Estudio de la viabilidad del Lactobacillus casei en jugo de naranja (Citrus sinensis) adicionado con vitamina C, Calcio y oligofructosa1
Feasibility study of Lactobacillus casei in orange juice (Citrus sinensis) supplemented with vitamin C, calcium and oligofructose
M. C. Londoño*, J. C. Lucas** y V. D. Quintero**
1 Producto derivado del proyecto de investigación "Estudio de la viabilidad de Lactobacilus casei en jugo de naranja, fortificados con calcio, vitamina C y adicionado con oligofructosa.". Presentado por el Grupo de Investigación Agroindustria de frutas tropicales, avalado por la Facultad de ciencias básicas y facultad de ciencias agroindustriales de la Universidad del Quindío.
* M. C. Londoño, es docente del Programa de Química, Facultad de ciencias básicas de la universidad del Quindío, Armenia, Quindío (Colombia); email: mariace0116@gmail.com.
** J. C. Lucas y V. D. Quintero, son docentes del Programa de Ingeniería de Alimentos, Facultad de Ciencias Agroindustriales de la universidad del Quindío, Armenia, Quindío (Colombia); email: jclucas@uniquindio.edu.co y victordumar@uniquindio.edu.co
Recibido Marzo 27 de 2015 - Aceptado Septiembre 23 de 2015
Resumen
]]> Se utilizó la Naranja Valencia para producir un jugo enriquecido con bacterias probióticas (Lactobacilos casei). Se evaluó la concentración óptima de estabilizante realizando un berrido con tres tipos de gomas (Xantan, CMC, y pectina), evaluado mediante un arreglo factorial 33. Posteriormente se adicionó el microorganismo a tres concentraciones diferentes (0,4 -0,5 y 0,6 Mc - Farland) y los compuestos fisiológicamente activos (Calcio y vitamina C) en un 20% del valor diario recomendado según la resolución 333 de 2011 del ministerio de protección social. Los resultados mostraron que se debe adicionar Pectina 0.02%, CMC 0.015% y Xantan 0.014%. El análisis de la concentración de microorganismos durante el tiempo de almacenamiento muestra que la concentración inicial aumentó hasta llegar a 7.21* 109 UFC, y el pH permaneció constante desde el día 15 hasta el 20 en 3.8.Palabras clave: naranja, jugo, bacterias probióticas.
Abstract
Valencia Orange was used to produce a juice enriched with probiotic bacteria (Lactobacillus casei). The optimal concentration of stabilizer was evaluated by performing a screening with three types of gums (xanthan, CMC, and pectin), evaluated using a factorial arrangement 33. Subsequently the microorganism at three different concentrations (0.4 -0.5 and 0.6 was added 6 Mc - Farland) and physiologically active compounds (calcium and vitamin C) 20% of the recommended daily value according to the resolution 333 of 2011 the ministry of social protection. The results showed that 0.02% pectin, CMC and Xanthan 0.015% 0.014% should be added. The analysis of the concentration of microorganisms during storage time shows that the initial concentration increased up to 7.21 * 109 CFU, and the pH remained constant from day 15 to 20 in 3.8.
Key words: juice, orange, probiotic bacterias.
I. INTRODUCCIÓN
Los alimentos funcionales se definen como aquellos que además de suministrar nutrientes, ofrecen beneficios potenciales para la salud que puede mejorar el bienestar de los individuos. Ellos afectan una o más funciones diana del organismo, más allá de su efectos nutricionales, ya sea para mejorar la salud y/o reducir el riesgo de la enfermedad [1], y deben, por varias definiciones, ser consumidos como parte de un patrón normal de alimentos y no como una píldora, una cápsula, o alguna forma de suplemento dietético. [2]
Los probióticos proporcionan una serie de beneficios para la salud, principalmente a través del mantenimiento de la microbiota intestinal normal, la protección contra patógenos gastrointestinales, mejora del sistema inmune, reducción del nivel de colesterol sérico y la presión sanguínea, la actividad anti-cancerígena, la mejora de nutrientes y la mejora el valor nutritivo de los alimentos. Las aplicaciones terapéuticas de los probióticos incluyen la prevención de la diarrea infantil, enfermedades urogenitales, osteoporosis, alergia a los alimentos y enfermedades atópicas; la reducción de la diarrea provocada por anticuerpos; alivio de la constipación y la hipercolesterolemia; control de las enfermedades inflamatorias del intestino; y la protección contra el cáncer de colon y la vejiga. [3], [4] y [5]
El éxito significativo se ha logrado durante las últimas décadas en el desarrollo de productos que contienen bacterias probióticas, tales como leches fermentadas, helados, varios tipos de queso, comida para bebés, leche en polvo, postres lácteos congelados, bebidas a base de suero, crema agria, suero de mantequilla, la leche líquida normal y jugos de fruta con sabores semejantes a las materias primas originales. [6] La obtención de jugos de frutas con probióticos cobija a todos aquellos consumidores que son intolerantes de alguna forma a los productos lácteos, pudiéndose aprovechar de alguna manera este tipo de alimentos básicos como alimentos funcionales [7]. Los jugos de frutas se han considerado adecuados para la adición de cultivos probióticos porque ya contienen nutrientes beneficiosos, los cuales aportan perfiles de sabor agradables para consumidores de todas las edades [8], [9] y [1], además de hacer parte de la dieta de una gran proporción de la población colombiana, permitiendo que este tipo de alimento funcional sea accesible en cualquier nicho de mercado.
