Artículo original
Evaluación comparativa de dos metodologías de diagnóstico de mastitis en un hato lechero del Departamento de Antioquia*
Comparative evaluations of two diagnose methods for mastitis in a dairy herd from the Antioquia province
Avaliação comparativa de duas metodologias de diagnóstico de mastites num farnel leiteiro do Departamento de Antioquia
* Artículo producto de la investigación del mismo nombre fue realizada en el año 2008 y financiada por la Cooperativa Lechera COLANTA ltda.
** Zootecnista, MsC Biotecnología Animal, Estudiante Doctorado en Ciencias Animales, Profesor Auxiliar Facultad de ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Grupo BIOGEM. Correspondencia: e-mail: jjecheve@unal.edu.co. ]]>
Artículo recibido: 01-07-2009, artículo aprobado: 05-04-2010
Resumen
Introducción. La mastitis es la enfermedad que mayor impacto tiene sobre la ganadería de leche en el mundo entero. Estrategias de todo tipo se han implementado para lograr disminuir su impacto sanitario y económico. La alta producción de leche, las vacas con muchos partos y la falta de higiene al momento del ordeño se constituyen en algunas de las principales causas para la presentación de esta enfermedad. En su forma subclínica, la mastitis causa únicamente pérdidas en producción y calidad de la leche, pero el bienestar del animal no se ve afectado. cuando la enfermedad empeora, se afecta gravemente la salud del animal y puede causar pérdidas de cuartos o inclusive la necesidad de descarte por falta de producción o perdida completa de la funcionalidad de la glándula mamaria. El recuento de células somáticas ha sido utilizado como un método para determinar el grado de sanidad de la glándula mamaria. La medición del RCS es una técnica sencilla, pero requiere de equipos especializados que normalmente no están a disposición de los productores. Por esto el CMT o California Mastitis Test se ha aceptado como una técnica de campo válida para, a partir de su resultado, tomar correctivos que disminuyan la presencia de la enfermedad en los hatos. Objetivo. Comparar la eficiencia de dos métodos diagnósticos de mastitis subclínica en la determinación del grado de infección de la glándula mamaria. Materiales y métodos. El análisis se llevó a cabo mediante la estimación de la correlación de Spearman de los resultados cualitativos de cada uno de los métodos con el análisis cuantitativo del RCS realizado en el laboratorio a 104 muestras de leche, correspondientes a los 4 cuartos de 26 vacas con niveles de células somáticas desconocidos. Resultados. La correlación para ambos tratamientos fue significativa, siendo 42.9% para el tratamiento 1 y 49% para el tratamiento 2. Según estos resultados, se puede concluir que ninguno de los dos tratamientos logra explicar con exactitud el nivel sanitario de la glándula mamaria, pero además no existe diferencia en emplear cualquiera de los dos. Conclusión. El análisis más preciso sigue siendo el conteo de células somáticas directo.
Palabras clave: Diagnóstico de mastitis, RCS, pérdidas económicas, CMT.
Abstract
Introduction. Mastitis is the disease that affects the most dairy herds worldwide, bringing the worst impact. All kinds of strategies have been implemented in order to reduce its sanitary and economic consequences. The high volume of milk production, the cows with many lactations and the lack of hygiene at the time of the milking, are some of the main causes for this disease. In its subclinical form mastitis causes losses in milk production and quality, but the animal's welfare is not affected. When the disease gets worse, it seriously affects the health of the animal and can cause a loss of quarters or even the necessity of a discard due to a lack of production or to a total malfunction of the mammary gland. The count of somatic cells (CCS) has been used as a method to determine the mammary gland's health degree. The measurement of CCS is a simple technique, but it requires some specialized equipment that is not usually available for the dairy cattle producers, so the CMT, or California Mastitis Test, has been accepted as a field technique useful to take, departing from its results, corrective measurements to reduce the presence of this disease in dairy cattle. Objective. To compare the efficiency of two diagnose methods in subclinical mastitis, in order to determine the mammary gland's infection degree. Materials and methods. The analysis was carried out by estimating the Spearman's correlation of the qualitative results in each method with the quantitative analysis of the CCS made in the laboratory, to 104 milk samples corresponding to the 4 quarters of 26 cows with unknown somatic cells levels. Results. The correlation for both treatments was significant, 42,9% for treatment 1 and 49% for treatment 2. According to these results, it is possible to conclude that neither treatment can explain, exactly, the sanitary level of the mammary gland, but, besides, there is no difference in using one or the other. Conclusion. CCS is the most important analysis.
