DOI: http://dx.doi.org/10.18684/BSAA(14)69-77

¹Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Grupo de investigación CIDE. PhD. Fitomejoramiento. Tunja, Colombia.

²Universidad de los Llanos, Grupo de investigación Biotecnología. PhD. Fitomejoramiento. Villavicencio, Colombia.

³Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, Grupo de investigación Ecofisiología Vegetal. Estudiante de Maestría en Fisiología Vegetal. Tunja, Colombia.

Correspondencia: ana.morillo@uptc.edu.co

Recibido para evaluación: 24 de Octubre de 2015. Aprobado para publicación: 12 de Marzo de 2016.

RESUMEN

Boyacá es uno de los departamentos de Colombia pionero en la producción nacional de caducifolios, especialmente duraznos, ciruelos, peras y manzanas. Con ocho cebadores Microsatélites Amplificados al Azar (RAMs) se evaluaron once materiales de manzana (Malus communis), siete de peras (Pyrus communis), dos de albaricoque (Prunus armeniaca L.) y uno de almendro (Prunus amigdalus L.), que hacen parte de la colección de caducifolios que tiene la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Se generaron un total de 128 bandas con pesos moleculares entre 250 y 1300 Kb. A un nivel de similitud de 0,55 se formaron dos grandes grupos y subgrupos de acuerdo principalmente a la especie a la cual pertenece y a las características del fruto. El número de loci polimórficos varió entre 96 y 123 para los cebadores ACA y CGA, respectivamente. El valor promedio de heterocigosidad fue de 0,34, más bajo que los encontrados en estudios de diversidad genética en el género Malus y Pyrus. Los índices de similitud y las distancias genéticas corroboran la sintenia que existe entre estos genomas la cual puede ser aprovechada para la identificación de genes, mapeo comparativo e hibridación interespecífica.

PALABRAS CLAVE:Diversidad genética, Microsatélites RAMs, Caducifolios.

ABSTRACT

Boyacá is one of the departments of Colombia pioneer in the national production of deciduous, especially peaches, plums, pears and apples. Eight Random Amplified Microsatellite primers (RAMs) were evaluated in eleven apple (Malus communis), seven pears (Pyrus communis), two apricots (Prunus armeniaca L.) and one almond (Prunus amigdalus L.) materials from deciduous collection of the Pedagogical and Technological University of Colombia. A total of 128 bands were generated with molecular weights ranging between 250 and 1300 Kb. Two groups and subgroups were formed, a similarity coefficient of 0,55, according to specie and fruit characteristics. The number of polymorphic loci ranged between 96 and 123 for CGA and ACA primers, respectively. The average value of heterozygosity was 0,34, much lower than values found in other genetic diversity studies in the genus Malus and Pyrus. Similarity index and genetic distances corrobate the synteny between these genomes which can be taken advantage for identifying of genes, comparative mapping and interspecific hybridization.

RESUMO

Boyacá é um dos departamentos da Colômbia pioneiro na produção nacional de folha caduca, especialmente pêssegos, ameixas, peras e maçãs. Foram avaliados oito primers Random Amplified microssatélites (RAMs) materiais onze macieira (Malus communis), sete pêra (Pyrus communis), dois de damasco (Prunus armeniaca L.) e um amêndoa (Prunus amigdalus L.), que fazem parte do conjunto de sites de folha caduca que tem a Universidade Pedagógica e Tecnológica da Colômbia. Um total de 128 bandas com pesos moleculares 250-1300 Kb foram gerados. Em um nível de similaridade de 0,55 dois grupos e subgrupos de acordo principalmente com a espécie a que pertence e características dos frutos foram formados. O número de loci polimórficos variou entre 96 e 123 para o ACA e iniciadores CGA, respectivamente. O valor médio dos heterozygosity foi de 0,34, inferior aos encontrados em estudos de diversidade genética do gênero Malus e Pyrus. Índices de similaridade e distâncias genéticas corroboram sintenia entre esses genomas que podem ser exploradas para a identificação de genes, mapeamento comparativo e interespecífica hibridação.

