Ciencias naturales
Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad del Tolima. Correspondencia: Maribeb Castro-González, mcastro@ut.edu.co
Recibido: 10 de octubre de 2014. Aceptado: 2 de diciembre de 2014
En este trabajo se evaluó la diversidad genética de las comunidades desnitrificantes relacionadas con el reciclaje del gas invernadero óxido nitroso (N2O) en la columna de agua de Isla del Sol, en el embalse de Prado, mediante el análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción terminal del gen funcional nosZ, que codifica para la reducción de N2O a N2 durante la desnitrificación. Este es el primer reporte que demuestra la presencia de microorganismos desnitrificantes tipo nosZ en un ecosistema acuático colombiano. Los resultados indicaron que la digestión con la enzima MspI generó un mejor perfil de la comunidad nosZ (expresado en una mayor riqueza de fragmentos de restricción terminal, FRT), que el obtenido con la enzima HhaI. Además, la comunidad de tipo nosZ presentó mayor riqueza y diversidad (índice de Shannon - H'=0,9) de FRT en la profundidad (9m) a la cual se encontraron condiciones subóxicas (1,1 mg/l de O2) y altos niveles de nitrato (0,78 mg/l), lo cual podría favorecer la reducción de N2O a N2. Estos resultados son la base para el desarrollo de investigaciones futuras que permitan establecer la funcionalidad y significancia de estas comunidades en la regulación de las emisiones de N2O desde esta hidroeléctrica.
Palabras clave: desnitrificación, embalse, gen funcional, suboxia, hipolimnion.
Abstract
In the present study the genetic diversity of denitrifying communities related to the recycling of greenhouse gas nitrous oxide (N2O) in Isla del Sol water column, Prado dam (Tolima), was analyzed using the terminal restriction fragment lenght polymorphism analysis of the nosZ functional gene, which encodes the N2O reduction to N2 during denitrification. This is the first report demonstrating the presence of nosZ-type denitrifying microorganisms in a Colombian acquatic ecosystem. The results indicated that digestion with the MspI enzyme generated a better nosZ community profile (expresed in an increase of terminal restriction fragments - TRF) than the HhaI enzyme. Besides, the nosZ community had a higher TRF richness and diversity (Shannon index - H'=0.9) at the depth (9m) where suboxic conditions (1.1 mg/L O2), as well as high nitrate levels (0.78 mg/L) were found, which could favoured N2O reduction to N2. These results are the base for future studies on the functionality and significance of such communities for the regulation of N2O emissions from this dam.
Key words: Denitrification, reservoir, functional genes, suboxia, hypolimnion.
Introducción
La desnitrificación (canónica y quimiolitotrófica) y la oxidación de amonio anaeróbico (anaerobic ammonium oxidation, anammox) son los principales procesos microbianos que producen N2 a partir de la remoción del nitrógeno fijado en diversos hábitats acuáticos, incluidos los lagos (Hulth, et al., 2005, Schubert, et al., 2006, Harrison, et al., 2009, Bai, et al., 2012, Wen, et al., 2012, Wenk, et al., 2013) y los embalses (Deemer, et al., 2011; Beaulieu, et al., 2014). Sin embargo, solo la desnitrificación puede generar N2O durante la reducción del nitrato a gas dinitrógeno (Zumft & Kroneck, 2007) con niveles bajos de O2. Existe una amplia variedad de grupos taxonómicos en los dominios de Bacteria y Archaea (Zumft, 1997) que llevan a cabo este proceso. La reducción de nitrito a óxido nítrico distingue las bacterias desnitrificantes de otras que respiran nitrato. Esta reacción es catalizada por dos reductasas de nitrito diferentes: una citocromo Cd-1 codificada por el gen nirS, y una enzima que contiene cobre codificada por el gen nirK. La reducción de óxido nitroso (N2O), último paso de la desnitrificación, es catalizada por la reductasa de óxido nitroso codificada por el gen nosZ. Esta enzima se encuentra en todas las bacterias desnitrificantes que reducen nitrato a dinitrógeno y también en unas pocas bacterias no desnitrificantes como Wolinella (Vibrio) succinogenes, que usa el N2O como un aceptor terminal de electrones (Zumft, 1997, Zumft & Kroneck, 2007).
