ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

doi: 10.17533/udea.acbi.v38n104a07

Protección celular antioxidante y respuesta adaptativa inducida por estímulos oxidativos crónicos

Antioxidant cellular protection and adaptive response induced by chronic oxidative stimuli

Gloria A. Santa-González^1,3; Mauricio Camargo^1,2

1 Grupo Genética, Regeneración y Cáncer, SIU-UdeA, Lab. # 432. Universidad de Antioquia. A. A. 1226. Medellín (Antioquia), Colombia.

2 Docente, Instituto de Biología, Universidad de Antioquia. A. A. 1226. Medellín (Antioquia), Colombia. mauricio.camargo@udea.edu.co

Correo electrónico: 3. gloria.santa@udea.edu.co.

Recibido: marzo 2015; aceptado: noviembre 2015.

Resumen

La adaptación es un importante mecanismo por el cual las células y los organismos responden a retos ambientales y a cambiantes necesidades funcionales. Para lograrlo, las células integran cambios en el fenotipo, actividad metabólica, expresión génica y función celular, que deben coordinarse adecuadamente para mantener la viabilidad ante estímulos nocivos, como es el caso del reto ante un exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS). En este estudio, se evaluó la hipótesis que pulsos crónicos y repetitivos con peróxido de hidrógeno (H₂O₂), pueden activar respuestas celulares que resultan en adaptación a estrés oxidativo. Para probar esto, se estableció un modelo in vitro, donde las células de origen mioblastoide C2C12, fueron expuestas a 5 mU/ml de la enzima glucosa oxidasa que durante breves pulsos de 1 hora/día genera una concentración constante de 50 μM de H₂O₂ en el medio. Este régimen de tratamiento se extendió durante 7 días, tras los cuales se evaluaron los efectos sobre la morfología y viabilidad celular, el contenido de ADN mitocondrial, la acumulación de ROS mitocondrial y la expresión de genes de defensa antioxidante. Los resultados obtenidos apoyan la idea de que los estímulos prolongados, repetitivos y a bajas concentraciones de ROS, pueden actuar como moléculas de señalización induciendo procesos celulares que convergen en la adaptación al estrés oxidativo crónico.

Palabras clave: adaptación, defensa antioxidante, estrés oxidativo crónico, homeostasis.

Adaptation is an important mechanism in cells and organisms that allow them to respond to environmental challenges and changing functional demands. To accomplish these requirements, cells integrate modifications at different levels such as gene expression, metabolic activity, cellular functionality and phenotype. The orderly coordination of these changes is fundamental for cells to maintain viability despite a variety of harmful stimuli, such as the case of exceedingly concentrations of reactive oxygen species (ROS). In this study, we tested the hypothesis that chronic and repetitive stimuli with a mild concentration of hydrogen peroxide (H₂O₂) would activate cellular responses, resulting in adaptation. This was done confronting cell cultures to prolonged exposures of H₂O₂ obtained with glucose oxydase (GlucOx) added to the medium to generate a constant concentration of the oxidant (≈ 50 μM); this treatment protocol (1h/d) was extended during seven continuous consecutive days after which the following parameters were evaluated: cell morphology and viability, mitochondrial DNA content, mitochondrial ROS accumulation and antioxidant defense gene expression. These data further support the idea that exposure to continuous and low concentrations of ROS, could act as signaling molecules inducing cellular processes that converged toward adaptation to chronic oxidative stress.

Key words: adaptation, antioxidant defense, chronic oxidative stress, homeostasis.

INTRODUCCIÓN

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se producen continuamente como productos secundarios de ciertas vías metabólicas y por algunos sistemas específicos que están bajo fino control celular como procesos patológicos de inflamación (Mittal et al. 2014, Pluskota-Karwatka 2008) citoquinas, peroxisomas, xantina-oxidasa (XO), NADPH oxidasa (Holmstrom y Finkel 2014, Lemon et al. 2008) acetil-coA oxidasa y citocromos (D'Autréaux y Toledano 2007, Ji et al. 2004); y simultáneamente, las ROS son degradadas a través de varios mecanismos. Los procesos de generación y degradación de ROS generalmente se encuentran bajo un control celular riguroso manteniendo las concentraciones en bajo nivel (< 10^-8 M) (Boveris y Cadenas 2000, Chance et al. 1979, Lushchak 2011).

