Dabeiba Adriana García, MSc¹, Yazmín Rocío Arias, MSc², Fabio Ancízar Aristizábal, PhD²

* Proyecto financiado por la Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.
1. Pontificia Universidad Javeriana, Centro de Investigaciones Odontológicas, Bogotá, Colombia.
e-mail: garciad@javeriana.edu.co yrariasm@unal.edu.co
2. Universidad Nacional de Colombia, Departamento de Farmacia, Bogotá, Colombia. e-mail: faaristizabalg@unal.edu.co
Recibido para publicación marzo 31, 2008 Aceptado para publicación enero 15, 2009

RESUMEN

Introducción: El cáncer cervical es el segundo cáncer más importante en mujeres a nivel mundial y la segunda causa de muerte en mujeres por cáncer. Se ha demostrado que el proceso de carcinogénesis cervical presenta componentes tanto genéticos, epigenéticos y medio ambientales. En la actualidad, muchos estudios se encaminan en la búsqueda de marcadores moleculares como mutaciones en oncogenes y/o genes tumor supresor que se asocien con la progresión de esta entidad. Los genes candidatos más estudiados en cáncer cervical en distintas poblaciones han sido H-ras, K-ras, EGFR entre otros.

Metodología: Para ello se detectó el VPH genérico mediante PCR con los iniciadores GP5+/GP6+, y específico para VPH 16 y 18 en la región E6/E7. Para detectar las mutaciones en el codón 12 de H-ras, codones 12 y 13 de K-Ras y el exón 21 de EGFR se realizó mediante secuenciación directa de los productos de PCR de estos fragmentos génicos.
Resultados: Obteniendo una buena correlación entre las muestras de plasma sanguíneo y los cepillados cervicales, tanto para los hallazgos de VPH p=0.0374 como para las mutaciones evaluadas p=0. En general, para EGFR en el exón 21 no se encontraron mutaciones, al igual que para los codones 12 y 13 en K-ras y codón 12 en H-ras.

Conclusión: El uso del ADN presente en el plasma puede ser relevante para el análisis de mutaciones y de la presencia de marcadores tumorales cuando no se dispone de otras muestras.

Palabras clave: Mutaciones; Cáncer cervical; Lesión intraepitelial de alto grado; Papilomavirus humano; H-ras; K-ras; EGFR.

Detection of genes mutations in the K-RAS, H-RAS and EGFR in samples of blood plasma and cervical smears for patients with cervical intraepithelial neoplasia III and cervical cancer

SUMMARY

Introduction: Cervical cancer is the second most important cancer in women worldwide, and the second cause of cancer death in women. It has been shown that the process of cervical carcinogenesis presents as genetic and epigenetic components as environmental issues. At present, many studies are addressed in searching for molecular markers such as mutations in oncogenes and/or tumor suppressor genes that are associated with the progression of this disease, the most studied candidate genes in cervical cancer in different populations have been H-ras, K-ras, EGFR among others.

Objective: The present study identified human papilloma virus (HPV) generic and specific in DNA-free plasma and cervical smears of invasive cervical cancer patients and patients with cervical intraepithelial neoplasia (CIN) III in addition to assessing genetic alterations, such as mutations in the genes H-ras, EGFR and K-ras.
Methods: To do so generic HPV was detected by PCR with primers GP5+/GP6+, and specific HPV 16 and 18 in E6/E7 region; to detect mutations in codon 12 of H-ras, codons 12 and 13 of K-ras and EGFR exon 21 was conducted by direct sequencing of PCR products of these gene fragments.

Conclusion: The use of DNA in plasma may be relevant to the analysis of mutations and the presences of tumor markers are not available from other samples.

Keywords: Mutation; Cervical cancer; High-grade lesion; Human papillomavirus; H-ras; K-ras; EGFR.

El cáncer cervical es una de las enfermedades más importantes a nivel mundial. En Colombia, la incidencia estimada es de 29.4 casos por cada 100,000 habitantes¹. El proceso de carcinogénesis cervical comienza por lesiones escamosas no invasivas que progresan a lesiones escamosas intraepiteliales de bajo y alto grado; en algunos casos, las lesiones progresan a un carcinoma invasivo². No obstante, aún no se conoce con exactitud qué lesiones progresan o cuáles regresan ni tampoco los mecanismos de la progresión tumoral en este tipo de neoplasia. Aún más, a pesar de los avances recientes que han revelado diferentes rutas de la carcinogénesis cervical, a la fecha no se ha encontrado un marcador molecular que esté significativamente asociado con la progresión o el resultado clínico de la enfermedad.