En condiciones naturales, y dependiendo del nivel de O2 imperante, la columna de agua puede presentar hipoxia (≤1,4 ml/l O2), suboxia (≤0,1 ml/l O2), o anoxia (0 ml/l O2) (Naqvi, et al., 2010), lo que incide en diferentes aspectos de la desnitrificación como el incremento en la abundancia de bacterias desnitrificantes productoras de N2O en la interfase óxica-anóxica; el consumo de N2O por desnitrificación en aguas subóxicas y anóxicas; la producción de N2O por desnitrificación o la oxidación de NH4+ en aguas hipóxicas y óxicas de embalses (Deemer, et al., 2011; Beaulieu, et al., 2014), y la desnitrificación en microambientes anóxicos en aguas oxigenadas (Brettar & Höfle, 1993; Naqvi, et al., 2000). Además, en varios estudios se ha analizado la composición de la comunidad desnitrificante en relación con la variación del oxígeno, el nitrato, el nitrito, los gradientes redox y la disponibilidad de materia orgánica (Castro-González, et al., 2005; Hallin, et al., 2007; Baxter, et al., 2012, Baxter, et al., 2013), considerándolos como factores clave en la regulación de la desnitrificación y del reciclaje de N2O en ecosistemas acuáticos y terrestres (Zumft, 1997).
Los lagos, embalses y ríos son sitios de desnitrificaciónacti- vos y contribuyen en ∼20 % a la remoción del nitrógeno global (Seitzinger, et al., 2006). Algunos modelos indican que los embalses o reservorios contribuyen más a la remoción de nitrógeno que los lagos (Harrison, et al., 2009), y que tienen gran importancia en el balance global del N2O (St. Louis, et al., 2000). Desde 1990 se sabe que los lagos artificiales y embalses hidroeléctricos emiten gases de efecto invernadero (Rudd, et al., 1993), y actualmente se estima que contribuyen con cerca del 7 % a las emisiones originadas por la acción del hombre en áreas tropicales (St. Louis, et al., 2000). Aunque se han hecho estudios en algunos embalses sobre la producción y consumo de N2O por desnitrificación (Deemer, et al., 2011; Beaulieu, et al., 2014) y sobre los flujos de N2O en hidroeléctricas, principalmente en Brasil (Goldenfum, 2012), muy poco se conoce sobre la diversidad genética de las comunidades microbianas desnitrificantes de tipo nosZ encargadas de su reducción; de ahí la importancia de iniciar estudios en esta área.
]]> El estudio de la diversidad de las comunidades desnitrificantes en diversos ecosistemas acuáticos ha implicado el uso y el desarrollo de la genómica funcional, ya que estas constituyen un grupo polifilético (Hallin, et al., 2007). Los genes que codifican para la reductasa de nitrito (nirS y nirK) y la reductasa de óxido nitroso (nosZ) han permitido el análisis de la diversidad de las bacterias (Jones, et al., 2013) y las arqueobacterias desnitrificantes (Rusch, 2013) en ecosistemas acuáticos mediante el análisis de los fragmentos de restricción terminal y la secuenciación convencional de clones (Castro-González, et al., 2005;), la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) (Throbäck, et al., 2004), la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Dong, et al., 2009) y, más recientemente, la pirosecuenciación (Palmer, et al., 2012, Bowen, et al., 2013). La técnica de análisis de los fragmentos de restricción terminal se basa en la variación de la posición del sitio de restricción entre secuencias de una comunidad bacteriana, la cual genera diferentes fragmentos de restricción terminal (FRT) que son detectados por la emisión de fluorescencia en secuenciadores automáticos durante la electroforesis en gel de alta resolución. Esta técnica tiene ventajas frente a los demás métodos por su facilidad de manejo en el laboratorio y porque genera datos cuantitativos y precisos (tamaño en pares de bases e intensidad de la fluorescencia de cada FRT), lo que permite la diferenciación de comunidades microbianas en diversos ambientes con base en la riqueza y la abundancia relativa de los FRT estimados en el análisis (Dumbar, et al., 2001).Teniendo en cuenta que el embalse de Prado en el sur del Tolima se caracteriza por ser un embalse eutrofizado, estratificado térmica y químicamente, con bajos niveles de oxígeno y gran cantidad de materia orgánica (Márquez & Guillot, 1988), es probable que allí ocurran diversos procesos