Henry Jurado-Gámez²
Verónica Jarrín-Jarrín³

¹ Proyecto financiado por la Vicerrectoría de Postgrados y Relaciones Internacionales (VIPRI) de la Universidad de Nariño.
² Ph.D. en Ingeniería de Alimentos. Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Pecuarias, Departamento de Producción y Procesamiento Animal, Programa de Zootecnia - Grupo de Investigación Fise-Probiotec. Pasto, Colombia. Correo electrónico: henryjugam@gmail.com
³ M.Sc. Universidad de Nariño, Facultad de Agroindustria, Programa de Agroindustria. Pasto, Colombia. Correo electrónico: jarrin.veronica@gmail.com

Introducción: Las bacterias ácido-lácticas se han estudiado por su capacidad de crecer en ambientes difíciles y generar antagonismos con otros microorganismos. La presente investigación buscó determinar los parámetros de la cinética de crecimiento de Lactobacillus lactis y su efecto probiótico sobre Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus. Materiales y Métodos: Se evaluó el crecimiento de la cepa láctica a concentraciones de 0,5, 1 y 2% de sales biliares; 1 y 1,5% de bilis; tres niveles de pH (2,5, 4,5 y 7) y dos de temperaturas (38 y 45ºC). También se evalúo la susceptibilidad de todas las cepas a los antibióticos Dicloxacilina, Cefepime, Cefalotina, Ciprofloxacina, Pentamicina y Penicilina con la técnica de Kirby-Bauer. Se determinó la inhibición de L. lactis y su sobrenadante en E. coli, S. typhimurium, C. perfringens y S. aureus y se estimaron los parámetros de: crecimiento, pH, consumo de azúcar, acidez y consumo de proteína durante la cinética de fermentación en medio MRS. Se determinaron péptidos presentes en el sobrenadante de L. lactis mediante HPLC. Resultados: Se obtuvo un crecimiento de 1,2 x 109 y 4,1 x 109 ufc/ml a 1,2% de bilis y a 0,5% de sales biliares; 1,1 x 1011, 2,1 x 1010 y 1,0 x 1010 ufc/ml para pH 2,5, 4,5 y 7 respectivamente; y 1,7 x 1013 y 1,4 x 1013 ufc/ml para 45 y 38ºC. La cepa láctica presentó resistencia a Dicloxacilina y Cefalotina; C. perfringens, a Dicloxacilina y Penicilina; S. typhimurium y E. coli, a Cefalotina; y S. aureus, a Dicloxacilina. L. lactis inhibió a E. coli y C. perfringens, y el sobrenadante incluyó a S. aureus. Conclusión: Se concluye que L. lactis presenta adecuados crecimientos en condiciones in vitro e inhibió a E. coli, C. perfringens y S. aureus pero no a S. typhimurium.

Palabras clave: probiótico, crecimiento, antagonismo microbiano, bacteria patógena, Lactobacillus lactis.

Introduction: Acid lactic bacteria have been studied for their ability to grow in harsh environments and generate antagonisms with other microorganisms. The present study sought to determine the kinetic parameters of growth of Lactobacillus lactis and its effect on Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens and Staphylococcus aureus. Materials and Methods: The growth of the lactic strain was evaluated at concentrations of 0.5, 1 and 2% bile salts; 1 and 1.5% bile; three levels of pH (2.5, 4.5 and 7) and two temperatures (38 and 45ºC). Susceptibility of all strains to Dicloxacillin, Cefepime, Cephalothin, Ciprofloxacin, Gentamicin and Penicillin was also evaluated using Kirby-Bauer technique. Inhibition of L. lactis and its supernatant in E.coli, S. typhimurium, S. aureus and C. perfringens and the following parameters were determined and estimated: growth, pH, sugar consumption, acidity and protein consumption during the kinetic fermentation in MRS. Peptides present in the L. lactis supernatant through HPLC were determined. Results: Growth of 1.2x109 and 4.1x109 CFU/ml at 1.2% bile and 0.5% bile salt was obtained; 1.1x1011, 2.1x1010 and 1.0x1010 CFU/ml for 2.5, 4.5 and 7 pH respectively; and 1.7x1013 and 1.4x1013 CFU/ml for 45 and 38ºC. The lactic strain showed resistance to Cephalothin and Dicloxacilin; C. perfringens, to Penicillin and Dicloxacillin; S. typhimurium and E. coli to Cephalothin; and S. aureus, to Dicloxacillin. L. lactis inhibited E. coli and C. perfringens, and the supernatant included S. aureus. Conclusion: It is concluded that L. lactis present adequate growth in conditions in vitro and inhibited E. coli, C. perfringens and S. aureus but not S. typhimurium.