La regulación de los procesos celulares de producción y degradación de ROS es crítica para la supervivencia, incluyendo sensores de especies reactivas, transducción de señales y modulación de la maquinaria de transcripción y traducción. Varias evidencias indican que las ROS son mensajeros importantes en vías de señalización que conducen a la adaptación celular (Powers et al. 2010) y desempeñan un papel importante en la homeostasis redox de diferentes procesos celulares como el crecimiento, la diferenciación, la proliferación y la apoptosis (Crawford y Davies 1994, Evans et al. 2003, Kefaloyianni et al. 2006, Marinho et al. 2014) Sin embargo, la exposición excesiva a ROS puede surgir como consecuencia de cambios en el ambiente celular, la exposición a medicamentos o compuestos oxidantes, o la insuficiencia en los sistemas de defensa antioxidante y conducir a un estado conocido como ''estrés oxidativo'', en el cual se produce daño a macromoléculas tales como ADN, ARN, proteínas y lípidos (Barzilai y Yamamoto 2004, Evans et al. 2003, Kumar et al. 2005).

Los sistemas de respuesta a estrés oxidativo se activan gradualmente y son dependientes del tipo celular, del carácter espacio-temporal del estímulo, y del tipo y concentración de ROS (Bar-Shai et al. 2008, Crawford y Davies 1994, Evans et al. 2003, Kefaloyianni et al. 2006, Lushchak 2011). Entre los principales mecanismos moleculares activados por las ROS están los de defensa antioxidante como las glutatión peroxidasas (GPx), las peroxirredoxinas (TPX), las superóxido dismutasas (SODs) y la catalasa (CAT); además, se encuentran las vías de señalización mediadas por Keap1/Nrf2 (Osburn y Kensler 2008) y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs); los reguladores transcripcionales NF-κB (factor nuclear κB) y activador transcripcional 1 (AP-1) (Hirota et al. 1997, Ji et al. 2007, Zhang 2004); y el factor redox Ref- 1 (Evans et al. 2000, Fritz et al. 2003). Estas vías operan en forma coordinada y son críticas para que las células de mamífero afronten al estrés oxidativo.

De otro lado, se sabe que los estímulos continuos a bajas concentraciones de ROS, pueden inducir de manera directa la activación/desactivación enzimática y cambios en los niveles de expresión génica (Gomez-Cabrera et al. 2008, Luna-López et al. 2013, Pickering et al. 2013, Radak et al. 2005, Wiese et al. 1995). Este fenómeno está relacionado con el concepto de hórmesis, caracterizado como una particular relación respuesta-a-dosis, la cual describe que un fenómeno biológico adverso puede llegar a ser benéfico cuando es aplicado en bajos niveles (Calabrese 2015, Yu 2004). En este contexto, los radicales libres de oxígeno pueden ser considerados como benéficos a bajas dosis (Calabrese y Baldwin 2003, Ji et al. 2006, Radak et al. 2008, 2005).

Los resultados del presente trabajo, evidencian que estímulos crónicos repetitivos con H₂O₂ actúan como moléculas de señalización en células de mamífero, induciendo procesos celulares que incluyen: i) cambios morfológicos; ii) aumento del mtADN; y iii) modulación en los patrones de expresión génica. Esto resulta en un fenotipo de adaptación al estrés que hace a la célula significativamente más resistente a un eventual reto oxidativo mayor.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivos celulares. Se empleó la línea celular de origen mioblastoide C2C12 (CRL-1772, ATCC), mantenida en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 5%, penicilina 100 μg/ml y estreptomicina 100 μg/ml, e incubadas a 37 ºC en atmósfera húmeda y CO₂ al 5%.

Esquema de tratamientos. Para inducir la respuesta de adaptación, se realizaron tratamientos pro-oxidantes de manera intermitente y repetitiva; para ello, cada 24 h se adicionó glucosa oxidasa (GlucOx, G6641, Sigma) 5 mU/ ml para generar una concentración continua de 50 μM de H₂O₂ en el medio. Este régimen se mantuvo durante siete días como se ilustra en la figura 1.