microbianos, entre ellos, la desnitrificación. Sin embargo, aunque la represa es considerada como una de las más grandes e importantes de Colombia, solo recientemente se viene abordando el estudio de la composición de las comunidades desnitrificantes, los ciclos biogeoquímicos y la producción de gases invernadero como el N2O en ella. Con respecto a este último aspecto, en algunos estudios recientes se han encontrado niveles elevados de N2O (36,5-46,3 mM) en la columna de agua de Isla del Sol (Castro-González & Torres-Valdés, 2014), lo que ha generado inquietudes sobre si hay comunidades microbianas portadoras del gen nosZ con potencial para reducir el N2O a N que ayuden a disminuir las eventuales emisiones de este gas invernadero desde el embalse hacia la atmósfera. Por lo anterior, los objetivos de esta investigación fueron comparar la composición de la comunidad desnitrificante de tipo nosZ en aguas superficiales (2m) y de fondo (9m) en el área de Isla del Sol, y analizar las diferencias en la estructura de dicha comunidad con relación a los parámetros ambientales prevalentes.
Metodología
El muestreo se realizó en septiembre de 2012 en el embalse de Prado, ubicado en el sur del Tolima, a 365 msnm, específicamente en el área de Isla del Sol, localizada a 03°45'N y 04°51'O. En este punto se determinó previamente el perfil vertical de oxígeno, la temperatura y el pH entre 0 y 10 m de profundidad con un equipo multiparámetroOakton®, con el fin de establecer a qué profundidad se tomarían las muestras para el análisis molecular y de nutrientes. Con base en estos parámetros se tomaron las muestras de agua (5 litros) con botella vertical a 2 y 9 metros de profundidad, dado que entre esos dos niveles se observó contraste en la concentración de O2. A continuación se filtraron 100 ml de agua en membranas con poros de 0,22 mm de tamaño y se congelaron a -20 °C para el posterior análisis de nitrógeno amoniacal mediante el método de Kjeldahl, y de nitrato y nitrito a 220-275 nm y 510 nm, respectivamente, mediante técnicas espectrofotométricas y siguiendo los métodos descritos en el Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (1999) para análisis de nutrientes en aguas, todo lo cual se hizo en el correspondiente laboratorio de la Universidad del Tolima. El agua restante se refrigeró y se guardó en la oscuridad hasta su filtración consecutiva en membranas con poros de 20, 8 y 0,22 mm de tamaño. Las membranas de 0,22 mm se congelaron en viales de congelación con tampón de lisis (400 Mm NaCl, 0,75 M sucrosa, 50 Mm Tris p H 9) a -20 °C hasta realizar la extracción de ADN.
La extracción de ADN de los microorganismos recolectados sobre las membranas de 0,22 mm se hizo siguiendo el método descrito por Castro-González, et al., (2005), consistente en digestión con lisozima (1mg/ml) y proteinasa K (10 mg/ ml), lisis celular por choque térmico, extracción con fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (25:24:1) y precipitación con etanol frío. La concentración y la pureza de las muestras se cuantificó por espectrofotometría a 260/280 nm utilizando un NanoDrop™ 2000.
La amplificación del gen funcional de la reductasa de óxido nitroso (nosZ) se hizo usando el par de cebadores nosZ1188F-nosZ1869R descritos por Kloos, et al., (2001) para generar un amplicon de 700 pb. El cebador nosZ1188F se marcó con 6-carboxifluoresceina. La mezcla de reacción (25ml) incluyó 1ml de ADN (10 ng/ml), 2,5 ml de cada cebador (10 mM), 0,5ml de polimerasa REDAccuTaq® (Sigma), 2,5 ml del tampón de reacción de la enzima, 0,5 ml de la mezcla de dNTP (200 mM) y 2,5 ml de albumina de suero bovino (4 mg/ml) (Fermentas). La amplificación se estandarizó bajo las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, alineamiento durante los primeros 10 ciclos con touchdown de 0,5 °C comenzando a 57 °C y manteniendo los restantes 25 ciclos a 56 °C, y una extensión final de 1 minuto a 72 °C. Los productos de amplificación se tiñeron con bromuro de etidio (0,5 mg/l) y se analizaron por electro- foresis en geles de agarosa al 2 %. Los productos de tres réplicas de PCR se combinaron y posteriormente se eluyeron del gel usando el estuche Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Mannheim, Germany).