]]> Key words: Mastitis diagnose, CCS, economic loss, CMT.Resumo
Introdução. A mastites é a doença que maior impacto tem sobre a pecuária de leite no mundo inteiro. Estratégias de todo tipo se implementaram para conseguir diminuir seu impacto sanitário e econômico. A alta produção de leite, as vacas com muitos partos e a falta de higiene ao momento da ordenha se constituem em algumas das principais causas para a apresentação desta doença. Em sua forma sub-clínica, a mastites causa unicamente perdas em produção e qualidade do leite, mas o bem-estar do animal não se vê afetado. Quando a doença piora, afeta-se gravemente a saúde do animal e pode causar perdas de quartos ou inclusive a necessidade de descarte por falta de produção ou perdida completa da funcionalidade da glândula mamária. A recontagem de células somáticas foi utilizado como um método para determinar o grau de previdência da glândula mamária. A medição do RCS é uma técnica singela, mas requer de equipes especializadas que normalmente não estão a disposição dos produtores. Por isto o CMT ou Califórnia Mastites Teste se aceitou como uma técnica de campo válida para, a partir de seu resultado, tomar corretivos que diminuam a presença da doença nos farnéis. Objetivo: Comparar a eficiência de dois métodos diagnósticos de mastites sub-clínica na determinação do grau de infecção da glândula mamária. Materiais e métodos. A análise se levou a cabo mediante a estimação da correlação de Sperman dos resultados qualitativos de cada um dos métodos com a análise quantitativa do RCS realizado no laboratório a 104 mostras de leite, correspondentes aos 4 quartos de 26 vacas com níveis de células somáticas desconhecidos. Resultados. A correlação para ambos os tratamentos foi significativa, sendo 42.9% para o tratamento 1 e 49% para o tratamento 2. Segundo estes resultados, pode-se concluir que nenhum dos dois tratamentos consegue explicar com exatidão o nível sanitário da glândula mamária, mas ademais não existe diferença em empregar qualquer dos dois. Conclusão. A análise mais precisa segue sendo a contagem de células somáticas direto.
Palavras importantes: Diagnóstico de mastites, RCS, perdas econômicas, CMT.
Introducción
La producción de leche en Colombia ha presentado un incremento de forma acelerada y sostenida, pasando de 728 millones de litros en el año 1.950 a 1.879 millones en 1.978 y, en los años siguientes, la producción tuvo un crecimiento excepcional con una tasa anual de 6,5% durante la década de los 80 y en los 90 de 3,8%, llegando a producir en el año 2001 5.877 millones de litros de leche fluida y, en el año 2005, 6.770 millones de litros1. Esta propensión conlleva a suponer que para el 2010, si la tasa de crecimiento tiene una tendencia similar y con la continuidad de los programas de mejoramiento genético por cruces y repoblamiento bovino, puede llegarse a una producción que supere los 7.000 millones de litros distribuidos en los distintos tipos de sistemas productivos ganaderos existentes en Colombia para la producción de leche. Esto ha contribuido para que Colombia esté dentro de los 21 primeros lugares en producción de leche a nivel mundial, por encima de la mayoría de los países de Latinoamérica, con una participación del 2,8%. Estados unidos es el mayor productor a nivel mundial, con una participación del 14,9%2.