PALAVRAS-CHAVE:Diversidade genética, Microssatélites RAMs, Decídua.

INTRODUCCIÓN

La familia Rosaceae contiene más de 3000 especies, muchas de ellas árboles frutales de importancia económica tales como la manzana, pera, albaricoque, cereza, durazno y ciruelo. Las peras son uno de los principales frutos pepita más cultivados en las regiones templadas. Las peras chinas (Pyrus pyrifolia Nakai) y las peras Europeas (Pyrus communis L.) son las dos especies de peras más comerciales en todo el mundo [1]. Las principales regiones productoras son, Asia (77,9%), Europa (11%) y América (7,5%) [2]. La manzana es una de las especies de fruta dulce de mayor difusión a escala mundial debido a su facilidad de adaptación a diferentes climas y suelos, su valor alimenticio, nutricional, terapéutico, calidad y diversidad de productos que se obtienen en su industria transformadora. En cuanto a su distribución geográfica, Asia es el continente que más toneladas produce, (64,2%), siendo China el país más productor. La segunda área geográfica más productiva es Europa, con 19,6%, seguido por América (12,1%), África (3,1%) y Oceanía (1%) [2].

Colombia es un país megadiverso con enorme potencial para aumentar la producción de frutas y el área con frutales, debido a su gran oferta edafoclimática [3]. Boyacá es uno de los departamentos pioneros en la producción nacional de caducifolios, especialmente los municipios de Nuevo Colón (100%) y Jenesano (81,2%), en donde se han encontrado las mayores producciones de peras y manzanas respectivamente [3]. Dada la vocación frutícola del departamento de Boyacá, la facultad de agronomía de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (UPTC) y la Universidad Técnica de Berlín desarrolló en la Granja Experimental de Tunguavita, Paipa, un proyecto para el establecimiento de una colección de materiales caducifolios importados de diferentes pisos térmicos. En el 2008 Puentes y colaboradores [4], realizaron un estudio de caducifolios, teniendo en cuenta sus ventajas comerciales y hallaron que estos son una alternativa económicamente rentable para el departamento de Boyacá.

Los marcadores moleculares más utilizados para la caracterización de colecciones de germoplasma son los de Secuencia Simple Repetida (SSR) o microsatélites en el género Pyrus y Malus se han usado en la identificación de cultivares [6], estudios de autoincompatibilidad [7] mapeo genético [8], identificación de QTLs [9], análisis de secuencias [10] y en la selección asistida por marcadores [11]. Una de las ventajas de los marcadores SSRs es su capacidad de transferibilidad entre las principales especies frutales de la familia Rosaceae [12].

Los estudios de mapeo comparativo suponen que hay un grado de conservación genómica entre las especies lo cual permite la transferencia de información genética, tales como la posición de genes (QTLs). Prácticamente el mapeo comparativo determina el ligamiento entre genes homólogos de taxas relacionadas por alineamiento de los mapas genómicos usando marcadores moleculares ortólogos [13]. En Malus y Pyrus su número cromosómico idéntico (2n=2x=34) y su tamaño de genoma similar (manzana 1,57 pg/2C [14]; pera 1,11 pg/2C [15] sugieren que sus genomas pueden ser co-lineales y con relaciones genéticas estrechas entre los dos [13].

Entre los marcadores microsatélites los RAMs son muy útiles para medir la diversidad genética en plantas y animales e identificar relaciones entre familias, especies y al interior de la especie, además es una metodología factible para pequeños laboratorios, no requiere información previa [16]. Trabajos sobre la diversidad genética en especies frutales caducifolias [17] sugieren que la técnica es útil para identificar duplicados y establecer relaciones entre las especies. Dentro de este contexto, esta investigación tuvo como objetivo caracterizar la diversidad genética con RAMs presente en la colección de manzanas y peras de la UPTC, como una aproximación al planteamiento de estrategias que conduzcan al mejoramiento genético de estas especies.

