an inhibition ≥ 75% for both phytopathogens. These isolates were submitted to different temperatures: 4, 10, 15, 20, 25, and 30 °C in order to evaluate their antagonism against Rhizoctonia sp. With the exception of 4 °C, for every temperature assayed the inhibition in growth of the phytopathogen was ≥ 75%. For 30 °C both antagonists inhibited the growth of Rhizoctonia sp.; T46 at 94% and T109 at 95%. Biological activity was shown for all the temperatures, confirming the antagonistic potential of this microorganism.

INTRODUCCIÓN

Las especies del género Trichoderma (Fungi: Ascomycota: Sordariomycetes: Hypocreaceae) están ampliamente distribuidas en el mundo (De Respinis et al. 2010). Dichas especies desarrollan papeles destacados en la ecología microbiana; se han catalogado como simbiontes de plantas (Harman et al. 2004), parásitos de fitopatógenos (Benítez et al. 2004, Vinale et al. 2008) y promotoras de crecimiento vegetal (Chacón et al. 2007, Tarango et al. 2009). Por tal motivo, se considera a estos microorganismos como necesarios en la dinámica funcional del suelo.

Como la mayoría de organismos vivos, los hongos se ven afectados por los cambios en las condiciones ambientales, que dificultan su establecimiento y desarrollo (Hjeljord et al. 2000). En algunas situaciones se han descrito adaptaciones por parte de los microorganismos para sobrellevar las condiciones adversas, lo que ha resultado en características propias que les permiten cumplir exitosamente su ciclo de vida (Zak y Wildman 2004). Para los hongos empleados en el biocontrol no se describe un comportamiento igual en todos los casos, dado que cambios en las condiciones ambientales presentes en los sistemas agrícolas, puede reflejarse en la falta de efectividad al momento de controlar enfermedades de las plantas.

A la fecha se han identificado y clasificado más de cien especies de Trichoderma (Druzhinina et al. 2006). Lo cual evidencia la importancia de este microorganismo en el área de la micología y en especial del control biológico.

Las pruebas de antagonismo in vitro han sido ampliamente registradas y reconocidas, permiten evaluar la velocidad de colonización de microorganismos en un medio de cultivo particular en relación al enfrentamiento directo con un competidor. Por lo cual se convierte en una herramienta de primera elección para conocer la actividad biológica de aislamientos antagonistas.

En general, la mayoría de especies del género Trichoderma se consideran mesófilas, la baja temperatura y el clima seco pueden llegar a influir negativamente en su actividad (Kredics et al. 2003, Samuels 2006). Según Zak y Wildman (2004), se consideran condiciones ambientales estresantes o adversas cuando los microorganismos son sometidos a situaciones que difieren de las denominadas ''ideales'' de crecimiento, bien sea en el laboratorio o en el campo. El efecto destacado de la temperatura en la fisiología del crecimiento de los hongos se evidencia por la inhibición en la elongación de la hifa, la disminución en: la germinación de las conidias (Santamarina y Rosello 2006) y de la formación del tubo germinal (Kredics et al. 2003), por ello se ha considerado este factor como limitante en el desarrollo de los microorganismos.

Por todo esto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antagónica de 27 aislamientos de Trichoderma spp. contra hongos fitopatógenos y evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad antagónica de algunos aislamientos seleccionados, con el fin de obtener aislamientos candidatos a realizar evaluaciones en condiciones de campo.