Morfología celular. Después de los tratamientos, las células fueron sembradas en laminillas de vidrio estériles. Al día siguiente, fueron fijadas con paraformaldehído en buffer sucrosa (PFA-CBS) al 4% por 5 minutos, posteriormente, se lavaron tres veces con PBS y se montaron en portaobjetos con medio de montaje acuoso. Las células fueron observadas y fotografiadas con aumento de 128 X en estéreo microscopio Olympus SZX16.

Determinación de tamaño y granularidad medidos por citometría de flujo. Terminados los siete días de tratamiento pro-oxidante crónico, las células fueron fijadas con etanol frío al 70%, y posteriormente, incubadas con 100 μg/ml de RNasa (Sigma, R5000), marcadas con 100 μg/ml de yoduro de propidio (Sigma, P4170) y analizadas por citometría de flujo (Coulter Epics XL). Empleando los parámetros forward scatter (FSC) y side scatter (SSC) se determinó el tamaño y granularidad relativos de las células.

Contenido de ADN mitocondrial. El ADN genómico se extrajo y cuantificó usando un procedimiento automatizado (QIAcube System); el contenido relativo de mtADN se evaluó por RT-PCR como se describe en Furda et al. (2012) y Rooney et al. (2015).

Detección de ROS mitocondrial. Para cuantificar las ROS mitocondriales se empleó el fluorocromo MitoSOX^TM Red (M36008T, Life Technologies). Después del tratamiento, se tomaron ~ 5 x 10⁵ células y se resuspendieron en PBS; luego se les adicionó MitoSOX a una concentración final de 3 μM por 30 min, seguido de 2 lavados con PBS para eliminar el exceso de fluorocromo. Finalmente, se realizaron lecturas en citómetro de flujo Coulter Epics XL.

Perfil de expresión génica. Para evaluar los efectos a nivel transcriptómico de la exposición a largo plazo a H₂O₂, se realizó un análisis de microarreglos basados en RT-PCR. Brevemente, se extrajo ARN total usando Qiagen RNeasy Mini kit (74104, QIAGEN), el cADN se sintetizó mediante transcripción reversa con 250 ng de ARN total y oligo-dTs con el RT² first strand kit (330401, QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se empleó el RT² Profiler PCR Array Mouse Oxidative Stress and Antioxidant Defense (PAMM-065Z, QIAGEN) para evaluar 84 genes relacionados con defensa antioxidante, metabolismo de ROS y transporte de oxígeno. El microarreglo se procesó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se corrió en el termociclador BioRad C1000 con el sistema de detección CFX96. Los cambios relativos en la expresión génica se calcularon por el método ΔCt normalizado para los genes constitutivos incluidos en el microarreglo. Los datos se analizaron con el software SABiosciences PCR array data analysis.

Análisis estadístico. Todos los datos obtenidos representan los resultados de dos o tres experimentos independientes por grupo de tratamiento. Las pruebas t-Student y los análisis de varianza (ANOVA) se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Los valores p < 0,05 se consideraron como estadísticamente significativos. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM).

RESULTADOS

Tratamiento pro-oxidante crónico induce cambios en la morfología celular. La figura 2 muestra la morfología comparativa de las células control y las células expuestas a estímulos crónicos continuos con 50 μM de H₂O₂. En la figura 2A se muestra una fotografía representativa del análisis realizado por estereomicroscopía, donde se observa que los mioblastos no tratados están alargados, con forma fusiforme y ampliamente extendidos sobre la superficie de crecimiento; las células redondas y ligeramente adheridas al sustrato son mitóticas. La figura 2A también evidencia que después de la exposición crónica a H₂O₂ se observan varios cambios morfológicos: un importante porcentaje de la población celular tiene forma redondeada pero conserva la adherencia a la superficie de crecimiento, no se pierde el contacto entre las células y hay crecimiento en monocapa; aparentemente no hay lesiones en la membrana celular ni formación de vacuolas. Esto mismo pudo determinarse a través de análisis por citometría de flujo, donde se observa que el tamaño de las células con tratamiento oxidativo es significativamente mayor comparado con las células no tratadas (p = 0,009, figura 2B); adicionalmente, también hay una importante tendencia hacia el aumento de la complejidad celular en células con tratamiento pro-oxidante repetitivo (p = 0,0713, figura 2C).