Los amplicones del nosZ purificados (100 ng) se digirieron con 5U de las enzimas HhaI y MspI en sus respectivos tampones de reacción siguiendo las instrucciones del proveedor, y los productos digeridos se limpiaron en columnas Autoseq G-50 (Amersham Biosciences), ajustándose a las instrucciones del proveedor. Se mezclaron alícuotas de 2 ml del producto digerido con 12 ml de formamida desionizada (Applera, Darmstadt, Germany) y 0,2 ml del ADN de peso molecular estándar interno (X-Rhodamine map MarkerR 50-1000 bp; BioVentures, Murfreesboro, TN). Los fragmentos de restricción terminal (FRT) se separaron en un secuenciador ABI 310 (Applied Biosystems). Este análisis se hizo por triplicado para cada muestra con el fin de verificar la reproducibilidad de los FRT detectados, así como la fluorescencia relativa de cada uno de acuerdo a lo sugerido por Dunbar, et al., (2001). El largo (pb) de los FRT marcados con fluorescencia se determinó por comparación con el ADN estándar interno usando el programa Gene Scan 3.71 (Applied Biosystems).
Para el análisis de los FRT se escogieron los picos que presen- taron >50 unidades de fluorescencia y >45 pb. Los patrones obtenidos en cada profundidad se normalizaron en las mismas unidades de fluorescencia total usando el procedimiento de estandarización iterativa de Dunbar, et al., (2001). El porcentaje de abundancia relativa de cada FRT se determinó calculando la proporción entre la altura del pico dado y la altura total de los picos normalizados en cada profundidad.
Para el análisis de los datos se estimó el índice de diversidad de Shannon y Simpson, así como el índice de similitud de Bray Curtis, usando el programa Biodiversity Pro 2.0 (McAleece, 1997).
Resultados y discusión
]]> Parámetros fisicoquímicosEl área de Isla del Sol se caracterizó por presentar condiciones óxicas (4,1mg/l de O2) a 2 metros de profundidad e hipoxia (1,1mg/l de O2) a 9 m. La temperatura presentó una variación de 4 °C entre los 2 y los 9 metros. El nivel de nitrato y de nitrógeno amoniacal incrementó hacia los 9 metros de profundidad, mientras que el pH disminuyó y el nivel de nitrito fue muy bajo y cercano al límite de detección en ambas profundidades (Tabla 1).
Los datos de nutrientes, pH y temperatura superficiales concuerdan con los de estudios previos que han reportado un alto nivel de nitrógeno amoniacal (0,316 mg/l), y bajos niveles de nitratos (0,206 mg/l) y nitritos (0,003 mg/l), así como temperaturas altas y pH neutro en el embalse (Márquez & Guillot, 1988; Canosa & Pinilla, 2007). Dichos estudios han reportado también niveles elevados de sólidos suspendidos (20,7 mg/l) y de nitrógeno total (7,8 mg/l), además de bajos niveles de conductividad (53,2 mS/cm) y de alcalinidad (13,0).
Por otra parte, el fuerte cambio fisicoquímico observado a los 9 m concuerda con los datos de estudios previos que indican la estratificación térmica y química del embalse con una fuerte oxiclina entre superficie y fondo, lo que genera anoxia por debajo de los 8 m en la mayor parte de la hidroeléctrica (Márquez & Guillot, 1988). Estos datos complementan la información reportada en el área por la empresa Sodeic Ltda. (1993) y sugieren que las condiciones de estabilidad de la columna de agua y los procesos biológicos probablemente han llevado a la disminución de los niveles de oxígeno disuelto, creando condiciones hipóxicas, subóxicas y anóxicas a lo largo de la columna de agua que favorecen la presencia de los microorganismos desnitrificantes.