MATERIALES y MÉTODOS

Reactivación y mantenimiento de los aislamientos de Trichoderma asperellum y los hongos fitopatógenos Rhizoctonia sp. y Colletotrichum sp. Se reactivaron los aislamientos de Trichoderma spp., Rhizoctonia sp. y Colletotrichum sp. facilitados por la unidad de Fitosanidad y Control Biológico, de la Corporación para Investigaciones Biológicas (F y CB-CIB), Medellín. Los aislamientos de Trichoderma spp. evaluados fueron: T18, T20, T21, T22, T23, T24, T25, T26, T27, T29, T30, T38, T46, T57, T58, T73, T74, T75, T79, T83, T84, T86, T88, T90, T92, T109, T110 (tabla 1), descritos anteriormente por Hoyos-Carvajal et al. (2009) como estimuladores de crecimiento vegetal en frijol. Los aislamientos se reactivaron en medio de cultivo con agar granulado y extracto de suelo, se cultivaron durante 7 días a 25 ± -2 °C y se conservaron en medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) a 4 °C, para su utilización se replicaron en igual medio y se incubaron a 25 ± -2 °C.

Pruebas de antagonismo in vitro. Esta evaluación se realizó modificando la metodología de Asran-Amal et al. (2010), se enfrentaron los diferentes aislamientos de Trichoderma spp. contra Rhizoctonia sp. (aislado de cultivo de papa) y Colletotrichum sp. (de la colección de fitopatógenos de la F y CB-CIB), según la técnica de cultivo dual; en una caja de Petri con medio PDA, discos de 5 mm de diámetro provenientes de cultivos de 7 días de crecimiento en PDA, se sembraron en sentido opuesto y a una distancia de 3 cm. Se realizaron tres réplicas por cada enfrentamiento y se dejaron en incubación a 25 ± -2 °C con un fotoperiodo de 12 h:12 h, durante 4 días. Para los controles, se sembró un disco de 5 mm de diámetro sin antagonista. Después del periodo de incubación se midió el radio de crecimiento micelial expresado en porcentaje de inhibición de crecimiento, calculado según la siguiente ecuación:

PI = (RL - Ri)/RL x 100, (ecuación 1)

Donde, PI (porcentaje de inhibición): proporción del radio de crecimiento afectado por el antagonista; RL (radio libre): radio de crecimiento micelial del patógeno en el control; Ri (radio influenciado): radio de crecimiento micelial del patógeno en presencia de Trichoderma spp. El experimento se repitió 2 veces en el tiempo.

Observaciones microscópicas. Se obtuvieron imágenes microscópicas de las hifas de los hongos sobre los cuales se evaluó la actividad antagónica con el fin de relacionarlo con los hallazgos macroscópicos, para ello se utilizó un microscopio Nikon Eclipse E200 el cual tenía adaptada una cámara digital de alta definición Nikon DS-Fi1.

Evaluación del efecto de la temperatura sobre la actividad antagónica de los aislamientos de Trichoderma sp. contra Rhizoctonia sp. De los aislamientos evaluados como antagonistas de Rhizoctonia sp. y Colletotrichum sp., se seleccionaron los dos que mejor actividad antagónica in vitro mostraron contra ambos fitopatógenos, y fueron T. asperellum T46 y T109. Cultivos en PDA de éstos aislamientos se incubaron a diferentes temperaturas: 4, 10, 15, 20, 25, 30 °C. Para cada temperatura, se realizó una curva de crecimiento hasta el día en el que el cultivo obtuvo el máximo crecimiento permitido en la caja de Petri. Las pruebas de antagonismo in vitro se realizaron según las modificaciones de la metodología de Asran-Amal et al. (2010), descritas anteriormente pero bajo las diferentes condiciones de temperatura. Se calculó la tasa de crecimiento con la ecuación de la pendiente de la curva tomando todos los puntos de medición (ecuación 1). El experimento se repitió 2 veces en el tiempo.

Análisis estadístico. Los tratamientos se compararon utilizando un análisis de varianza (ANOVA) seguida de la comparación de medias de Tukey. Se realizaron evaluaciones de homocedasticidad y normalidad de los datos utilizando las pruebas de Levene y Kolmogorov-Smirnov, respectivamente.