Aumento del contenido relativo de ADN mitocondrial y disminución de la acumulación de ROS mitocondrial después del estímulo pro-oxidante. La mitocondria es una de las organelas más sensibles a agentes oxidantes; por ello se evaluó si el tratamiento crónico podía alterar su capacidad de replicación del ADN y los sistemas de detoxificación de ROS. La figura 4 muestra que 50 μM de H₂O₂ durante siete días contribuye significativamente al aumento de copias de mtADN (p < 0,0001), mientras que la concentración de ROS se ve reducida respecto a las células no tratadas (p = 0,1704).

Expresión diferencial de genes asociados con la respuesta a estrés oxidativo. Para determinar si el tratamiento pro-oxidante empleado, induce cambios en el patrón de expresión de genes de respuesta a estrés, se evaluaron 84 genes antioxidantes y relacionados con el metabolismo y transporte del oxígeno, a través de microarreglos basados en RT-PCR. Se calcularon los valores Ct para todos los genes, y posteriormente, se determinó el nivel de expresión relativo al de las células no tratadas.

Los resultados obtenidos para RT² Profiler PCR Array Mouse Oxidative Stress and Antioxidant Defense muestran que al final del protocolo de tratamiento pro-oxidante crónico hay expresión diferencial de diez genes; ocho fueron regulados positivamente (nivel de expresión > 1,5) y dos fueron regulados negativamente (nivel de expresión < 0,5) (figura 5, tabla 1).

DISCUSIÓN

Las adaptaciones celulares son respuestas funcionales y estructurales reversibles ante situaciones de estrés fisiológico y algunos estímulos patológicos. Estas respuestas, permiten alcanzar nuevos estados de equilibrio que permiten a las células sobrevivir y seguir funcionando (Kumar et al. 2005). Uno de los desafíos que afronta la célula constantemente es la acumulación de ROS como consecuencia de exposición a sustancias químicas, radiación, metabolismo y envejecimiento celular. De hecho, cuando aumenta la producción de ROS o los sistemas antioxidantes son ineficientes, se pueden inducir lesiones celulares relacionadas con múltiples procesos patológicos, incluidos el cáncer, el envejecimiento y algunos procesos degenerativos como el Alzheimer (Marteijn et al. 2014, Matsumura et al. 2015, Muñoz-Espín y Serrano 2014).

La célula solo puede disponer de un rango limitado de funciones y estructuras para hacer frente a una situación de estrés oxidativo; sin embargo, si el estímulo nocivo es crónico y repetitivo, la célula se puede adaptar a las necesidades fisiológicas para mantener el equilibrio redox (Kumar et al. 2005). Este estudio muestra evidencia sobre las exposiciones crónicas con bajas concentraciones de ROS que pueden inducir respuestas celulares, alterando la estructura celular y la expresión de genes nucleares específicos, para mantener la homeostasis y rescatar a las células del estrés.

Para establecer el modelo de adaptación a estrés oxidativo se emplearon las células C2C12, precursoras de fibras de miocardio, capaces de adaptarse a fuertes desequilibrios en el estado redox, y que representan un sistema experimental ideal para estudiar mecanismos activados durante la respuesta a estrés. Las células C2C12 poseen morfología mioblastoide característica de células musculares, crecimiento en monocapa (figura 2A) y tienen una duración de ciclo celular normal para células de mamífero; sin embargo, después del tratamiento crónico con H₂O₂, se evidencia un cambio en el tamaño, forma y granularidad de las células (figuras 2B y 2C). Uno de los mecanismos propuestos como reguladores en esta respuesta, involucra la estimulación de H₂O₂ a factores de crecimiento como VEGF y la subsecuente activación de las vías MAPK/ERK y PI3K que regulan la función y expresión de genes relacionados con el crecimiento y supervivencia celular (Cai 2005, Gough y Cotter 2011). Las observaciones de este estudio, muestran aumento en el tamaño celular, posiblemente relacionado con una hipertrofia compensatoria que se origina como mecanismo de respuesta inicial benéfica para minimizar el estrés, pero que al persistir en el tiempo puede desencadenar en muerte celular por apoptosis (Jain et al. 2015, Sabri et al. 2003).