Análisis molecular
A partir del ADN obtenido se amplificó por PCR específicamente el gen funcional nosZ con un amplicon de 700 pb. Al cortar el amplicon del gen nosZ de la comunidad desnitrificante se obtuvieron 15 fragmentos de restricción terminal diferentes con la enzima MspI (Figura 1) y 17 con la enzima HhaI (Figura 2), lo que indica su riqueza en la columna de agua. La riqueza de los FRT fue igual a los 2 y los 9 m de profundidad con la enzima MspI, en tanto que con la enzima HhaI se observó una mayor riqueza de FRT (16) a los 9 m de profundidad (Tabla 2). Se observó que la comunidad desnitrificante de tipo nosZ digerida con HhaI fue más homogénea en su estructura a los 2 y a los 9 m, ya que la mayoría de los FRT observados a los 2 m (46, 69, 82, 91, 103, 146, 288, 319, 405, 474) también estaban presentes a los 9 m y con la misma abundancia relativa; sin embargo, los FRT únicos (119, 126, 216, 257, 306, 322), poco abundantes, se encontraron solamente a los 9 m de profundidad. En contraste, la estructura de la comunidad desnitrificante nosZ digerida con MspI se mostró un poco más heterogénea al comparar ambas profundidades, ya que hubo una menor abundancia de las diferentes especies comunes representadas en los FRT 55, 87, 102, 107, 110, 223 (con excepción de los FRT 130 y 140, los cuales incrementaron) a los 9 m de profundidad. De igual manera, con la enzima MspI se detectaron más FRT únicos tanto a los 2 m (76, 204, 223, 381) como a los 9 m (48, 92,170, 306) de profundidad, lo que sugiere que con esta enzima se obtuvo una mejor resolución de la riqueza de FRT de la comunidad desnitrificante de tipo nosZ en Isla del Sol.
Aunque se ha reportado que una tercera parte de las bacterias desnitrificantes presentes en el ambiente están genéticamente inhabilitadas para reducir el N2O, dado que carecen del gen nosZ (Jones, et al., 2008), los resultados del presente trabajo demuestran que en el área de Isla del Sol del embalse de Prado existe una comunidad desnitrificante rica y diversa que posee el gen nosZ, el cual codifica para la reducción de óxido nitroso (N2O) a N tanto en condiciones hipóxicas en el fondo como en la superficie bajo condiciones óxicas, como en el fondo. Los resultados muestran que la riqueza de los FRT hallados en la columna de agua de Isla del Sol es similar a la reportada en sedimentos de arroyos (Baxter, et al., 2012) y en estuarios (Fortunato, et al., 2009), donde se han observado cambios espacio-temporales en la riqueza y en la abundancia relativa de FRT, con la diferencia de que en dichos sedimentos las concentraciones de nutrientes, nitrógeno total y materia orgánica tienden a ser mayores que las que usualmente se encuentran en la columna de agua.
Los resultados de esta investigación respaldan lo verificado en otros estudios en el sentido de que herramientas moleculares como los FRT, la clonación y, más recientemente, la pirosecuenciación (Hallin, et al., 2007; Magalhaes, et al., 2008; Fortunato, et al., 2009; Bai, et al., 2012; Eiler, et al., 2012; Wang, et al., 2012; Baxter, et al., 2012; Jones, et al., 2013; Bowen, et al., 2013), han ayudado a develar la diversidad de los microorganismos desnitrificantes en los ecosistemas acuáticos de agua dulce, aunque esta siga siendo mucho menor que la encontrada en los ecosistemas terrestres (Braker & Conrad, 2011). Sin embargo, se debe tener presente que aunque la técnica de FRT se ha usado ampliamente para el estudio de comunidades microbianas, pues permite obtener un perfil de las comunidades de manera reproducible y exacta, también está sujeta a las limitaciones propias de la amplificación por PCR (la concentración del segmento de ADN, el número de ciclos de la PCR, la amplificación preferencial de segmentos de ADN específico de acuerdo a los cebadores usados), y a errores en el proceso de digestión con enzimas (debidos a una digestión incompleta o a la presencia de diferentes sitios de restricción terminal en la misma especie como resultado de las múltiples copias del gen en estudio), como lo han sugerido Egert & Friedrich (2003), lo que puede impedir la detección de especies con muy poca abundancia o que poseen secuencias características, o en el caso contrario, conducir a la sobreestimación de la diversidad por la presencia de fragmentos de restricción terminal falsos y de pseudo fragmentos, si no se analizan correctamente los datos.