MÉTODO

Se evaluaron once materiales de manzana (Malus communis), siete de peras (Pyrus communis), dos de albaricoque (Prunus armenica) y uno de almendro (Prunus dulcis), que hacen parte de la colección in situ de caducifolios que tiene la UPTC en la Granja Experimental de Tunguavita en Paipa, ubicada a 36 KM de la ciudad de Tunja con una latitud norte de 5° 47’ 04" y longitud oeste de 73° 07’ 04", temperatura promedio de 15 °C (Cuadro 1).

Caracterización molecular

Las siguientes designaciones son usadas para los sitios degenerados: H (A ó T ó C); B (G ó T ó C); V (G ó A ó C) y D (G ó A ó T).

Para la amplificación se preparó el cóctel en un tubo estéril de microcentrífuga (1,5 mL) para un volumen final de 25 µL. La mezcla de reacción se preparó con buffer 1X, MgCl2 1,5 mM, dNTPs 0,2 mM, Taq Polimerasa 1U, cebador 2 µM y ADN genómico 10 ng.

La amplificación se llevó a cabo en un termociclador PTC-100 Programmable Termal Controller de MJ Research, Inc. La desnaturalización inicial fue de 95ºC durante 5 minutos; 37 ciclos de desnaturalización a 95ºC por 30 segundos, Hibridación: 58ºC (Primer GT, CGA), 50ºC (Primer AG, CA, ACA), y 55ºC (Primer CCA, TG, CT) durante 45 segundos. Con una extensión de 72ºC por 2 minutos y la extensión final a 72ºC durante 7 minutos. Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en geles de agarosa de alta resolución al 1,5% a 90 voltios durante 3 horas visualizándose en un transiluminador.

Análisis estadístico de datos

Se generó una matriz binaria de presencia (1) y ausencia (0). La similitud genética entre los materiales evaluados se calculó con el coeficiente de Nei y Li [18]. El análisis de agrupamiento se realizó por el método UPGMA y se generó un dendrograma empleando el paquete estadístico NTSYS (Numerical Taxonomy System for personal Computer, versión 2.02 PC). Los parámetros de diversidad genética que se estimaron con el programa TFPGA (Tools For Population Genetic Analysis, versión 1.3, 1997) fueron el porcentaje de loci polimórficos y la heterocigosidad insesgada. Se determinó el valor de "F" estadístico insesgado con un intervalo de confianza de 95%. El Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) se hizo con programa GenAlEx 6.41.

RESULTADOS

El análisis mediante el coeficiente de Nei-Li a un nivel de similitud de 0,55 diferenció a los materiales en dos grandes grupos (Figura 1). En el Grupo I a una similitud de 0,75 se encuentran variedades importantes de manzana como Anna, de piel roja, textura mediana con una producción precoz y prolífica. La manzana Dorsett Golden, de piel amarilla con tonos rojizos y buen contenido de pruina. Aunque se establece principalmente como polinizante de la manzana Anna, sus frutos se comercializan fácilmente, los que tienen un sabor agridulce [19]. La Fuji, originaria del Japón, es una manzana dulce, de textura firme y muy sabrosa. El MM 106, originario de la estación de East Malling de Inglaterra, es el patrón que se viene utilizando en los últimos años. Tiene como características especiales raíces poco profundas pero bien desarrolladas, transmite un vigor medio a las plantas, resistente al pulgón lanígero Eriosoma lanigerum, pero es muy susceptible al hongo Phytophthora cactorum, como consecuencia de los enchrcamientos [19].

Al 0,70 de similitud se encontró a las variedades de manzana Mutsu, Salamina y Grany Smith y un poco más alejada a Primicia. Salamina se caracteriza por tener una piel rosada a roja, tamaño mediano y de producción regular . La Mutsu de textura firme, de madurez muy tardía, se puede almacenar hasta cuatro meses, requiere de 600 horas frío. La Granny Smith, Golden Delicious y Red Delicious, hacen parte de las manzanas que se han venido importando al país. La Granny Smith es originaria de Nueva Zelanda; con un fruto de tecxtura firme, agría con una madurez tardía [19]. A un nivel de similitud de 0,60 se encuentran los materiales albaricoque (Prunus armenica), su importancia económica reside en sus frutos con más de 100 especies cultivadas, dentro de las variedades más importantes se encuentra Bulida, de origen español, adaptado a diferentes tipos de suelos y alto contenido de jugo; la otra variedad es Canina, con frutos de alta calidad y buena comercialización [20] siendo la de menor similitud con el resto de los materiales evaluados.