Para determinar el efecto del estímulo oxidativo sobre la viabilidad, se empleó la doble marcación con anexina V y 7-AAD; la figura 3 muestra que con relación a las células control, el tratamiento pro-oxidante crónico indujo un aumento de la población positiva para anexina V (7,8 versus 14,08%, p = 0,0103). La muerte celular inducida por ROS se ha asociado principalmente a necrosis, pero se ha evidenciado que también pueden iniciar apoptosis a través de una compleja red de mecanismos que involucran daño mitocondrial, alteración en la homeostasis del calcio y daño en el ADN (Kupsco y Schlenk 2015). Aunque los datos obtenidos indican que la viabilidad de las células fue afectada durante el período de pre-condicionamiento, resultados recientes muestran que después de la exposición crónica a 50 μM de H₂O₂, el tratamiento agudo con 1 mM de H₂O₂ no causa efectos deletéreos como los inducidos en células sin adaptar, lo que implica que si las células no entran en apoptosis al final del proceso de precondicionamiento, adquieren ventajas para contrarrestar subsiguientes dosis agudas (Orozco et al. 2010).

Como las mitocondrias son un blanco importante de las ROS y su funcionamiento normal es crucial para el mantenimiento de la homeostasis celular, se investigó si durante el proceso de adaptación, estas organelas sufren algún tipo de alteración en relación a su proliferación y acumulación de ROS. La figura 4 muestra que el tratamiento crónico con bajas concentraciones de H₂O₂ induce un aumento en el número de copias del mtADN, lo cual se ha comunicado como un evento molecular temprano ligado al estrés oxidativo, y asociado a la proteína Parkin que interactúa con el mtADN y preserva la integridad del genoma en respuesta al aumento de los niveles de ROS; además, promueve la biogénesis mitocondrial a través de su asociación con el factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) potenciando su actividad (Lee y Wei 2005, Palikaras y Tavernarakis 2014).

En un modelo de adaptación a estrés oxidativo, las células cambian su actividad metabólica y activan vías requeridas para combatir las ROS; por tanto, se espera que para lograr un nuevo estado de equilibrio se alteren los perfiles de expresión génica. Esta idea se evidenció con los resultados obtenidos en los microarreglos basados en RT-PCR, en los que se obtuvo cambio en el perfil de expresión de diez genes implicados en diferentes mecanismos celulares de respuesta a estrés oxidativo (tabla 1) y correlacionados con otros resultados obtenidos en este estudio. De un lado, se observó aumento en los niveles de expresión del gen Vim, que codifica para una proteína integrante de los filamentos intermedios, responsable del mantenimiento de la forma de la célula, la integridad del citoplasma y la estabilidad de las conexiones del citoesqueleto. Esta alteración en su perfil de expresión concuerda con las observaciones del cambio morfológico de las células después del tratamiento prooxidante crónico. Por otro lado, se observó aumento en la expresión del gen Sod2 que codifica para la manganeso superóxido dismutasa mitocondrial, una de las principales enzimas de defensa antioxidante de las células de mamífero, que cataliza la conversión del O₂^– mitocondrial a H₂O₂ para luego ser transformado en agua por la Gpx4 (Lee y Wei 2005). Los datos de RT-PCR obtenidos en este estudio también muestran incremento de 1,7 X en el nivel de expresión de Sod2, y aumento de 1,5 X para Gpx4; estos resultados se correlacionan con la disminución de las ROS mitocondriales reportadas en la figura 3B. Adicionalmente, el aumento en el nivel de expresión en Nos2 sugiere que la exposición crónica a H₂O₂ está relacionada con la sobrerregulación de la óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) y posiblemente a la subsecuente potenciación de la producción de óxido nítrico (NO), el cual ha sido registrado como un agente protector frente a la toxicidad del H₂O₂ (Phoa y Epe 2002, Wink et al. 1995).