Múltiples hallazgos evidencian que pacientes con distintas neoplasias entre ellas el cáncer cervical evidencia cantidades crecientes de ADN humano en plasma, además de ADN viral³. En otro tipo de neoplasias, como cáncer de colon, esófago, estómago, seno, páncreas, cabeza y cuello y hepático en los cuales el ADN que circula en el plasma también posee las mismas características genéticas (amplificación de oncogenes, mutaciones puntuales en genes supresores de tumor, inestabilidad de microsatélites, otras) y/o epigenéticas (metilación de regiones promotoras de genes supresores tumorales) del tumor analizado⁴, se abre la posibilidad de usar al ADN de plasma como un blanco importante de estudio, pues su fácil obtención y la posibilidad de que a través de los cambios presentes en el ADN plasmático se puedan detectar no sólo recurrencias locales sino también distantes, lo convierten en una muestra ideal. Los cambios génicos más estudiados en cáncer cervical son mutaciones en los genes EGFR, H-ras y K-ras.

Harvey (H)-ras y Kirsten (K)-ras se localizan en los cromosomas 11 y 12 respectivamente; estos oncogenes codifican para una proteína de 21kDa denominada p21, la cual presenta actividad GTPasa y está implicada en la regulación del ciclo celular⁵. La activación de estos oncogenes mediante mutaciones puntuales principalmente en los codones 12, 13 y 61, inhiben su actividad GTPasa, representada en una activación constitutiva de p21, contribuyendo de esta forma a la transformación maligna. La elevada expresión de ras se ha observado en muchos tipos de cáncer como el de pulmón, seno, vejiga, colón y cervical entre otros. Además, mutaciones en dichos codones, pueden ser identificadas no sólo en tejido neoplásico sino también en lesiones preneoplásicas, sugiriendo un papel importante en la carcinogenésis cervical⁶.

Otro oncogen estudiado en cáncer cervical es el EGFR, involucrado en la proliferación celular; es un receptor de 170kDa que se encuentra anclado a la membrana celular y se localiza en el cromosoma 7, pertenece a la familia de los receptores tirosina quinasa ErbB, compuesta por cuatro miembros EGFR (ErbB1, ErbB2, ErbB3 y ErbB4). Este receptor presenta varios ligandos entre ellos EGF y TGFa⁸. Cuando el ligando se une al dominio extracelular del receptor, ocurre una autofosforilación y dimerización, induciendo cambios conformacionales. La transducción de esta señal resulta en proliferación celular, diferenciación, migración, adhesión, protección a apoptosis y transformación. Mutaciones en los exones del 18 al 24, altera su actividad tirosina quinasa, las cuales se han encontrado en varios tipos de tumores epiteliales como en cáncer de seno y cervical principalmente⁷.

Debido a que las mutaciones en los dominios GTPasa para K-ras y H-ras y dominio tirosina quinasa para EGFR se han descrito como unos de los más prometedores marcadores moleculares asociados con la progresión y potenciales herramientas en el monitoreo de aparición de recurrencias y metástasis en tumores sólidos, el objetivo del presente estudio fue determinar si las mutaciones detectadas en cepillados cervicales eran las mismas detectadas en plasma sanguíneo de pacientes con NIC III y cáncer cervical invasivo. Asimismo se realizó una comparación de la presencia de VPH en los dos tipos de muestras de cada paciente participante en el estudio.

MÉTODOS

Población y muestras. Este estudio es de tipo descriptivo, de corte transversal y observacional, el número de pacientes incluidas fue muestreo por conveniencia, que se recolectaron durante un período de seis meses en un hospital de tercer nivel de la ciudad de Bogotá, Colombia. Las muestras de cepillado cervical y sangre periférica se tomaron durante la colposcopia a mujeres quienes tuvieran diagnóstico citológico de lesión intraepitelial de alto grado (LIEAG) y/o CC, quienes eran remitidas para colposcopia-biopsia para confirmación de diagnóstico patológico; estas pacientes no habían iniciado tratamiento alguno y aceptaron participar voluntariamente en el estudio, firmando un consentimiento informado. Las mujeres se incluyeron en el estudio luego de la confirmación patológica de diagnóstico de NIC III y CC invasivo.