La producción de jugos y pulpas naturales funcionales es limitada debido al bajo conocimiento que se tiene del comportamiento de las matrices de los constituyentes de estas bebidas en el momento de procesarlas y conservarlas. Además la mayoría de los productos del mercado proporcionan al consumidor los componentes nutricionales básicos de cada fruto sin aportar otros compuestos que sean bioactivos en el ser humano [6].
]]> Dentro de la normatividad que rige este tipo de alimentos existen diversos tipos: la Norma General del Codex para Zumos (Jugos) y Néctares de Frutas (Codex Stan 247-2005) y la Resolución del Ministerio de Salud No 7992 del 21 de Julio de 1991, por la cual se reglamentan los diversos parámetros relacionados con la elaboración, conservación y comercialización de jugos, concentrados, néctares, pulpas azucaradas y refrescos de frutas. Otra definición sobre los productos líquidos de las frutas la propone el Instituto Colombiano de Normas Técnicas en su Norma 695.Para la elaboración del jugo de naranja, éste debe tener una acidez (expresada como ácido cítrico anhidro) de 0.5% m/m Mínimo, 9°Brix (a 20°C), un porcentaje de agua de 70 a 95%, debe estar libre de materias extrañas, admitiéndose una separación en fases y la presencia mínima de trozos, partículas oscuras propias de la fruta utilizada, libre de sabores extraños. El color y olor semejante al de la fruta de la cual se ha extraído. El producto puede presentar un ligero cambio de color, pero no un color extraño debido a la alteración o elaboración defectuosa según el Instituto Colombiano de Normas Técnicas en su Norma 695.
El objetivo principal de este trabajo fue el de estabilizar el jugo de naranja obtenido, adicionarle el microorganismo (L. casei) los compuestos fisiológicamente activos (Calcio, Vitamina C y oligofructosa) y estudiarlo fisicoquímica y sensorialmente.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
A. Obtención del Jugo
Las naranjas fueron adquiridas en la central de acopio de alimentos de la ciudad de Armenia, Quindío, Colombia, en el mismo estado de maduración. Posteriormente fueron llevadas al Laboratorio de Diseño de Nuevos Productos de la Universidad del Quindío, localizado en la misma ciudad. Las frutas se lavaron con hipoclorito de sodio y se escaldaron a 75ºC por 1 minuto. El jugo de naranja se extrajo empleando un exprimidor de marca Oster 3190 Rotación Bidireccional, tomando como referencia la NTC 5468, posteriormente se homogeneizó en ultraturrax a 2500 rpm durante 90 segundos a temperatura ambiente y finalmente se filtró sobre una malla con tamaño de poro de 100 µm. [10]
B. Caracterización inicial del jugo
El jugo de naranja obtenido se caracterizó fisicoquímicamente, determinando el color mediante un espectofotómetro Minolta. A partir de los espectros de reflexión de las muestras se determinaron las coordenadas del CIE-L*a*b*. A partir de los espectros de reflactancia se cuantificó el parámetro ΔE para determinar el cambio de color global en los tratamientos [11], los sólidos solubles se determinaron en un refractómetro de mesa marca THERMO, la acidez titulable expresada como porcentaje de ácido cítrico se determinó por titulación con NaOH 0,1 N hasta viraje del indicador fenolftaleína, el pH se midió con un potenciómetro de mesa marca Benchtop IQ-240 [12], la viscosidad con un viscosímetro rotacional marca SELECTA de referencia ST 2010 a temperatura ambiente [13].