Análisis de diversidad y similitud
Los índices de diversidad de Shannon (H') y Simpson (1/D) (Tabla 2) mostraron que la comunidad digerida con MspI y HhaI a los 9 m era un poco más diversa (H'∼0,9) que la comunidad a los 2 m de profundidad (H'∼0,8). También se observó que la similitud de las comunidades desnitrificantes de tipo nosZ entre los 2 y los 9 m fue de un 77 % al analizarlas mediante la digestión con HhaI y de solo 24 % al analizar los FRT con MspI (Tabla 2). Estos resultados revelaron diferencias en la composición de las comunidades de tipo nosZ entre las dos profundidades y evidenciaron que la diversidad de la comunidad de tipo nosZ encontrada en la columna de agua de Isla del Sol es menor que la reportada para sedimentos de estuarios (H'=1,5-2,6) y sedimentos de lagos eutróficos (H'=2,5) por Fortunato, et al., (2009) y Wang, et al., (2012a). Estas diferencias son lógicas teniendo en cuenta que los sedimentos usualmente poseen mayor cantidad de materia orgánica y de nutrientes que la columna de agua. Sin embargo, y habida cuenta de que no hay estudios similares en embalses para poder comparar, sí se debe tener en cuenta que se ha reportado mayor diversidad de bacterias y arqueobacterias en la represa de Three Gorges en China en dos casos: el primero, cuando los niveles de nutrientes, de carbono orgánico disuelto y de turbidez eran altos, y el segundo, cuando se estudiaron las bacterias asociadas a la fracción particulada (Wang, et al., 2012). Además, otros autores también han hecho referencia al hecho de que pueden darse variaciones en la estructura de las comunidades de tipo nosZ debidas a su interacción con las bacterias nitrificantes (Deemer, et al., 2011) y las bacterias anammox (Wenk, et al., 2013), así como a los factores que regulan la expresión del gen nosZ y la actividad de su reductasa (Baxter, et al., 2012).
Por otra parte, los resultados de similitud entre comunidades sugieren que el análisis de FRT realizado con la enzima MspI permitió una mejor resolución de la comunidad de tipo nosZ en ambas profundidades, lo que se reflejó en una baja similitud entre las comunidades a los 2 y los 9 m de profundidad (24 %) y la presencia de mayor número de FRT únicos que los observados con la enzima HhaI. Estos datos concuerdan con lo reportado en varios estudios en los cuales se hace referencia a que la selección adecuada de la enzima para generar los FRT, así como del procedimiento de análisis de los FRT, es de suma importancia en el análisis de la composición de las comunidades microbianas (Dunbar, et al., 2001).
