Jorge Hernán Ramírez, M.D., M.Sc.1, Mauricio Palacios, M.D., M.Sc.1, Oscar Gutiérrez, M.D., M.Sc.2
RESUMEN
Introducción: La Salvia scutellarioides es una planta con efecto antihipertensivo y diurético. En este estudio se evalúa su efecto vasodilatador con la técnica de órgano aislado vascular.
Objetivos: Estandarizar la técnica de órgano aislado vascular y estudiar el efecto de S. scutellarioides en la vasoconstricción por estimulación de receptores alfa 1.
Metodología: Se colocaron anillos de aorta de rata en un equipo de baño de órganos (BIOPAC®) a una temperatura de 37oC y burbujeo constante de gas carbógeno. Los cambios en la tensión se registraron con un transductor de tensión isométrica y un equipo de adquisición de datos. En la estandarización, se realizaron seis curvas de concentración-tensión con fenilefrina a las horas 1, 3 y 5, para determinar la tensión máxima (TM) y la concentración efectiva 50 (EC50). Finalmente, se obtuvieron curvas de concentración-tensión para fenilefrina con S. scutellarioides a una concentración de 10 mg/dl y 20 mg/dl.
]]> Resultados: En la estandarización de la técnica no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la TM y la EC50 para fenilefrina en la primera, tercera y quinta horas. La administración de S. scutellariodes ocasionó una disminución concentración dependiente de la TM sin cambios en la EC50.Discusión: La técnica de órgano aislado implementada es viable hasta por cinco horas y no ocasiona desensibilización de receptores alfa 1. La disminución de la TM por la S. scutellarioides se explica por un efecto de tipo a1 antagonista no competitivo. Se requieren estudios para aislar principios activos que permitan iniciar ensayos clínicos fase I en los seres humanos.
Palabras clave: Salvia; Hipertensión; Mastranto; Etnofarmacología; Órgano aislado vascular; Vasoconstricción.
Los estudios en órgano aislado son una herramienta útil para evaluar la actividad farmacológica de una molécula en los receptores, canales y enzimas de un tejido1,2. Recientemente, se ha incrementado el uso de técnicas in vitro en el área de la etnofarmacología para evaluar el efecto de extractos y moléculas derivadas de plantas. El creciente uso de esta técnica por la comunidad científica internacional se debe a que es poco costosa, pues requiere menos animales en comparación con los modelos in vivo y permite evaluar en poco tiempo la actividad farmacológica de una gran variedad de extractos y moléculas de origen vegetal3.
Colombia cuenta con la mayor biodiversidad vegetal por km2 del planeta y ocupa el segundo lugar en número de especies después de Brasil. Sin embargo, más de 99% de las especies vegetales no han sido estudiadas como fuente potencial de medicamentos, pese a que una amplia proporción de colombianos depende del uso de plantas medicinales. Por lo anterior, es necesario aplicar métodos costo-efectivos, que empleen un reducido número de animales y permitan evaluar en el menor tiempo posible la actividad farmacológica de la biodiversidad de plantas nacionales. La investigación en la etnofarmacología colombiana es una necesidad prioritaria del país para permitir la apropiación social del conocimiento, importante para evitar la bio-piratería en la era de la globalización y el libre comercio4-6.
En este estudio se presenta cómo se aplicó la técnica de órgano aislado vascular, los efectos del tiempo en la contracción del músculo liso y la acción de dosis repetidas de fenilefrina en la sensibilidad de los receptores alfa 1. Por último, se evaluó la propiedad vasodilatadora de la Salvia scutellarioides (Lamiaceae), una planta muy utilizada por la población colombiana para el tratamiento de la hipertensión arterial y que recientemente este mismo grupo informó como antihipertensiva y diurética7,8.
El proyecto fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad del Valle, Acta N° 16 de julio 18 de 2002.