Sin embargo, el rendimiento de leche por animal preocupa para la posición competitiva de Colombia (puesto 20 a nivel mundial año 2005) con un rendimiento de 1.003 Kilogramos/animal/ año, siendo superado por Perú, México, Bolivia, Uruguay y Ecuador, a pesar de que las razas de bovinos han sido mejoradas empleando técnicas tradicionales como la inseminación artificial (IA), que es la biotecnología animal más utilizada en el mundo y que permite una mejora fenotípica en cuanto a productividad y calidad de la leche con grupos genéticos de mayor valor económico o biológico y logrando que cada generación sea mejor que la anterior. Israel es el país de mayor producción por animal a nivel mundial, con una producción aproximada de 9600 Kg/animal/año (MADR, 1991-2005, MADR, 2006) y su avance se debe al desarrollo de técnicas moleculares y reproductivas que han llevado a la selección asistida por marcadores moleculares (MAS) y la posibilidad de poder efectuar transferencia de embriones, aumentando la ganancia genética por año debido a la multiplicación de individuos superiores en cuanto a características productivas y resistencia a enfermedades3.
Se debe tener en cuenta que el aspecto sanitario en ganado bovino es internacionalmente de gran importancia para la industria lechera y para el consumidor4, por lo cual el mejoramiento genético vía MAS encaminado hacia mejorar la salud animal, además de otros beneficios económicos que pueden ser esperados como reducir los costos de producción (por pérdidas en la producción y en la rata de reemplazo, etc), incrementa la seguridad alimentaria con la disminución del uso de drogas (incluyendo antibióticos) y reducción de la contaminación bacteriana5,6.
La mastitis bovina es definida como una inflamación de la glándula mamaria que puede ser causada principalmente por bacterias, aunque también puede ser producida por micoplasmas, levaduras y algas, e incluso en algunos casos puede ser traumática7. Se han identificado 137 organismos diferentes causantes de mastitis, dentro de los cuales la gran mayoría son de origen bacteriano, principalmente de las especies Escherichia coli, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae y Streptococcus agalactiae, que están presente en casi el 80% en todos los casos diagnósticos8,9,10.
]]> La mastitis puede ser de tipo clínico, cuando el cuarto infectado sufre una reacción inflamatoria visible, produciendo en la mayoría de las vacas dolor en la parte afectada y por lo general la leche se encuentra visiblemente alterada por la presencia de coágulos, descamaciones o suero descolorido y algunas veces sangre11. En casos más severos (mastitis aguda), la vaca muestra signos generalizados: fiebre, pulso acelerado, pérdida de apetito y una disminución abrupta de la producción de leche de las vacas tratadas con antibióticos, ya que esa leche debe ser descartada hasta que ya no hayan residuos del tratamiento. En algunos casos se produce la muerte del animal. Según estudios realizados, la tasa de mortalidad se ha estimado en un 0,6% en vacas lactantes (figura 1)12,13.
Para mastitis se han realizado muchos estudios, teniendo en cuenta que los signos y efectos de la mastitis varían de acuerdo con factores propios del hospedero y el patógeno invasor. Esto explica una susceptibilidad individual de la glándula mamaria a la inflamación, la proliferación de microorganismos y propensión a la infección. En consecuencia, se han realizado numerosas investigaciones dirigidas a establecer las relaciones entre la probabilidad de adquirir o desarrollar mastitis y la constitución genética de los individuos14.
En contraste, la mastitis subclínica es más difícil de diagnosticar y corregir. La vaca parece saludable, la ubre no muestra ningún signo de inflamación y la leche parece normal. A pesar de ello, los microorganismos y las células blancas de la leche (RCS) que combaten las infecciones se encuentran en concentraciones elevadas en la leche y algo relevante de este tipo de mastitis es que la producción de leche disminuye mucho más que la provocada por mastitis clínica, debido a que la mayoría de los casos son subclínicos (en promedio, por cada caso clínico, existen de 20 a 40 subclínicos). Además, la reducción en la producción de leche debido a mastitis subclínica tiende a persistir por un largo período de tiempo15
Indiferentemente de la forma de contagio, una vez que los agentes infecciosos atacan las células del interior de la ubre, el organismo del animal libera una cantidad de linfocitos mayor a la usual para neutralizar la invasión y éstos son causantes de la inflamación de la ubre como respuesta inflamatoria defensiva a los agentes infecciosos, pero también puede darse esto por una agregación traumática16,17. Estas células que se difunden desde la sangre a los tejidos y conductos de la glándula mamaria, son leucocitos principalmente macrófagos y neutrófilos, los cuales son eliminados durante el ordeño y normalmente son cuantificados como requisito en el control de calidad sanitaria de la leche. El procedimiento se denomina recuento de células somáticas de la leche (RCS) y dentro de este RCS están también incluidas células epiteliales, producto de la descamación del tejido mamario, y representan un 2%18.