Pruebas deantagonismoin vitro. Los aislamientos de Trichoderma spp. mostraron antagonismo contra los hongos fitopatógenos Rhizoctonia sp. y Colletotrichum sp. Para Rhizoctonia sp., 16 de los 27 aislamientos de Trichoderma spp. evaluados presentaron un porcentaje de inhibición (PI) superior al 70%; de los cuales; los aislamientos T22, T46, T75, T84, T92 y T109 presentaron un PI > a 80%; los aislamientos T20, T21, T38 y T79 un PI > a 75%; y los aislamientos T24, T25, T29, T57, T58 y T90 un PI > a 70%. El aislamiento con menor actividad antagónica fue el T30 con un PI de 55,5% (figura 1).

Para Colletotrichum sp., 9 de los 27 aislamientos de Trichoderma evaluados presentaron un porcentaje de inhibición (PI) superior al 70%. Los aislamientos T46, T84, T92, T109 y T110 presentaron un PI > a 75%; y los aislamientos T26, T83, T86 y T88 presentaron un PI > a 70%. El aislamiento con menor actividad antagónica fue el T23 con un PI de 25% (figura 2).

Los aislamientos: T46, T84, T92 y T109 obtuvieron un PI > a 75% para ambos fitopatógenos, todos correspondientes a T. asperellum (tabla 1).

Se destaca el micoparasitismo de T. asperellum sobre el micelio del fitopatógeno Rhizoctonia sp. (figura 3).

Evaluación del efecto de la temperatura sobre la actividad antagónica de los aislamientos de Trichoderma sp. contra Rhizoctonia sp. Los aislamientos de Trichoderma asperellum evaluados presentaron actividad antagónica en todas las temperaturas evaluadas. Existieron diferencias significativas (p < 0,05) al comparar el crecimiento de Rhizoctonia sp. con y sin la presencia de los aislamientos T46 y T109 (figura 4). El tiempo de crecimiento de Rhizoctonia sp. para el control fue mayor en las temperaturas de 4 y 10 °C, 54 y 28 días después de sembrados, respectivamente. Para el resto de las temperaturas (15, 20, 25 y 30 °C) se realizó lectura hasta el día 8. A 25 °C fue la temperatura en la que más rápido se observó la colonización completa de la caja de Petri (día 6) (figura 4).

El crecimiento control de Rhizoctonia sp. fue significativamente (p < 0,001) diferente al crecimiento en los enfrentamientos con T46 y T109 (figura 5). En promedio, el porcentaje de disminución en la tasa de crecimiento (cm/ día) para Rhizoctonia sp. en presencia de los aislamientos de T. asperellum fue para 4 °C del 49%, para 10 °C del 84%, para 15 °C del 75%, para 20 °C del 90%, para 25 °C del 82% y para 30 °C del 95%. No se observaron diferencias significativas entre los aislamientos T46 y T109.

A excepción de 4 °C, en todas las temperaturas evaluadas el porcentaje de inhibición del crecimiento en Rhizoctonia sp. fue superior al 75% (figura 6).

A30 °C hubo diferencias altamente significativas (p < 0,001), donde los aislamientos T46 y T109 inhibieron el crecimiento del fitopatógeno en 94 y 95%, respectivamente. En la temperatura de 4 °C, la inhibición del crecimiento de Rhizoctonia sp. fue de 37% (T46) y 38% (T109) (figura 6).