Composición de la comunidad de tipo nosZ y su relación con el ambiente
]]> El análisis de los FRT mostró una mayor diversidad de la comunidad de tipo nosZ en Isla del Sol a los 9 m de profundidad, donde probablemente se registra una mayor tasa de reducción de N2O a N2 debido a las condiciones hipóxicas (1,1 mg/l de O2), de acidez (pH=6,2) y de disponibilidad de nitrato (0,78 mg/l) y de N2O (∼40 nM), según recientes cuantificaciones a esta profundidad (Castro-González & Torres-Valdés, 2014). Asimismo, en el embalse se observó que las bacterias desnitrificantes de tipo nos-Z se encuentran en la columna de agua a partir de los 2 m de profundidad bajo condiciones óxicas (4 mg/l de O2), neutras (pH=7,5) y de bajo nitrato (0,23 mg/l), lo que sugiere su versatilidad metabólica ante diferentes concentraciones de O2, pH y nutrientes; sin embargo, se requieren más estudios que permitan determinar si la óxido nitroso reductasa es activa bajo estas condiciones óxicas o está inhibida. En general, son varios los estudios que al igual que este muestran cómo los filotipos, las unidades taxonómicas operacionales (UTO) o los FRT de comunidades desnitrificantes de tipo nirS, nirK y nosZ están presentes a lo largo de gradientes fisicoquímicos en la columna de agua de océanos (Castro-González, et al., 2005; Qian, et al., 2011; Ganesh, et al., 2013) y de lagos (Wen, et al., 2012), así como en sedimentos tanto de estuarios (Abell, et al., 2010,) como de lagos (Bai, et al., 2012; Wang, et al., 2012a;), lo que indica la capacidad facultativa de las bacterias desnitrificantes en ambientes con alta variabilidad ambiental. En este sentido, Magalhaes, et al. (2008) reportaron variación en la abundancia relativa de FRT tipo nosZ con relación a la disponibilidad de nitrato y las tasas de desnitrificación en sedimentos; Bai, et al. (2012) reportaron cambios espacio-temporales en la abundancia relativa de los FRT y en la abundancia de genes nosZ detectada por PCR cuantitativa en sedimentos del lago Dianchi; Baxter, et al. (2013) reportaron cambios en la abundancia de genes nosZ relacionados con la temperatura y el porcentaje de materia orgánica del sedimento en diferentes arroyos, y Castro-González, et al. (2005) reportaron una mayor riqueza de FRT y mayor diversidad de las comunidades desnitrificantes (nirS) asociadas a la variación en los niveles de oxígeno, nitrito y óxido nitroso en aguas oceánicas subóxicas.Si bien los resultados de este estudio indican que hay comunidades desnitrificantes que poseen el gen nosZ y que su abundancia relativa, riqueza y diversidad está relacionada con algunas de las características estudiadas en la columna de agua, el siguiente paso en la investigación deberá orientarse a determinar aspectos como la variación espacio-temporal de esta comunidad y de las comunidades desnitrificantes de tipo nirS, nirK, y la comunidad anammox, la cual también ha sido reportada en lagos (Schubert, et al., 2006; Penton, et al., 2006; Wenk, et al., 2013) y que, por consiguiente, puede estar presente en el embalse y contribuir a la generación de N2. Además, habría que determinar la funcionalidad de la N2O reductasa en el área, teniendo en cuenta que: 1) esta es inhibida reversiblemente por los niveles elevados de oxígeno; 2) algunos microorganismos desnitrificadores, aunque poseen el gen nosZ, no reducen el N2O a N2 (Wang, et al., 2012a); 3) se ha reportado una relación negativa entre la abundancia de genes nosZ y la proporción de N2O que se reduce a N2 en sedimentos de lagos eutróficos (Wang, et al., 2012a), y 4) en recientes trabajos se ha cuantificado una saturación excesiva de N2O (∼200 %) en la columna de agua del embalse, lo cual sugiere un eflujo de este gas invernadero hacia la atmósfera (Castro-González & Torres-Valdes, 2014).
Conclusiones
Este es el primer trabajo de investigación en Colombia en que se demuestra la existencia de comunidades desnitrificantes de tipo nosZ en la estación de Isla del Sol en el embalse de Prado mediante el estudio molecular de su gen funcional. El análisis de la composición de dicha comunidad en la columna de agua de esta estación mostró una alta diversidad de FRT en comparación con la reportada en otros ambientes acuáticos, además de cambios en su composición (abundancia relativa y riqueza) entre la superficie y el fondo. La mayor diversidad de la comunidad y el mayor número de FRT únicos se detectaron a los 9 m de profundidad bajo condiciones hipóxicas, punto en el que probablemente se requiere una mayor tasa de reducción de N2O a N2 para favorecer el proceso de la desnitrificación.
Conflicto de intereses
La autora declara que no tiene ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
A la oficina de investigaciones y desarrollo científico de la Universidad del Tolima por la financiación de esta investigación a través del proyecto # 500110, al Ministerio del Medio Ambiente que, a través del "Contrato de acceso a recursos genéticos y productos derivados para investigación científica sin interés comercial No. 90", autorizó el acceso y el uso del ADN bacteriano ambiental requerido para este estudio, y a A. Castro y M. Pacheco por su apoyo en campo y en el laboratorio.
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