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación del tejido. Se anestesiaron cinco ratas Sprague-Dawley machos con peso de 200 a 250 g con pentobarbital (100 mg/kg) para extraer la aorta torácica por toracotomía. La arteria se colocó en una caja de petri con solución de Krebs-Henseleit (119 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3 y 5.6 mM glucosa) a 4o C más suplemento continuo de carbógeno (CO2: 5% - O2: 95%). Dentro de la solución se seccionó en forma cuidadosa la aorta con un bisturí para obtener tres anillos concéntricos de 5 mm cada uno, aproximadamente; además, el endotelio se removió con un tubo PE-100 de polietileno. Para el montaje, cada anillo vascular se fijó en sus extremos opuestos con dos alambres de plata y se colocó en un baño de órganos [Tissue Bath Station, BIOPACTM] con solución de Krebs-Henseleit (20 ml) a 37o C más suplemento continuo de carbógeno (Fotografía 1).
Determinación del efecto del tiempo en la contracción del músculo liso vascular. Una vez acoplado el anillo vascular en el baño de órganos, se procedió a estimular la respuesta tisular durante la primera hora de experimentación al añadir KCl (25 mM) cada 20 minutos y cambiando continuamente la solución de Krebs-Henseleit. Transcurrida la primera hora y una vez alcanzada la estabilización del tejido, se hizo una curva de concentración vs tensión con fenilefrina (SIGMA®) añadida al baño de órganos de manera acumulativa (10 nM a 100 mM). Luego de obtener la tensión máxima (TM) con fenilefrina, se adicionó acetilcolina (10 mM) para comprobar la no viabilidad del endotelio. La curva con fenilefrina se repitió a la tercera, quinta y séptima horas en seis anillos vasculares para determinar los cambios temporales de la tensión máxima del músculo liso vascular in vitro y la desensibilización de los receptores alfa 1 a la fenilefrina.
Efecto de la S. scutellarioides en músculo liso vascular. El lugar donde se obtuvo la planta, la certificación por biología botánica y los procesos para preparar el extracto se describen con detalle en una publicación previa7. El efecto del extracto acuoso de S. scutellarioides se determinó con el uso de tres anillos vasculares. Durante la primera hora se realizó con cada anillo vascular una curva control concentración-tensión con fenilefrina. A la tercera y quinta horas se obtuvo una nueva curva con fenilefrina más el extracto acuoso de S. scutellarioides a una concentración de 10 mg/dl y 20 mg/dl, respectivamente.
Análisis estadístico. Los datos de la tensión obtenida con las concentraciones de fenilefrina se analizaron y graficaron con el programa GraphPad Prism® 4.02 para Windows XP®. Para calcular la concentración de la droga que ocasionó 50% de la tensión máxima (EC50) se utilizó el análisis de Hill9. Los datos se analizaron mediante ANOVA de dos vías (concentración vs. tensión) aceptándose a priori una p<0.05 como indicador de diferencias estadísticamente significativas. Los resultados se muestran como la media del grupo ± error estándar de la media (SEM).
RESULTADOS
Efecto del tiempo en la contracción del músculo liso vascular y EC50 para fenilefrina. La tensión máxima para fenilefrina en la tercera y quinta horas no mostró diferencias estadísticamente significativas en comparación con la curva control de la primera hora (Gráfica 2). A la séptima hora de experimentación no se obtuvo una respuesta contráctil con fenilefrina en ninguno de los anillos vasculares estudiados. El análisis de Hill (Gráfica 3) dio como resultado una EC50 de 5.4 x 10-6 mol/l de fenilefrina para las curvas obtenidas a la primera, tercera y quinta horas de experimentación.