El almendro es una especie rústica, de climas templados, floración temprana con alta afinidad con el albaricoque [21] como se puede ver en el dendrograma. En el grupo a un nivel de similitud de 0,65 encontramos los materiales de pera conocidos como Mantequilla y Triunfo de Viena. Esta última hace parte de las comerciales existentes en el país, que son de origen asiático y no tienen ningún tipo de clasificación [19]. Se caracteriza por ser de piel color café claro con fondo amarillo, sin pruina, de tamaño grande con un peso promedio de 359 g. Dentro de este grupo a 0,50, encontramos al patrón MM111, considerado un portainjerto moderadamente vigoroso, presenta resistencia a pulgón lanígero y a pudrición de cuello, y se adapta bien a suelos pesados, con problemas de drenaje [22]. El membrillo y la variedad Kiffer presentaron una similariad de 0,60. El membrillo (Cydonia oblonga Pers.) se utilizan básicamente como portainjerto de perales, induciendo menor vigor, mayor precosidad y prolificidad, no es compatible con todas las variedades de peral, se utiliza mucho en las variedades BA 29, Quince A y Adams [23]. La pera Kieffer es un híbrido entre Pyrus communis y P. pyrifolia. Es extremadamente rústico y produce frutos verde-amarillentos y gordos, prospera en las zonas de rusticas, se autopoliniza, crece entre 3 a 4,5 m [24]. En general se puede observar las diferentes relaciones genéticas que existen dentro de los materiales de la misma especie como de especies diferentes. El índice de Nei-Li y el agrupamiento UPGMA, dio como resultado en total cuatro grupos asociados de acuerdo a la especie a la cual pertenecen y dentro de ellos por las características del fruto. El índice de similitud es alto y muestra el grado de homogeneidad que existe entre los materiales de pera y manzana, lo cual puede ser corroborado por los valores de distancias genéticas (0,70 a 0,88).

Los ocho cebadores RAMs utilizados para la caracterización molecular de los materiales de manzana, pera, albaricoque y almendro, generaron una matriz de 1280 entradas y se obtuvieron 128 bandas, de las cuales se seleccionaron 124 las cuales reflejaron el 97% de polimorfismo. El número de bandas por cebador varió de 11 para el AG y 25 para el CGA, con pesos moleculares entre 250 y 1300 Kb. El número de bandas se considera adecuado para estimar parámetros genéticos al compararlos con los resultados obtenidos en otros trabajos de diversidad genética en donde se han utilizado estos marcadores mandarina (106 bandas [25], cacao (127 bandas, [26]), durazno (121 bandas,[17]) entre otros.

El porcentaje de loci polimórficos para los ocho cebadores estuvieron en un rango comprendido entre 75% (ACA) al 96% (CGA), con una heterocigosidad promedio esperada de 0,29 a 0,40 para los cebadores TG y CGA, respectivamente. El cebador CCA fue el que mayor aporte hizo a la variación encontrada, Fst de 0,46 (Cuadro 1), lo cual signfica que puede ser útil para la diferenciación de materiales de género Pyrus y Malus.

Para la población total el porcentaje de loci polimórficos y la heterocigosidad promedio esperada (He) fueron de 88% y 0,34 respectivamente. El coeficiente de diferenciación genética obtenido (Fst) obtenido al evaluar los materiales de pera, manzana, albaricoque y almendro, con los ocho microsatélites RAMs fue de 0,37 con una desviación estándar de 0,04 (Cuadro 1). Según Wright (1978) [27] valores mayores de 0,25 muestran una gran diferenciación genética, la cual está asociada con el nivel de estructuración de la población que tiende a estabilizarse.