Las pruebas de antagonismo in-vitro evidenciaron aislamientos de Trichoderma spp. con actividad inhibitoria del crecimiento contra hongos fitopatógenos (figuras 1 y 2; tabla 1). Dado que se realizó la técnica de cultivo dual, la rapidez de crecimiento del antagonista disminuyó las expectativas de sobrevivencia del fitopatógeno en el medio empleado. Pero como tal, no es una técnica que permita evidenciar la capacidad micoparasítica del antagonista (Hoyos-Carvajal et al. 2008b). En cambio, puede revelar la velocidad de colonización de un sustrato definido bajo condiciones particulares. En el momento de realizar la determinación de la actividad antagónica, imágenes microscópicas revelaron una interacción favorable a los aislamientos antagonistas al presentar enrollamiento del micelio de Trichoderma asperellum sobre el micelio del fitopatógeno (figura 3), esta evidencia da indicios de actividad micoparasítica que conlleva a la muerte del fitopatógeno (Sivakumar et al. 2000). Los aislamientos con mejor capacidad antagónica se obtuvieron de la especie T. asperellum, lo que coincide con reportes anteriores donde se resalta esta especie como importante controladora biológica (Benítez et al. 2004, Marcello et al. 2010). La evaluación realizada con Rhizoctonia sp. presentó mayor sensibilidad y menor variación en los resultados que la realizada sobre Colletotrichum sp. (figuras 1 y 2; tabla 1), el cual fue el criterio para seleccionar el primer fitopatógeno para las siguientes evaluaciones. De los 27 aislamientos de Trichoderma spp. evaluados frente a Rhizoctonia sp. y Colletotrichum sp., 25 presentaron un porcentaje de antagonismo mayor o igual a 70% para algún fitopatógeno. Contra Rhizoctonia sp. los aislamientos T21, T22 y T92 alcanzaron un porcentaje de antagonismo de 80%; T46, T75 y T84 alcanzaron un porcentaje de antagonismo de 81%, y se destaca el aislamiento T109 que logró la mayor inhibición con 82% (figura 1), esto coincide con lo publicado por Hoyos-Carvajal et al. (2008a), donde este aislamiento obtuvo una clasificación de ''1'' en el grado de micoparasitismo contra Rhizoctonia solani Kühn y Sclerotioum rolfsii Sacc. De igual manera los aislamientos T46 y T84 se destacan por tener un alto grado de antagonismo in vitro sobre Sclerotinia spp. y Rhizoctonia spp. (Hoyos-Carvajal et al. 2008b). Este mismo trabajo resalta un grupo de T. asperellum que sobresale sobre el resto de las especies evaluadas, de tal manera que de 73 aislamientos evaluados, el 49% presenta actividad antagónica especifica y corresponde a aislamientos de esta especie, lo cual demuestra la alta prevalencia en toda la zona tropical y la capacidad de enfrentar microorganismos fitopatógenos.

Contra el fitopatógeno Colletotrichum sp. no se obtuvo porcentaje de antagonismo mayor o igual a 80%. El aislamiento T83 alcanzó un 74%, T84 y T92 alcanzaron un 75%, T109 y T110 alcanzaron un 76% y el mayor porcentaje de inhibición lo presentó el aislamiento T46 con un 78% (figura 2). Estas pruebas permitieron seleccionar los aislamientos que posteriormente fueron evaluados con diferentes regímenes de temperatura.

Los aislamientos de T. asperellum T46 y T109, toleraron un ámbito amplio (4 a 30 °C) de temperatura demostrando actividad antagónica en todas las temperaturas evaluadas, confirmando el potencial antagónico de este microorganismo. Esto coincide con el trabajo de Antal et al. (2000), quienes al evaluar el crecimiento de 360 cepas de Trichoderma spp. a 5 y 10 °C encontraron que el hongo puede tolerar estas temperaturas y presentar actividad antagónica contra Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, Pythium debaryanum y Rhizoctonia solani. En este mismo trabajo se registró la producción de estructuras de invasión (apresorios) a 10 °C y se hace referencia a trabajos previos donde se indica que este tipo de interacciones no son dependientes de la temperatura. De igual manera, Singh et al. (2009) evaluaron un grupo de hongos antagonistas con el fin de determinar la capacidad antagónica y de ''desplazamiento'' sobre el fitopatógeno Fusarium pseudograminearum en restos de cosecha de trigo, evaluaron 2 aislamientos de Trichoderma harzianum y observaron buena capacidad de crecimiento en todas las temperaturas excepto a 5 °C en PDA. Al realizar las evaluaciones de antagonismo y desplazamiento encontraron fuerte antagonismo en las temperaturas evaluadas y alto índice de desplazamiento entre 20 y 35 °C, lo cual evidencia el efecto de la temperatura en la capacidad antagónica y biológica de los aislamientos de T. harzianum.