Efecto de S. scutellarioides en la contracción del músculo liso vascular. La tensión máxima para la fenilefrina en combinación con el extracto acuoso de S. scutellarioides a una concentración de 10 mg/dl fue 2.44g ± 0.13, equivalente a una disminución de la tensión máxima de 17% en comparación con la curva control para fenilefrina (p<0.01). Con el extracto acuoso de S. scutellarioides a una concentración de 20 mg/dl se obtuvo una tensión máxima para fenilefrina de 1.4g ± 0.15, igual a una disminución de la tensión máxima de 54% en comparación con la curva control para fenilefrina (p<0.001) (Gráficas 4 y 5). El extracto acuoso de S. scutellarioides en las concentraciones estudiadas no produjo diferencias en la EC50 para la fenilefrina.
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DISCUSIÓN
Los estudios en órgano aislado se consideran como una técnica útil para evaluar los efectos de fármacos y extractos derivados de plantas en el músculo liso. Sin embargo, la técnica de órgano aislado vascular presenta como desventaja la dificultad de mantener el tejido viable para los ensayos farmacológicos. Esto se debe a la excesiva manipulación quirúrgica del tejido, a la hipoxia tisular por burbujeo inconstante del gas carbógeno y a concentraciones inapropiadas de electrólitos en la solución de Krebs1. Además, con el transcurrir de los minutos el músculo liso vascular puede presentar fatiga y disminución de la tensión máxima, y ocasionar un factor de confusión cuando se toma como control la primera curva para el agonista. Otro factor que ocasiona dificultades para ejecutar la técnica, es la desensibilización de los receptores ocasionada al administar agonistas, fenómeno que ocurre por la fosforilación del receptor o recaptura de éste al citoplasma en un proceso mediado por beta-arrestina y clatrina10.
En la reproducción del modelo de órgano aislado vascular no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la tensión máxima por fenilefrina de la primera, tercera y quinta horas. Sin embargo, a la séptima hora no se obtuvo respuesta contráctil con fenilefrina, por lo que los experimentos en órgano aislado vascular sólo se deben realizar por un máximo de cinco horas. La EC50 para la fenilefrina a la primera, tercera y quinta horas no mostró diferencias estadísticamente significativas, lo que indica que la sensibilidad de los receptores alfa 1 adrenérgicos se mantuvo sin cambios durante las cinco horas de experimentación. La implementación de esta técnica permitirá evaluar las plantas colombianas con efectos en el músculo liso vascular, como un método de filtro para la búsqueda de principios activos con acción cardiovascular.
S. scutellarioides (10 mg/dl y 20 mg/dl) ocasionó una disminución en la tensión máxima con fenilefrina sin alterar su EC50. Este tipo de efecto se debe a que por lo menos una de las moléculas que componen el extracto acuoso de S. scutellarioides tiene un efecto de tipo antagonista de tipo no competitivo, de receptores de alfa 111.
Otras plantas de la familia Lamiaceae como la Satureja obovata y la Orthosiphon aristatus presentan un efecto vasodilatador parecido al de la S. scutellarioides12,13.
Además, recientemente se describió la protección contra el estrés oxidativo de las células endoteliales y la inhibición de la proliferación del músculo liso vascular por la Salvia miltiorrhiza14,15.
El efecto vasodilatador de S. scutellarioides puede explicar la disminución de la tensión arterial diastólica en el modelo de las ratas hipertensas por L-NAME7. Sin embargo, se debe aclarar que la acción farmacológica de una planta puede resultar de la acción aditiva y/o sinérgica de varios principios activos16, por lo que otros mecanismos como el aumento de la diuresis y natriuresis pueden también explicar el efecto antihipertensivo de S. scutellarioides8. Recientemente, se determino que S. scutellarioides no presentaba toxicidad subaguda cuando se administraba durante 28 días en ratas Wistar17. La continuidad de los estudios con S. scutellarioides se justifica debido a la relativa seguridad de la planta en seres humanos, el amplio uso en la medicina tradicional colombiana y los resultados positivos obtenidos en los modelos animales e in vitro. Específicamente, se deben aislar los principales principios activos de la planta y definir sus características farmacodinámicas, con lo que se puede dar comienzo a los ensayos clínicos fase I en seres humanos.
REFERENCIAS
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