C. Estabilización del jugo
El jugo obtenido se estabilizó evaluando tres gomas (Xantan, pectina y CMC) con tres concentraciones diferentes (0%, 0.025% y 0.05%) y relaciones de mezcla diferentes. Se realizó un diseño experimental en arreglo factorial 33 utilizando como factores las gomas Xantan, CMC y pectina (Figura 1) y la concentración, tomando como variables de respuesta la viscosidad, el tiempo de separación y la distancia de separación de fases. La evaluación de los datos se realizó mediante el modelo de superficies de respuesta [10].
]]>
D. Pasteurización y formulación
El jugo se pasteurizó durante 15 segundos a 85°C y luego se sometió a enfriamiento y posteriormente se introdujo en bolsas con cierre hermético para ser llevado al congelador [14].
El Calcio se adicionó en un 20% del valor diario recomendado para adultos que es de 1000 mg (NTC 5839 y resolución 333/2011 Minsalud) como Lactato de Calcio, ya que el ion lactato ha sido reportado como el mejor vehículo trasportador de Calcio en matrices acuosas, como lo son los jugos de frutas [15], [16], y [17]. La vitamina C se adicionó como ácido ascórbico anhidro en un 20% del valor diario recomendado que para el caso es de 90 mg. (NTC 5839 y resolución 333/2011 Minsalud)
E. Incorporación del microorganismo y determinación de la concentración de unidades formadoras de colonia
La cepa de L. casei se reactivó por rehidratación en caldo MRS incubado a una temperatura de 37°C durante 48 horas en condiciones de microaerofilia en una campana de anaerobiosis. La cepa activada se incorporó en esferas de cerámica (CRIOBANK) según instrucciones del fabricante para garantizar su conservación.
La determinación de las unidades formadoras de colonia se realizó teniendo en cuenta la escala Mc- Farland para ser comparado por turbidimetría con los tubos que poseen el caldo con el microorganismo y se determinó la concentración de unidades formadoras de colonia inoculadas en el jugo [6].
Se toma la cepa de acuerdo con el tubo Mc- Farland después de haber sometido a centrifugación a 1000 rpm el microorganismo contenido en el caldo MRS y se inocula en el jugo de naranja.
F. Caracterización fisicoquímica del producto final
Los productos obtenidos se evaluaron durante 20 días para determinar la evolución de la viscosidad, pH y UFC/ mL [10].
]]> Todos los datos fueron analizados en software sthtgraphics XVI centurión.III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A. Caracterización inicial del jugo
En la evaluación del color se observa, en todos los parámetros una diferencia estadísticamente significativa (p < 0.05), esto debido a que el jugo comercial ha sido sometido a tratamientos térmicos de pasteurización, además se la han adicionado colorantes artificiales que ayudan a estabilizar el color del producto final. Resultados similares han sido reportados anteriormente [18], al comparar cambios de color en jugos sin procesar con jugos tratados con pulsos eléctricos de alta intensidad y pasteurizados térmicamente. En estudios anteriores [19] se determinó un cambio en el parámetro L por tratamientos a altas presiones obteniendo valores de 14.48 ± 0.58 y 14.73 ± 0.11 para jugos sin procesar. En un estudio realizado en el 2003 [20] también se reportaron valores de L de 40.22 a 41.22 paras jugo de naranja pasteurizado. En el 2007 [21] se reportaron valores de L 62.2; a 5.19 y b 56.9 para jugos de naranja tratados con ultrasonido.
La viscosidad, la acidez y los sólidos solubles concuerdan con los datos reportados por [22] medidos en jugos de naranja tratados a altas presiones, [13] para jugos sin procesar y [23] medidos en jugos de naranja concentrado reconstituido.
B. Estabilización del jugo
En la figura 1, se observa cómo varían los jugos #1 al #27, desde el día 0 hasta el día 12.