Las suspensiones celulares se centrifugaron a 3,000 g por 10 min; a los precipitados obtenidos se les adicionó 1 ml de buffer tris-HCl 10 mM (pH 8.3). Las muestras se dejaron en ebullición durante 10 min y luego se realizó una centrifugación a 3,000 g por un minuto y el sobrenadante se utilizó directamente para realizar las PCRs. Las muestras de sangre periférica, se centrifugaron por 20 minutos a 3,000 g, la capa superior de plasma fue trasferida a tubos de microcentrífuga y centrifugada por 3 min a 8,000 g para eliminar restos celulares. La extracción se realizó mediante un kit comercial QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany) utilizando el protocolo sugerido por el fabricante. A las muestras de ADN de plasma, se les realizó un proceso de restauración de los fragmentos de cadena sencilla del ADN utilizando como templado la cadena complementaria; este procedimiento se realizó antes de ser utilizado para las PCRs, y consistió en una mezcla de ADN de plasma no restaurado, Tris-HCl 10 mM, 50 mM KCl, 0.1% triton X-100, MgCl₂3 mM y 200 uM de cada dNTPs incubadas a 55°C por 60 minutos, luego se adicionó 1U de Taq polimerasa y se incubó a 72°C durante 20 minutos⁸.

Calidad del ADN. Los sobrenadantes de los cepillados cervicales y los ADN de plasma sin restaurar y restaurados, se utilizaron como moldes para amplificar el gen de b-globina, mediante los iniciadores PCO3 (sentido) 5' ACACAACTGTGTTCACTAGC 3' y PCO4 (antisentido) 5' CAACTTCATCCACCTTCA CC 3'. Las concentraciones finales utilizadas fueron Tris-HCl 10 mmM, 50 mM KCl, 0.1% triton X-100, MgCl₂3 mM, 7.5 pmol de cada iniciador, Taq polimerasa 1U y 200 uM de cada dNTPs. La amplificación se realizó en el termociclador MyCycler^TM(BioRad Laboratorios, USA), las condiciones fueron 1 ciclo a 95°C durante 3 minutos y 40 ciclos a 95°C por 20 seg, 58°C por 20 seg y 72°C por 20 seg. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en agarosa al 2% y teñida con bromuro de etidio 10 mg/ml, con un producto esperado de 110 pb. Como control positivo se utilizó ADN linfocitario de aproximadamente 25 ng y como control negativo la mezcla de la PCR⁸.

Detección viral y tipificación de VPH. Para la detección genérica del VPH, se realizó una PCR con los iniciadores GP5+ (S) 5' TTTGTTACTGTGGTAGATA CTA 3' y GP6+ (A) 5' GAAAAATAAACTGTAAAT CATA 3'. Las concentraciones finales utilizadas fueron Tris-HCl 10 mM, 50 mM KCl, 0.1% triton X-100, MgCl₂3 mM, 0.3 uM de cada iniciador, Taq polimerasa 1U y 200 uM de cada dNTPs, las condiciones de amplificación fueron 1 ciclo a 95°C durante 4 min y 40 ciclos a 95°C por 1 min, 47°C por 1 min y 72°C por 1.5 min. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en agarosa al 2% y teñida con bromuro de etidio 10 mg/ml. En las muestras positivas para VPH, con el sobrenadante de los cepillados cervicales y el ADN de plasma restaurado, se realizó tipificación viral por PCR convencional de la región E6/E7 de los tipos virales 16 y 18 (VPH 16 iniciadores: sentido 5' ATCATCAAGAACACGTAG AG 3' y antisentido 5' GATCAGTTGTCTCTGGTTGC AAAT 3' y VPH 18 el sentido 5' GATTTCACAACAT AGCTGGG 3' y el antisentido 5' TGCCTTAGGTCCA TGCATAC 3'). Las concentraciones finales utilizadas fueron las mismas que para la detección genérica del VPH. Las condiciones de amplificación fueron 1 ciclo a 94°C durante 2 min y 40 ciclos a 94°C por 30 seg, 60°C por 30 seg y 72°C por 30 seg. Los productos de la PCR fueron analizados por electroforesis en agarosa al 2% y teñida con bromuro de etidio 10 mg/ml. El volumen final utilizado fue de 50 ul para la PCR genérica y 25 ul para la PCR tipo específica. Como control positivo para las PCR genérica y tipo viral específica se utilizaron plásmidos pBR322 para VPH 16 y 18, provenientes del Centro de Referencia para Papilomas Humanos del DKFZ (German Cancer Research Center, Heidelberg, Alemania) y como control negativo la mezcla de la PCR.