Key words: probiotic, growth, microbial antagonism, pathogenic bacteria, Lactobacillus lactis.

Las bacterias ácido-lácticas son un grupo de bacterias Gram-positivas que tiene como característica común la producción de ácido láctico a través de la fermentación de carbohidratos (1). Además, son microorganismos catalasa negativos y no productores de gas (2). Dentro de este grupo, los más importantes pertenecen al género Lactobacillus, conocidos como GRAS (Generalmente Reconocidos como Seguros) y considerados benéficos por su capacidad de digerir proteína, carbohidratos y grasas de los alimentos, cualidad que les permite ayudar al organismo huésped en la absorción de nutrientes esenciales como minerales, aminoácidos y vitaminas (3). Otra característica importante es su capacidad para inhibir otros microorganismos como bacterias patógenas causantes de problemas a nivel agroindustrial y sanitario (4).

Los principales mecanismos antagónicos de las bacterias ácido-lácticas son su capacidad de reducir el pH del medio, la producción de biocinas y la producción de ácidos orgánicos (5). El primero genera un ambiente inadecuado para el crecimiento de otros microorganismos, que necesitan pH cercanos a la neutralidad para sobrevivir en el medio (6). Las biocinas o bacteriocinas son sustancias proteínicas que actúan sobre la pared celular de otras bacterias generando la muerte, estas se han hecho importantes debido a su aplicación en la preservación de alimentos con la consecuente reducción de preservantes químicos (7, 8). Los ácidos orgánicos aumentan la acidez del medio e inhiben el crecimiento de otras bacterias (9).

Los antibióticos son utilizados en el tratamiento de enfermedades bacterianas, sin embargo, las bacterias son seres vivos con una alta adaptabilidad y pueden desarrollar resistencia a los antibióticos (12). La resistencia es un factor natural de las bacterias, pero este proceso se ha visto acelerado por el uso indiscriminado de los antibióticos, ya sea administrados a humanos o a animales (13). Las bacterias transmiten la resistencia a las siguientes generaciones, de esta manera se ejerce una presión de selección sobre aquellos microorganismos resistentes a los antibióticos, por lo cual, cada vez se hace más difícil el control de bacterias que producen graves enfermedades para el ser humano (14).

Lactobacillus lactis es una bacteria ácido-láctica que se ha estudiado por presentar características adecuadas como probiótico, presenta un antagonismo a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (15). Una de sus principales características es la producción de nisina (bacteriocina), que le permite reducir las poblaciones bacterianas patógenas presentes en alimentos (16). Se encuentra en gran variedad de ambientes, desde el tracto gastrointestinal hasta productos fermentados como el yogurt (17). De igual manera, reduce el pH del medio y produce ácidos orgánicos que también afectan a microorganismos no deseados (18).

El objetivo de la presente investigación fue determinar los parámetros de la cinética de crecimiento de Lactobacillus lactis y su efecto probiótico sobre Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus.

Se usaron cepas de Lactobacillus lactis ATCC® 11454, Escherichia coli ATCC® 25922, Salmonella typhimurium ATCC® 25241, Clostridium perfringens ATCC® 13124 y Staphylococcus aureus ATCC® 25923, que fueron reconstituidas de acuerdo con la casa fabricante. Las cepas fueron repicadas, para su conservación, en medio sólido y líquido cada 5 y 8 días respectivamente. Para la cepa láctica se usó medios MRS (sólido y líquido), mientras que las bacterias patógenas se reconstituyeron en caldo BHI como medio líquido y como medio sólido agar MacConkey para E. coli, agar XLD para S. typhimurium, agar SPS para C. perfringens y agar BD Baird-Parker para S. aureus. Todas las bacterias fueron incubadas a 37ºC durante 24 h y se refrigeraron a 4ºC para su posterior uso.