El RCS es un indicador de la presencia de mastitis en la glándula mamaria y es el parámetro más aceptado para valorar la calidad sanitaria de la leche en hatos, cooperativas lecheras, regiones y países19,20. Un alto valor de RCS en la leche cruda recién sacada del ordeño es un indicador no sólo de que la vaca tiene mastitis, si no que a la vez brinda información indirecta sobre las pérdidas en producción, las modificaciones bioquímicas que experimenta la leche y hasta de cuándo efectuar un descarte voluntario de los animales21,22.
Los RCS en leche de vacas menores a 200.000 cél/ml son considerados fisiológicamente normales, mientras que los mayores a 300.000 cél/ml generalmente indican la presencia de inflamación. Las normas establecidas para RCS en la leche por tanque en la comunidad europea varían entre 400.000 hasta 750.000 cél/ ml máximo establecido. Los límites de leche de rechazo en algunos países son: 400.000 cél/ml en Dinamarca y Holanda; 500.000 cél/ ml en Francia, Irlanda y Polonia; 750.000 cél/ ml en Australia, Canadá, Finlandia y Noruega; 1.000.000 en Estados Unidos y Japón 23,24,25. En Colombia, el RCS máximo aceptado es de 800.000 cel/ml y se bonifica cuando el RCS en tanque es menor a 200.000 cel/ ml26.
En general la presencia de mastitis clínica y subclínica (altos RCS), afecta la calidad de la leche debido al incremento de enzimas proteolíticas y lipolíticas de origen sanguíneo y bacteriano20. Principalmente se ve afectado el contenido proteico de la leche, incrementándose las proteínas séricas y disminuyendo la caseína27,28.
Otras enzimas que alteran las características de la leche son la catalasa, fosfatasa alcalina y las lipasas. Estas enzimas se encuentran en mayor concentración en leches mastíticas y tienen la capacidad de descomponer la grasa, liberando ácidos grasos que producen en algunos casos sabores desagradables en productos de alto contenido graso, como la mantequilla y los quesos29,30.
]]> En leches mastíticas también se ven afectados otros parámetros, como el incremento de la conductividad de la leche, causado por el aumento de la concentración de sodio y cloro, aunque la concentración de calcio y potasio, que son los minerales de más alta concentración en la leche, son disminuidos. Este desbalance de minerales produce sabores salados en lal leche31.Las células somáticas como indicador de la mastitis guardan una estrecha relación con las pérdidas en los volúmenes de producción. Recuentos de 500.000 células/ml pueden involucrar que se esté dando una disminución de hasta un 18% en la producción del animal, disminución que puede llegar hasta un 30% para recuentos de 1.500.000 células/ml32. Se ha demostrado que hay una relación lineal inversa entre el RCS por encima de 200 000 células/ml y la producción de leche con una disminución del 2,5% de la producción por cada 90.000 - 100.000 células/ ml incrementadas en el RCS33.
En los Estados Unidos el costo a los productores por el tratamiento de casos de mastitis es aproximadamente el 11% del valor total de la producción de leche. La mayor parte de este costo es atribuido a la disminución en la producción de leche, (59%), las pérdidas restantes son por descarte de leche contaminada, (14%), vacas de reposición, (18%), y por medicamentos y servicios veterinarios, (7%). Todos estos datos han sido estimados por vaca/año34.