Uno de los genes que mostró mayor aumento en los niveles de expresión fue Txn1. La tiorredoxina codificada por este gen, desempeña un papel crítico en la señalización redox. Su función principal es actuar como antioxidante, manteniendo el estado reducido de diversos factores de transcripción como NF-kB y NRF2, ambos involucrados en la modulación transcripcional de varios genes implicados en la detoxificación de ROS (Marinho et al. 2014). De está manera, la regulación positiva en la expresión de Txn1 en respuesta al tratamiento pro-oxidante crónico, indica que la proteína es un importante mediador en las cascadas de señalización redox que permiten la activación de los mecanismos celulares de adaptación a ROS.

La lesiones oxidativas en el ADN son otra de las consecuencias del aumento en las ROS; la proteína ATR es una de las moléculas censoras que participa en el reconocimiento del daño y transmite la señal a moléculas efectoras que activan los puntos de control del ciclo celular y las vías de reparación del ADN; o en ciertos contextos, inducen muerte celular por apoptosis (Barzilai y Yamamoto 2004, Nam y Cortez 2011). Los resultados muestran que el tratamiento crónico con H₂O₂ induce aumento de cuatro veces en la expresión de Atr, lo que sugiere que esta proteína contribuye de manera significativa con la respuesta adaptativa funcional que protege a las células de muerte celular por daños oxidativos en el ADN. Asimismo, en el análisis se identificó la sobreexpresión de Apoe y Slc38a1 que han sido relacionados con el metabolismo energético y el mantenimiento del balance entre oxidantes y antioxidantes.

Finalmente, se encontraron genes con bajos niveles de expresión (< 0,5) como Ccl5 (Rantes) que codifica para una quimiocina importante en lesiones causados por isquemia-reperfusion y es secretada por varios tipos celulares, incluyendo células musculares. Un estudio reciente demostró que su inhibición con moléculas antagonistas, ejerce efectos cardioprotectores durante la reperfusión temprana a través de propiedades antiinflamatorias y antioxidantes (Braunersreuther et al. 2010). Aunque no hay evidencias experimentales sobre la regulación negativa de la expresión de este gen ante situaciones de estrés oxidativo, los hallazgos registrados en este estudio, podrían ser una evidencia importante sobre los mecanismos de adaptación en respuesta al estímulo crónico, como reguladores negativos de la transcripción de Ccl5, lo que representaría ventaja en la reducción de las lesiones provocadas por reperfusión; así que el papel fisiológico de Rantes en el proceso de adaptación, debe ser examinado en futuros estudios. El otro gen que mostró disminución en el nivel de expresión fue Gpx3, cuyo producto proteico es sintetizado principalmente en riñón y secretado en plasma para neutralizar el H₂O₂ (Burk at al. 2011, Takahashi y Cohen 1986). En este caso, la regulación negativa después del tratamiento pro-oxidativo posiblemente esté relacionada con su función sistémica in vivo, sobre la cual no es factible discutir ampliamente dado el modelo in vitro de cultivos celulares empleado en esta investigación.

En resumen, los datos obtenidos indican que la exposición crónica a H₂O₂ induce una respuesta altamente dinámica que permite alcanzar un estado de adaptación celular, que implica cambios morfológicos, funcionales y de expresión génica, y cuyo principal beneficio fisiológico sería proteger las células frente a una subsiguiente dosis aguda o letal de ROS.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio fue financiado por la Estrategia para la Sostenibilidad 2013-2014, Universidad de Antioquia, y la Fundación para la Promoción de la Investigación y la Tecnología, Banco de la República. Los autores quieren agradecer al laboratorio de Joel Meyer de Duke University por el apoyo proporcionado en los experimentos de cuantificación de mtADN; al Grupo de Investigación e Innovación Biomédica del ITM y a Diego Fernando Uribe y Andrea Gómez por la asistencia técnica en RT-PCR; y a Melisa Hincapié y Antea Delgado por su colaboración con el montaje de muestras, toma de imágenes para la descripción de la morfología celular y los ensayos de viabilidad.

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