El inóculo de L. lactis se obtuvo de la siguiente manera: en un Erlenmeyer con 40 ml de caldo MRS estéril, se depositó una alícuota de la cepa láctica y se incubó a 35ºC por 24 h (preparado a). Al terminar el periodo de incubación, se tomaron 4 ml del preparado a y se depositaron en un nuevo Erlenmeyer con otros 40 ml de caldo MRS estéril al cual denominamos preparado b, este se incubó a la misma temperatura y tiempo de la primera incubación.

El ajuste del inóculo fue realizado a 10% v/v mediante la metodología de Crueger y Crueger (19), para ello se prepararon 90 ml de caldo MRS estéril y se añadieron 10 ml del preparado b. Después se realizó el conteo de bacterias por ml. Para el conteo se tomó 1 ml y se realizó lectura directa en espectrofotómetro a 625 nm. En los casos donde la población fue mayor a la establecida, se adicionó caldo estéril mediante cálculo de proporcionalidad, de la siguiente manera:

M₁ = población o densidad celular que se debe ajustar.
M₂ = 0,125 densidad óptica equivalente a 1,50 x 10⁸ ufc/ml. Densidad utilizada primera fermentación. ]]> V₁ = 1 ml volumen proveniente del inóculo total (10/90)l
X₁ = cantidad que contiene M₂.
V₂ = lo que se agrega a 1 ml para ajustar a 1,50 x 10⁸ ufc/ml.
V₃ = 100 ml cantidad total del inóculo.
X₂ = cantidad de caldo MRS comercial estéril que se agrega a V₃ para ajustar la población al valor de M₂.
Encontramos entonces X₁
M₁ ------ M₂
M₂ ------ X₁

Se evaluó el crecimiento in vitro de la cepa láctica, bajo tres concentraciones de sales biliares (0,5, 1 y 2%) y dos de bilis bovina (1 y 1,5%). Para cada concentración se cultivó la bacteria en MRS por 24 h, luego se tomaron alícuotas del cultivo y se depositaron en tubo de ensayo con caldo MRS en las concentraciones requeridas. De los tubos, se tomaron muestras, que se trasladaron a cajas de Petri con MRS y azul de anilina y se incubaron a 32ºC por 48 h. Al terminar la incubación se realizó recuento de bacterias para cada muestra.

Se determinó la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos Dicloxacilina (DCX 1 ug), Cefepime (FEP 30 ug), Cefalotina (KF 30 ug), Ciprofloxacina (CIP 5 ug), Gentamicina (CN 10 ug) y Penicilina (P 10 IU) mediante la técnica de Kirby-Bauer (22).

Se evaluó el efecto de inhibición de L. lactis en las bacterias patógenas con la metodología propuesta por Tagg y McGiven (23) ajustada a las condiciones de nuestro laboratorio, de la siguiente manera: se tomó una alícuota de cada bacteria patógena y fue ajustada a 0,5 en escala MacFarland, luego se depositó en cajas de Petri con agar Müeller-Hinton; sobre las cajas de Petri se colocaron discos de agar impregnados con L. lactis en concentraciones de 25, 50 y 100 ul. Finalmente, las cajas fueron incubadas a 32ºC por 24 h. Transcurrido este tiempo, se midió la distancia del halo producido por la bacteria láctica, se utilizó como criterio de inhibición halos superiores a 2 mm (9).