En trabajos de caracterización de la diversidad genética en Pyrus spp, con microsatélites codominantes, se han obtenido altos porcentajes de loci polimórficos y altos valores de heterocigosidad asociados posiblemente a la naturaleza misma de los materiales, ya que se incluyen tanto materiales cultivados como silvestres, procedentes de distintas regiones productoras además los procesos de autoincompatibilidad [28].

Evaluaciones de la diversidad genética en manzana y especies relacionadas usando marcadores Microsatélites codominantes, han mostrado altos valores de loci polimórficos y heterocigosidad [29, 30]. Sin embargo ya hace ya algunos años atrás, se mencionaba que la base genética de la manzana había sido erosionada dramáticamente, en algún tiempo cerca de 7000 cultivares fueron descritos en la literatura (1804-1904); ahora la mayoría de las producciones en el mundo están basadas solamente en dos cultivares: Delicious y Golden Delicious. Además, de la expansión creciente de sus plántulas: Gala, Mutsu, Jonagold de Golden Delicious y Empire y Fuji de Delicious [31]. Esto significó una reducción en el número de programas de mejoramiento. Con el fin de incrementar la oferta de materiales de siembra en manzana, se han generado híbridos interespecíficos fértiles entre las especies de Malus y hay un amplio precedente que muestra las contribuciones significativas que han hecho al mejoramiento genético de los cultivares comerciales de manzana [32].

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Estudios de diversidad genética y mapeo, muestran la sintenia que existe entre los materiales de manzana y de pera. Por lo anterior para el género Pyrus existen varios estudios de identificación de genotipos, establecimiento de relaciones genéticas entre especies y variedades de peral, utilizando microsatélites desarrollados para manzana [12]; la buena transferibilidad de marcadores microsatélites de la manzana a la pera permitió la realización del mapa genético de esta última especie [33] y reafirmar la homología que existen entre los dos genomas, como se puede corroborar en este estudio por los índices de similitud, valores de heterocigosidad y distancias genéticas, incluso se puede observar las relaciones entre los género Malus, Pyrus y Prunus la cual ya sido también ampliamente documentada [34]. El mapeo comparativo, la identificación de locus como el de la autoincompatibilidad y el posicionamiento de genes asociados a enfermedades de importancia económica en los géneros Pyrus y Malus, son algunas de las ventajas obtenidas por la sintenia entre los genomas [35]. Con el fin de incrementar la oferta de materiales de siembra en estas especies, se han generado híbridos interespecíficos fértiles y hay un amplio precedente que muestra las contribuciones significativas que han hecho al mejoramiento genético de cultivares comerciales de manzana y de peras [36].

Colombia es uno de los países con la mayor oferta de suelo y clima del mundo para el cultivo de frutas tropicales durante todo el año desde el nivel del mar hasta los 2800 metros de altitud. Esto constituye gran parte de las ventajas comparativas y competitivas que tiene el país para desarrollar la fruticultura, especialmente en el departamento de Boyacá. Por lo anterior cultivos como la manzana y la pera puede ser una alternativa económicamente rentable para la región, siempre y cuando se cuente con la disponibilidad de materiales adaptados con buenas características organolépticas, que respondan a las exigencias del mercado.

CONCLUSIONES

Los marcadores moleculares RAMs permitieron la identificación de las relaciones genéticas intra e interespecíficas en los géneros Pyrus y Malus corroborando la sintenia reportada en estos genomas la cual se observó en los altos índices de similitud y de heterocigosidad y distancias genéticas pequeñas, estos hallazgos pueden ser utilizados en el mapeo comparativo, la identificación de genes de interés y en la formación de híbridos lo cual contribuye significativamente a los programas mejoramiento genético de estas especies.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos por la colaboración prestada a los laboratorios de investigación en Biología Molecular, Bioplasma y Gebimol, a la Granja Experimental Tunguavita, al Grupo de Investigación Competitividad Innovación y Desarrollo Empresarial (CIDE), y a la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia.

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