1) Evaluación de viscosidad
En la iteración realizada sobre la ecuación polinómica generada en la evaluación de la viscosidad con los 3 tipos de goma, se concluyó que para obtener una viscosidad cercana a la del jugo comercial se necesita adicionar 0.02% de pectina, 0.015% de carboximetilcelulosa (CMC) y 0.014% de goma xantan. El resultado de viscosidad simulado sería de 5.17 cP. Este resultado es similar al reportado por [20], [23], [24] y [25]. En una investigación anterior [20] se demostró en su trabajo que la combinación de gomas tiene mejor efecto en cuanto a la estabilización de bebidas, evaluaron la mezcla de goma xantan, carboximetilcelulosa y dextrina en jugo de naranja, obteniendo viscosidades de hasta 0.2 Pa*s.
]]> También [26] obtuvieron resultados similares al evaluar en su trabajo goma xantan al 0.2% sobre jugo de naranja, obteniendo viscosidades máximas de hasta 0.46 Pa*s2) Evaluación de color
En la evaluación de color se tuvo en cuenta el cambio de color global del jugo calculado mediante el ΔE, tomando como parámetros de referencia el color del jugo comercial. Por tanto, la iteración se realizó con el fin de obtener un cercano a cero.
Los resultados de la iteración mostraron que el mínimo ΔE (1.67) que se puede obtener con los porcentajes de las gomas permitidos por la norma son de 0.05% de pectina; 0.05% de carboximetilcelulosa y 0% de xantan. Otros autores han evaluado los cambios de color durante el procesamiento por estabilización con emulsificantes, tratamientos térmicos, por ultrasonido o a altas presiones de jugo de naranja obtenido por extracción directa del fruto [25], [27], [11], [28].
3) Evaluación de distancia de separación de fases
La adición de las gomas, como en este caso, la goma xantan, pectina y carboximetilcelulosa (CMC), permite la interacción fisicoquímica entre la fase continua, la cual se conforma de agua, azúcares y ácidos orgánicos con la fase dispersa, disminuyendo la distancia entre éstas y a su vez el aumento de la viscosidad, con lo cual ayuda a aumentar el tiempo de vida útil del producto y la aceptabilidad sensorial por parte del consumidor, ya que el jugo cambia la forma de fluir y por tanto el consumidor no lo va a asociar solamente con agua, sino con un jugo rico en sólidos y demás componentes propios de la naranja [29], [24], [27], y [20].
La iteración en el polinomio obtenido para lograr la mínima distancia de separación de fases teniendo en cuenta la reglamentación nacional en cuanto a la adición de estabilizantes a jugos de fruta, da como resultado la adición de 0.05% de cada una de las gomas utilizadas en este trabajo (Goma Xantan, Carboximetilcelulosa y Pectina).
]]> Estas 3 formulaciones seleccionadas mediante iteración en las 3 ecuaciones obtenidas fueron evaluadas posteriormente con la adición del microorganismo y durante 12 días.Las formulaciones se resumen en la tabla 2.
Análisis microbiológico inicial para el jugo de naranja estabilizado
El análisis de la carga microbiana del jugo reportó una baja cantidad de microorganismos mesófilos que en promedio es de 800 UFC/ml ± 18,475 y coliformes totales 3 NMP. Estos valores según el decreto 7992 de 1991 están dentro de los parámetros exigidos para un alimento de buena calidad, esto quiere decir que la técnica empleada en la pasteurización fue eficaz y cumplió con el objetivo previsto.
D. Formulación final.
Las 3 formulaciones iniciales se ajustaron con el fin de seguir los parámetros normativos, adicionar los compuestos fisiológicamente activos en un 20% del valor diario recomendado y mejorar las características sensoriales del jugo. En la siguiente tabla se presentan los ajustes a las formulaciones.
El citrato de sodio se adiciona como regulador de acidez con el fin de aumentar el pH hasta 4. Con esto se disminuye la acidez titulable del jugo desde 0.98% hasta 0.5% en ácido cítrico, el cual es el límite permitido por la norma (CODEX STAN 247-2005) y con esto se mantiene un ambiente adecuado para el crecimiento del L. casei, a su vez se mejora las características sensoriales del producto. Se seleccionó la sucralosa como edulcorante no calórico debido a que endulza 600 veces más que la sacarosa, sólo el 2% de la cantidad ingerida es absorbida al torrente sanguíneo y según reportes anteriores [30], [31], [32], [33] y [34] las características sensoriales de los jugos de frutas endulzados con sucralosa no cambian significativamente con respecto a aquellos que fueron endulzados con sacarosa.