También, se determinó el efecto de inhibición del sobrenadante de L. lactis sobre las bacterias patógenas con la metodología de Kirby-Bauer (22) modificada. Para obtener el sobrenadante se ajustó la bacteria láctica a 1 en escala MacFarland, se tomaron muestras de 1,5 ml y fueron depositadas en tubos Eppendorf para centrifugar a 15000 rpm y 4ºC por 15 min. Se separó el sobrenadante y se dividió en dos partes, la primera sin filtrar y la segunda filtrada con papel filtro de 0,25 um. Para la prueba se utilizaron dos metodologías, la primera usando discos de papel pads, y la segunda cilindros plásticos (24), sobre cada uno (discos y cilindros) se depositaron concentraciones de 50, 75 y 100 ul mediante micropipeta y se llevaron a incubación a 32ºC por 24 h.

Se evaluó la cinética de fermentación en un medio no comercial PRO (25) y el medio comercial MRS. El procedimiento fue el mismo para ambos medios: en un Erlenmeyer se colocaron 60 ml de inóculo de L. lactis y 540 ml de medio, se incubó a 32ºC y 100 rpm, sin control del pH. Se midió el crecimiento cada 2 h 24 min por 24 h (ufc/ml). Para ello se realizó dilución de 1 ml de muestra en 9 ml de agua peptonada al 0,1%, se realizaron diluciones decimales y se transfirieron a caja de Petri con medio MRS y azul de anilina (0,1 ml) para siembra en superficie, las cajas se incubaron a 32ºC por 24 h, solo se tuvieron en cuenta los conteos entre 30 y 300 colonias, el número de colonias se multiplicó por el inverso de la dilución y 10 para obtener ufc/ml (26).

Durante la cinética de fermentación, únicamente en el medio MRS, se realizaron mediciones de pH, con un pHmetro digital; azúcar total, con el método de Dubois et al. (27); acidez mediante titulación con hidróxido de sodio (1N) (28) y proteína con el método de Lowry et al. (29). Los datos de crecimiento en el medio MRS se determinaron mediante la metodología de Crueger y Crueger (19) y Rodríguez-León et al. (30). Se estableció la velocidad máxima de crecimiento a través de la siguiente ecuación:

y el tiempo de duplicación celular (td), se determinó teniendo en cuenta la ecuación:

Se determinó la viabilidad de L. lactis a dos temperaturas (38 y 45ºC). La cepa fue evaluada hasta las 14 h 24 min (se tuvo en cuenta el tiempo necesario para llegar a la fase exponencial en el medio MRS). Se usó el procedimiento descrito por Crueger y Crueger (19), con ajuste del inóculo a 0,125 en escala de McFarland. Luego se hicieron diluciones de 10^-1 hasta 10^-12 con agua peptonada y se sembró en cajas de Petri con azul de anilina, enseguida se inició en la dilución 10^-8 hasta 10^-12 a 37ºC y 48 h, finalmente se determinó el número de ufc/ml.

Los procedimientos estadísticos se realizaron en el paquete SAS 9.1 (31). Se evaluó el crecimiento de los medios MRS y PRO durante la cinética de fermentación con el usó de medidas repetidas en el tiempo (PROC MIXED de SAS). y_ijk = u + A_i + B_k + (A*B)_ik + e_ij + e_ijk

y_ijk: observación ijk.
u: media general.
A_i: efecto de tratamiento.
B_k: efecto del tiempo.
(A*B)_ik: efecto de interacción entre los tratamientos i y el tiempo k.
e_ij: error aleatorio y covarianza entre medidas repetidas.
e_ijk: error aleatorio.

Los resultados obtenidos en la prueba de inhibición con el sobrenadante (discos y cilindros plásticos) fueron correlacionados (Correlación de Pearson, PROC CORR de SAS), y los parámetros pH, acidez, azúcar y ácido láctico de la cinética de fermentación se relacionaron con el crecimiento (ufc/ml), mediante regresión lineal simple (PROC REG de SAS).

donde:

Y: variable a evaluar.
B₀: intercepto.
B_1x: pendiente.
e: error.