La leche mastítica contiene algunos agentes causales que son patógenos para humanos. También puede llevar residuos de antibióticos o drogas químicas utilizadas en el tratamiento de la ubre35. Por lo tanto, es indiscutible que la buena calidad de la leche es muy importante dentro de la salud pública. El uso extensivo de antibióticos en el tratamiento y control de mastitis tienen implicaciones en la salud humana, incrementando el riesgo de producir cepas bacterianas resistentes a antibióticos que pueden entrar en la cadena alimenticia36,37.
Pruebas más utilizadas para el diagnóstico de mastitis subclínica
Conductividad eléctrica de la leche
Esta prueba se basa en el aumento de conductividad eléctrica de la leche debido a su mayor contenido electrolítico, especialmente iones de sodio y de cloro, y se ha desarrollado como un método para monitorear el estado de la mastitis en la vaca. Permite la identificación de la mastitis clínica con precisión, pero en el caso de las mastitis subclínicas la precisión es solo del 50% en comparación con los métodos estándar38,39.40
Recuento de células somáticas por microscopía directa
El método tradicional de recuento de células somáticas es un recuento directo realizado por microscopía óptica, utilizando un aumento de 500x. Es un ensayo cuantitativo de laboratorio, por el cual se examinan bajo el microscopio un frotis teñido de leche problema y se cuenta el número de células somáticas. El recuento microscópico directo de células somáticas de la leche, denominado también método óptico, si bien es de referencia actualmente es de poca utilidad cuando se trata de un gran número de muestras, por que es una metodología muy demorada. Sin embargo, aun mantiene su utilidad para los trabajos de investigación41,42.
]]> Método fluoro-opto-electrónico FossomaticEl método es el más utilizado en la industria lechera para medir el RCS y utiliza un equipo denominado fossomatic, el cual está basado en la tinción fluorométrica del material nuclear y posee alta correlación con la microscopía óptica, por lo que proporciona una medida segura en el recuento de células somáticas43,44.
Durante el proceso de medición se tiñen las células somáticas con un colorante fluorescente para obtener una reacción sólo con el DNA de las células, generalmente bromuro de etidio. Es por eso que las partículas sucias y los glóbulos de los lípidos no se suman al número de las células somáticas. La muestra pasa por una membrana de poros finos frente a una luz especial y un detector registra cada célula somática. Entre cada muestra el aparato limpia su sistema de flujo para evitar el efecto del arrastre de una muestra a otra y, por ende, mide con alto grado de precisión y exactitud el RCS. Además da la posibilidad de registrar los datos automáticamente45,46.
Prueba de California Mastitis Test (CMT)
La Prueba de California para Mastitis (CMT) ha sido empleada durante muchas décadas, y sigue siendo la prueba más utilizada a nivel de campo para el diagnóstico de mastitis clínica y subclínica en el ganado bovino lechero. Es una prueba sencilla que es útil para detectar la mastitis subclínica por valoración aproximada del recuento de células somáticas de la leche. No proporciona un resultado numérico, sino más bien un resultado categórico47,48.
La prueba consiste en el agregado de un detergente a la leche, el alquilauril sulfonato de sodio, causando la liberación del ADN de los leucocitos presentes en la ubre, y éste se convierte, en combinación con agentes proteicos de la leche, en un complejo gelatinoso. Los resultados pueden ser interpretados en cinco clases: desde el resultado negativo en el que la leche y el reactivo siguen siendo acuosos, hasta el recuento de células más elevado, en el que la mezcla de la leche y el reactivo casi se solidifican49,50.
El reactivo de California para la prueba de mastitis posee entre sus componentes un tensoactivo que disminuye la tensión superficial de los leucocitos presentes en la leche de la vaca con mastitis, por lo que al disminuir la tensión superficial se produce el estallido de los leucocitos y su contenido, al ponerse en contacto con el producto, forma el complejo gelatinoso en la raqueta51,52.
A mayor presencia de células se libera una mayor concentración de ADN. Por lo tanto, mayor será el grado de gelificación, es decir, permite determinar la respuesta inflamatoria con base en la viscosidad del gel que se forma al mezclar el reactivo CMT con la misma cantidad de leche en una paleta con cuatro pozos independientes, permitiendo evaluar cada cuarto por separado53,54.