Análisis de mutaciones en H-ras, K-ras y EGFR. Tanto en los cepillados cervicales como en el ADN restaurado de plasma, se buscaron mutaciones en el codón 12 de H-ras, codones 12 y 13 de K-ras y de exón 21 de EGFR: para ello se realizó una PCR convencional para cada gen en donde se incluyera el fragmento a analizar, los iniciadores utilizados y el tamaño de los productos esperados (Cuadro 1). Las concentraciones finales utilizadas fueron Tris-HCl 10 mM, 50 mM KCl, 0.1% triton X-100, MgCl₂3 mM, 7.5 pmol de cada iniciador, Taq polimerasa 1U y 200 uM de cada dNTPs, con un volumen final de 25 ul.

Las condiciones de amplificación utilizadas fueron 1 ciclo a 94ºC por 5 min, seguido por 35 ciclos de 94ºC por 30 seg; 60ºC por 30 seg para los genes H-ras y K-ras y 58ºC para el gen de EGFR y 72ºC por 30 seg y una elongación final a 72ºC por 5 min, realizadas en el termociclador MyCycler^TM(BioRad Laboratorios, USA).

Los productos de la PCR fueron purificados mediante el kit Wizard® DNA Clean-up System de Promega, siguiendo las recomendaciones del fabricante y secuenciados en el ABI 3730xl (Applied Biosystems, Foster City, CA) en McLab San Francisco (USA).

Consideraciones éticas. El estudio respetó los aspectos éticos y legales de la investigación en seres humanos, según lo estipulado en la Resolución N° 008430 de 1993 del Ministerio de Salud de la República de Colombia y según la Declaración de Helsinki de 1975 modificada en 2004. Las pacientes incluidas en el presente estudio, aceptaron participar voluntariamente después de leer y entender el consentimiento informado el cual fue aprobado por Comité de Ética de la Universidad Javeriana y Universidad Nacional.

Análisis estadístico. Se desarrolló una base de datos con la información de cada paciente en formato .xls de Microsoft Excel®. El procesamiento de los datos se realizó mediante un análisis descriptivo univariado construyendo tablas y gráficas, elaboradas con los estadígrafos para las variables cualitativas como presencia o ausencia de VPH y presencia o no de mutaciones en los codones analizados. Se obtuvo la distribución porcentual de frecuencias y se utilizó pruebas de asociación entre muestras de plasma y cepillados cervicales mediante la prueba de Pearson chi cuadrado.

Todos los ADNs obtenidos evidenciaron una buena calidad, medida con la amplificación mediante PCR del gen b-globina, además, se observó que el proceso de restauración mejora la calidad del ADN de plasma, aumentando la sensibilidad de la amplificación de este gen (Figura 1), evidenciado con un incremento en la densidad óptica relativa (DOR), con una media en el ADN de plasma sin restaurar de 427,2 comparada con la media de DOR del ADN restaurado que fue de 1031,2 y una desviación estándar de 286,3 y 183,4 respectivamente. De las 26 muestras de cepillados cervicales, 100% y 84.6% de las de plasma mostraron resultados positivos para la detección de VPH genérico mediante la amplificación de un segmento de la región L1 del virus con un amplímero esperado de 142 pb (Cuadro 2), observándose una asociación entre la muestra de plasma y los cepillados cervicales para la detección de VPH con una p de 0.0374.

La tipificación viral (VPH 16 y VPH 18), en muestras de cepillados cervicales fue de 61.5% para VPH16 y de 11.5% para VPH 18 (Cuadro 3). En plasma el tipo viral 16 estuvo presente en 50% de las muestras y el tipo viral 18 en 11.5% de las muestras (Cuadro 4). En 2 pacientes tanto con diagnóstico cáncer cervical invasivo (CC), como de NIC III no fue posible detectar en forma específica el VPH en plasma sanguíneo. En general, para el tipo viral 16 hubo datos similares entre las muestras de plasma sanguíneo y las muestras de cepillado cervical con 50% y 61.5% respectivamente; para el tipo viral 18 fueron promedios de 11.5% y 11.5% respectivamente.

Se verificó el producto amplificado de los genes K-ras, H-ras y EGFR en las muestras estudiadas, con una buena amplificación tanto en las muestras de plasma restaurado como en cepillados cervicales (Figura 2).

Las secuencias de cada gen en estudio muestran que para EGFR todas las muestras presentaban isoforma A de este gen y no hubo mutaciones puntuales en el exón 21. Para el gen H-ras, no se evidenciaron mutaciones en el codón 12; sin embargo, en dos muestras analizadas tanto en muestras de plasma como en cepillado cervical, se encontró un cambio de nucleótido en el codón 27 (CAT/CAC), que es silenciosa, debido a que no cambia el aminoácido básico de histidina traducido (Figura 3).