Las pruebas de bilis bovina mostraron que L. lactis no crece a concentraciones de 1% pero sí a 1,2% con un valor promedio de 1,2 x 109 ufc/ml. Las pruebas de sales biliares mostraron crecimientos únicamente a 0,5% con un valor promedio de 4,1 x 109 ufc/ml. Las pruebas de catalasa y gas fueron negativas. El crecimiento a diferentes pH demostró que la cepa láctica presenta viabilidad al final de las tres horas, con valores de 1,1 x 1011, 2,1 x 1010 y 1,0 x 1010 ufc/ml para pH 2,5, 4,5 y 7 respectivamente.

Los resultados de la prueba de susceptibilidad a los antibióticos se observan en la Tabla 1 y en la Figura 1. La cepa láctica presentó resistencia a la Dicloxacilina y Cefalotina; C. perfringens, a Dicloxacilina y Penicilina; S. typhimurium y E. coli, a Cefalotina; y S. aureus, a Dicloxacilina.

La prueba de inhibición de L. lactis mostró susceptibilidad de C. perfringens y E. coli en las tres concentraciones (25, 50 y 100 ul); S. tiphymurium a 100 ul; y S. aureus no fue inhibida en ninguna de las concentraciones (Tabla 2 y Figura 2).

Valores iguales o superiores a 2 mm muestran susceptibilidad (19).

La evaluación mediante el sensidisco impregnado de sobrenadante de L. lactis inhibió a S. aureus en las tres concentraciones (50,75 y 100 ul); C. perfringens y S. tiphymurium a 50 ul; y E. coli no fue inhibida (Tabla 3 y Figura 2). Mediante la metodología de cilindros se encontró que S. aureus era susceptible a todas las concentraciones y S. tiphymurium a 100 y 50 ul para el sobrenadante filtrado y sin filtrar respectivamente.

No se encontró correlación entre los dos métodos usados (sensidisco, cilindro) para evaluar la inhibición del sobrenadante (Corr: 0,2658; p-value: 0,2092).

La fase exponencial de L. lactis se obtuvo a las 14 h 24 min con un crecimiento de 1,3 x 1013 ufc/ml en el medio MRS; durante este periodo se observó un valor de 4,26 en el pH; 0,806% en la acidez, 1,24 mg/L de proteína y 2,70 mg/L de azúcar. El análisis de regresión mostró un valor de 0,0339 para acidez (R2: 0,794; p-value: 0,00437); -0,3834 para azúcar (R2: 0,530; p-value: 0,03849); -0,1936 para pH (R2: 0,735; p-value: 0,0084); y -0,0050 para proteína (R2: 0,023; p-value: 0,741). Los datos de la cinética de crecimiento se pueden observar en la Tabla 4.

La prueba de viabilidad de la bacteria láctica a dos temperaturas mostró crecimientos adecuados con valores de 1,7 x 1013 y 1,4 x 1013 ufc/ml para 45 y 38ºC respectivamente, a las 14 h 24 min (fase exponencial).

El análisis del sobrenadante de L. lactis por HPLC mostró una cadena de péptidos VAL-TIR-VAL en el tiempo 11,842 con una concentración de 0,66 mg/ml de muestra (figuras 4 y 5; tablas 5 y 6).

Para determinar la viabilidad de cepas probióticas es necesario realizar evaluación de los microorganismos en las condiciones gastrointestinales del animal huésped. Entre los factores que tienen preponderancia para la sobrevivencia de la cepa está su resistencia a la bilis y las sales biliares secretadas por el hígado. Un crecimiento superior a 109 ufc/ml es considerado adecuado para una buena colonización del tracto digestivo (25). De acuerdo con lo anterior, la cepa evaluada demostró apropiados crecimientos para bilis en condiciones in vitro a la concentración más baja. A pesar de no observarse crecimiento en las concentraciones más altas (1 y 2%), la cepa láctica en condiciones gastrointestinales no se verá expuesta a niveles tan elevados, por lo que los resultados encontrados muestran viabilidad de la cepa. Kumer et al. (32) encontraron que las cepas lácticas presentan tolerancia a las sales biliares, además disminuyen el colesterol en el organismo huésped. Iguales resultados fueron encontrados por Hamon et al. (33) cuando evaluaron a L. plantarum. Las sales biliares producen estrés en los microorganismos colonizadores del sistema digestivo. Sin embargo, las bacterias generan respuestas fisiológicas como protección celular, generalmente modifican la membrana celular que les permiten tolerar estos cambios y adaptarse al medio gastrointestinal (34).