En todas las temperaturas evaluadas, excepto 4 °C, la inhibición se presentó desde el primer día de lectura (figura 4), lo que evidenció la capacidad de Trichoderma asperellum para colonizar rápidamente el sustrato y ejercer control sobre el crecimiento de Rhizoctonia sp. Para 4 °C la inhibición se estableció a los 54 días para ambos aislamientos (figura 4). Esta cualidad se incrementó en las temperaturas altas (25 y 30 °C) (figura 5) y coincide con lo registrado por Schubert et al. (2009) quienes evaluaron varios rangos de temperatura para Trichoderma sp. encontrando mejor crecimiento en los medios de cultivo evaluados a 25 y 30 °C; así mismo determinaron una disminución en la tasa de crecimiento proporcional a la disminución de la temperatura. De igual manera Mukherjee y Raghu (1997), determinaron el rango óptimo de crecimiento para un aislamiento de Trichoderma sp. obtenido de esclerocios de S. rolfsii entre 25 y 30 °C, y encontraron un sobrecrecimiento de Trichoderma sp. al realizar enfrentamiento directo en medio de cultivo PDA.

Los resultados muestran que los aislamientos de Trichoderma asperellum T46 y T109, presentaron capacidad antagónica que se puede evidenciar en temperaturas desde los 4 hasta los 30 °C (figura 6), presentando diferentes velocidades de respuesta según la temperatura pero sin existir un cambio drástico en su comportamiento. Al relacionar los datos del porcentaje de inhibición y la tasa de crecimiento de Rhizoctonia sp. en presencia de T. asperellum a 30, 25, 20 y 15 °C, se evidenció efecto de la temperatura sobre la capacidad inhibitoria de los aislamientos de T. asperellum (figura 7), de tal manera, a menor temperatura se observó menor porcentaje inhibitorio y mayor tasa de crecimiento del fitópatogeno. La pendiente en ambos casos fue negativa y el R² fue de 0,9916 y 0,9933 para Rhizoctonia sp. enfrentada con T46 y T109, respectivamente, demostrando que la capacidad antagónica depende en gran medida del desarrollo del antagonista y esta a su vez puede llegar a ser influenciada por factores presentes en diferentes ambientes donde concurran antagonistas y patógenos.

CONCLUSIONES

En el ensayo de antagonismo in vitro realizado con T. asperellum sobre Rhizoctonia sp. a 25 °C, se observó la capacidad micoparasítica del hongo antagonista, evidenciada por la habilidad de realizar ''enrollamiento'' sobre la hifa del fitopatógeno. Cuatro aislamientos de T. asperellum (T46, T84, T92 y T109) presentaron los mayores porcentajes de inhibición del crecimiento sobre ambos fitopatógenos, consolidando esta especie como buena antagonista.

Los aislamientos de T. asperellum pueden crecer en un amplio rango de temperaturas, lo cual demuestra su capacidad de adaptación a condiciones ambientales cambiantes, el mayor porcentaje de inhibición de T. asperellum sobre Rhizoctonia sp. estuvo entre 20 y 30 °C, sugiriendo que la temperatura óptima de crecimiento para el antagonista está en ese intervalo. La temperatura juega un papel determinante en el crecimiento y capacidad antagónica de T. asperellum, dado que a bajas temperaturas se disminuye la velocidad de elongación de la hifa y la obtención de nutrientes, por lo tanto se retardan todos lo procesos metabólicos involucrados en el control de fitopatógenos.

AGRADECIMIENTOS

A la Corporación para investigaciones biológicas por facilitar del material biológico. Este trabajo se realizó gracias al soporte financiero de Colciencias: Proyecto # 15959-Contrato 298 de 2008 y a la Dirección de Laboratorios de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín.

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