Además. se encontró una asociación entre lo observado entre plasma y cepillado cervical con una p de 0. El gen K-ras no presentó mutaciones en los codones 12 ni 13; sin embargo, en el codón 11 se encontró un cambio de nucleótido (GCT/CCT) en todas las muestras analizadas, observándose una asociación en los dos tipos de muestras con una p de 0. Esta mutación, cambia el aminoácido traducido de alanina por prolina; sin embargo, aún cuando estos dos aminoácidos presentan la misma naturaleza apolar, esta modificación debe conducir a modificaciones conformacionales importantes en la proteína por el carácter rígido de la prolina (Figura 3).

DISCUSIÓN

El ADN tanto genómico como viral puede ser detectado en plasma de pacientes con NIC III y CC invasivo, mostrando al plasma como una herramienta con valor diagnóstico y pronóstico³. Sin embargo, este ADN puede haber sufrido rompimientos en una de sus cadenas, con lo cual el procedimiento de restauración permite llenar estas zonas, tomando como molde la cadena complementaria, mejorando de esta manera la eficiencia de la PCR, pues el proceso de restauración no incluye ciclos repetitivos de síntesis y denaturación caraterísticos de la PCR, no es un tratamiento que incremente el tamaño del ADN molde, sino que repara las cadenas de modo que los iniciadores encuentran con mayor eficiencia su secuencia blanco⁸. El porcentaje de detección del VPH en raspados (100%), se correlaciona con los resultados de Bosch et al.⁹, (70%-100%). Con referencia a los resultados obtenidos en plasma de pacientes con NIC III y CC invasivo, la positividad de ADN de VPH fue 84.6%, cifra mayor a la obtenida por Wei et al.⁴, de 64.7% y la de Widschwendter et al.¹⁰, 2003 que fue de 45%; en estos dos estudios los datos obtenidos en plasma o suero respectivamente fue comparada con tejido tumoral cervical, que se asocia directamente con el proceso de restauración realizado, el cual mejora la calidad del ADN libre encontrado en plasma. En cuanto al tipo viral 16 presente en 615% se correlaciona con los resultados encontrados por Rabelo-Santos et al.¹¹ en Brasil (57.1%); para VPH 18 la prevalencia fue de 11.5%. Resultados similares fueron encontrados por Bosch et al.¹², y Muñoz et al.¹³, 14% y 13.6% respectivamente. En plasma sanguíneo, se encontró que el tipo viral 16 estuvo presente en 50% de las muestras y el tipo viral 18 en 11.5%. Sin embargo, los datos hasta ahora descritos por otros autores son muy bajos, ya que la detección genérica de VPH es baja y por ende la tipificación también se reduce drásticamente; por ejemplo en el estudio realizado por Dong et al.³, los porcentajes obtenidos fueron 3.4% para VPH 16 y 2.2% de VPH 18.

Para las alteraciones génicas se analizó el exón 21 de EGFR (ErbB1), el cual no presentó mutaciones, similar a los resultados en cáncer de esófago¹⁴. Para el gen H-ras, no se encontró mutación en el codón 12 similar a los resultados de Mammas et al.⁵, Vachtenheim et al.¹⁵, pero se observó un polimorfismo en el codón 27 (CAT/CAC) en 2 muestras tanto de plasma como de cepillado cervical, resultados similares a los encontrados por Lev et al.¹⁶ en células de melanoma. El gen K-ras tampoco se encontró mutado en los codones 12 y 13, correlacionándose con los resultados de Pochylski y Kwasniewska¹⁷; sin embargo, se encuentran mutaciones en el codón 11 (GCT/CCT) cambiando una alanina por prolina en todas las muestras analizadas, similar a los resultados de Gu et al.¹⁸ y de Hongyo et al.¹⁹ En general se encontró una buena correlación entre los resultados de mutaciones de los genes H-ras, K-ras y EGFR encontrados en plasma sanguíneo con los cepillados cervicales, resultados concordantes con lo encontrado por Dong et al.³, donde demostraron que las mismas mutaciones en oncogenes pueden ser evidenciadas tanto en ADN plasmático como en ADN tumoral.

En conclusión, el uso del ADN presente en el plasma puede ser relevante para el análisis de mutaciones y de la presencia de marcadores tumorales cuando no se dispone de otras muestras.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos en especial al Departamento de Farmacia y al Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (Bogotá, Colombia), a la DIB por su apoyo financiero para la ejecución de este trabajo, Código 20100000 y al doctor Antonio Huertas Salgado del Instituto Nacional de Cancerología por su apoyo en el análisis de las secuencias y al doctor Fabián Carrillo por su colaboración en la traducción a inglés del presente artículo.

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