Las bacterias ácido-lácticas se caracterizan por ser catalasa negativa, característica observada en la presente investigación (35). La cepa láctica, al no producir gas, evita en el huésped problemas gastrointestinales como el timpanismo (24).

La evaluación a diferentes pH simula el tránsito de la cepa por el tracto gastrointestinal, los diferentes segmentos del tracto digestivo son afectados por variación en el pH del medio. Así, en el estómago se observan pH cercanos a 2 en especies domésticas, mientras que, en el intestino delgado, entre 5 a 7 como consecuencia de la secreción del hígado (36). Los crecimientos encontrados en la investigación muestran la viabilidad de la cepa láctica a estas condiciones, con poblaciones adecuadas para colonizar el tracto digestivo. Los Lactobacillus son considerados acidúricos debido a que crecen a pH inferiores a 5 (37). Su capacidad de resistencia a estos valores se debe a mecanismos celulares que le permiten mantener el pH interno cerca de la neutralidad como la bomba de extracción de protones (38). Otro de los factores que argumentan este comportamiento se debe a su capacidad de producir ácidos orgánicos como resultado de la fermentación de carbohidratos, que con la acumulación disminuyen el pH del medio (39).

Determinar el efecto de inhibición de una bacteria láctica sobre cepas patógenas es importante para establecer su potencial probiótico. Los mecanismos que usa para generar antagonismo con otros microorganismos son varios, entre los que se encuentran producción de biocinas, reducción del pH, producción de ácidos orgánicos y producción de peróxido (40). Los resultados muestran que la cepa láctica inhibe a C. perfringens y E. coli en condiciones in vitro. Sankar et al. (41) encontraron susceptibilidad de E. coli y S. aureus por bacteriocinas producidas por L. plantarum, mientras que Rajaram et al. (42) encontraron que L. lactis inhibió a E. coli y S. aureus. A pesar de que las cepas S. aureus y S. tiphymurium fueron resistentes a la cepa láctica, el sobrenadante inhibió a S. aureus, mostrando un efecto de la cepa en la bacteria patógena. Los resultados encontrados indican que L. lactis posee características adecuadas para el control de tres de las bacterias patógenas evaluadas. Los resultados encontrados entre metodologías para evaluar al sobrenadante fueron similares a otros estudios realizados por el autor (24). La metodología de cilindros debe continuar en evaluación con el fin de obtener suficiente información que permita determinar resultados válidos para su estimación.

El crecimiento durante la fase exponencial demostró eficiencia de la cepa láctica en la producción de inóculos, ya sea para su producción a nivel industrial, como para su crecimiento a nivel gastrointestinal. El pH alcanzado durante la fase exponencial es cercano a 4, sin embargo, se observa que el pH del medio descendió hasta un valor de 3,8 demostrando el efecto de reducción del medio producido por la cepa láctica. Este descenso es importante, ya que permite inhibir el crecimiento de otras bacterias (43). La producción de ácido láctico está estrechamente relacionada con la reducción del pH; entre los productos de la fermentación de L. lactis se encuentra el ácido láctico y con ello el aumento de la acidez del medio (44). El porcentaje de consumo de azúcar fue de 92,41% durante todo el periodo de fermentación, esto demuestra el buen uso del nutriente por parte de la cepa láctica y, de manera indirecta, la producción de ácidos orgánicos como productos de la fermentación (45).

Se concluye que L. lactis presenta parámetros de crecimiento adecuados en condiciones in vitro que simulan el ambiente del sistema digestivo, puede inhibir el crecimiento de E. coli, C. perfringens y S. aureus, pero no a S. typhimurium en condiciones in vitro y tolera temperaturas internas de su huésped.

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