La capacidad del CMT para identificar cuartos con mastitis ha sido extensamente evaluada, obteniendo resultados variables. Inicialmente el CMT fue evaluado como una herramienta para seleccionar vacas que requieren de terapia durante el periodo de secado y se identificó correctamente del 75-80%55. En recientes estudios el CMT fue comparado con el RCS en vacas recientemente paridas, y se determinó una sensibilidad del 66,7% para detectar patógenos mayores y 49,5 para patógenos menores, siendo una prueba apropiada para programas de monitoreo de mastitis en vacas infectadas con patógenos mayores56,57,58.
La sensibilidad más alta determinada para el CMT fue del 84% para estreptococos ambientales y tiene una especificidad del 93% en el diagnóstico de la enfermedad Bedolla et al59
]]> El CMT provee una predicción confiable del RCS y permite confiable advertencia en sistemas de detección temprana de nuevos casos de mastitis subclínica y medidas correctivas que pueden ser iniciadas antes de que la enfermedad llegue a ser crónica. El desarrollo regular del CMT es, por consiguiente, un método económico y efectivo para reducir el riesgo de mastitis subclínica en los hatos lecheros (tabla 1).
Con la información anterior el objetivo principal de esta investigación es comparar dos metodologías de diagnóstico de mastitis para determinar su factibilidad de utilización en campo.
Materiales y métodos
Localización
El trabajo fue llevado a cabo en un hato ubicado en el Municipio de Belmira, Antioquia, en el cual se ordeñan cerca de 300 vacas de diferentes razas lecheras. El objetivo de la finca es la producción de leche.
]]> Toma de muestrasLa investigación se realizó con 104 muestras, correspondientes a 26 vacas. A cada vaca se le tomaron 3 muestras de leche de cada uno de los cuartos y las muestras fueron sometidas a análisis de CMT con 2 reactivos de casas comerciales diferentes y a recuento de células somáticas por la metodología de densitometría con el Milko foss FT120. La lectura de las muestras fue realizada por la misma persona para evitar subjetividad en el análisis.
Análisis estadístico
Para el análisis de la información los datos fueron transformados logarítmicamente en el software Sas Versión 9.0. El análisis de las muestras se llevó a cabo mediante la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney, la cual es empleada para contrastar si las diferencias observadas en las suma de los rangos son debidas al azar. Se usa además cuando los datos no tienen una distribución normal. Esta prueba es la contraparte no paramétrica de la prueba de t-Student. El procedimiento Npar1way de SAS fue empleado para tal efecto.
Se estimó el coeficiente de correlación de Spearman entre el análisis de CMT y el RCS de cada una de las muestras.
Resultados
El estadístico de Wilcoxon-Mann-Whitney indicó que no existe diferencia significativa entre la evaluación realizada mediante los dos reactivos. Esto nos indica que cualquiera de los dos puede ser empleado en el análisis de CMT con resultados similares.
La correlación de Spearman entre el análisis subjetivo de CMT realizado mediante observación y el análisis cuantitativo de recuento de células somáticas fue de 42 %, lo que indica que estos 2 análisis están asociados en ese porcentaje. Esto es un indicativo de correlación media, e indica que estas dos variables no están muy asociadas.
La prueba de CMT es un indicativo subjetivo de la salud de la ubre. Sin embargo, el bajo costo de utilización hace que se convierta en una herramienta de uso común y viable en los hatos productores de leche.
Los reactivos utilizados en esta investigación tuvieron un comportamiento similar en las pruebas de campo CMT, lo que indica que ambos pueden ser utilizados con confianza por parte de los productores de leche en sus programas de manejo sanitario.
La baja correlación entre el CMT y el recuento de células somáticas indica que, según esta investigación, la prueba de CMT no constituye una buena medida para inferir el recuento de células somáticas.
La prueba de CMT, aunque no es un buen indicador del recuento de células somáticas, sí es un buen indicador de la salud de la ubre y, por lo tanto, debe ser usado como ayuda en el control de la mastitis en campo.
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