]]> E. Adición y recuento del microorganismo probiótico (Lactobacilos casei)Las colonias aisladas en un medio MRS, fueron redondas, blancas, cremosas y pequeñas, este es el crecimiento característico para este lactobacilo en ese medio de acuerdo con [35]. En la figura 5 se observan las cajas con la siembra de cada formulación de los jugos.
F. Caracterización fisicoquímica inicial de las formulaciones
La caracterización de las formulaciones con todos los aditivos en el tiempo cero no mostró diferencias estadísticamente significativas entre ellas, evaluadas por el método de las mínimas diferencias significativas (LSD) al 95% de confiabilidad. Encontrando un valor promedio de pH para las 3 formulaciones de 4.0 ± 0.2, de viscosidad de 5.2 ± 0.3 cP, sólidos solubles 9.0 ± 0.3% y porcentaje de ácido cítrico de 0.494 ± 0.016%. Estos datos concuerdan con investigaciones anteriores realizadas por [36], [37] y [38].
En cuanto a los cambios de los parámetros fisicoquímicos con respecto al tiempo, se observa una disminución de pH para las 3 formulaciones debido a la producción inicial de ácido láctico por parte del microorganismo, pero al llegar al día 15 la producción de ácido se estabiliza y por ende el pH no sigue disminuyendo hasta el día 20, en el cual culminó el estudio.
Esta estabilización se da gracias al citrato de sodio agregado como regulador de acidez y al ion lactato adicionado como lactato de calcio, los cuales actúan como amortiguadores con el ácido cítrico propio de la fruta y el ácido láctico producido por la bacteria, impidiendo los cambios drásticos de pH del jugo y con esto ayudando a un aumento de la vida útil del producto. [39], [9], [8] y [30].
En cuanto a la viscosidad no se observan cambios estadísticamente significativos a un nivel de confiabilidad del 95% en todos los tiempos de evaluación de la formulación número 1, indicando esto que la relación Pectina 0.02 %, CMC 0.015 % y Xantan 0.014 % fue la mejor para conservar homogéneo el jugo durante el tiempo de evaluación. Otros autores han evaluado mezcla de gomas. [29] Anteriormente se evaluaron mezclas de gomas xantan, goma guar y almidón sobre jugos de naranja, piña y manzana y otros investigadores [20] evaluaron mezclas de goma xantan, goma guar, carboximetilcelulosa y dextrina sobre jugo de manzana, naranja, Coca-Cola, una bebida hidratante y leche entera. Se puede observar también una diferencia estadísticamente significativa al 95 % de confiabilidad en la viscosidad de la formulación 1 después del 5 día de evaluación con respecto a las formulaciones 2 y 3, también después del 5 día de evaluación. Esto corrobora que la mejor mezcla de goma para la estabilización del jugo de fruta es la de la formulación 1.
]]> En las unidades formadoras de colonia se observa un aumento estadísticamente significativo en los 10 primeros días de estudio para las 3 formulaciones. A partir del día 15 hasta el día 20 no se observa un cambio estadísticamente significativo a un nivel de confianza del 95 % evaluado por el método de las mínimas diferencias significativas y a su vez en el test de rango múltiple realizado se observó una homogeneidad del grupo en los días 15 y 20 del estudio, mientras que estos 2 grupos (días 15 y 20) no son homogéneos con respecto a los otros grupos de estudio (días 0, 5, y 10) indicando esto un crecimiento exponencial en los primeros días del microorganismo en jugo y posteriormente un período de estabilidad después del día 15, esto se corrobora también con la producción de ácido láctico, ya que al día 15 se disminuye la producción de éste estabilizando este parámetro en 3.8. Las UFC/mL en promedio para las 3 formulaciones fueron de 7.21 * 109, valor que concuerda con la resolución 333 del 2011 emitida por el Ministerio de Protección Social, la cual indica que para que un alimento pueda catalogarse como probiótico debe tener entre 106 y 109 UFC/mL.IV. CONCLUSIONES
Para estabilizar el jugo de naranja recién exprimido es necesario adicionar 0.02% de Pectina, 0.015% de carboximetilcelulosa y 0.014% de Xantan. Con estas gomas se asegura una mínima separación de fases y una viscosidad constante de 5,2 cP durante el almacenamiento. La adición del microorganismo probiótico (Lactobacilus casei) produce cambios fisicoquímicos en el jugo, especialmente en el pH durante los primeros 10 días, los cuales son contrarrestados con el regulador de acidez adicionado (Citrato de sodio) y con el ion lactato que es adicionado como lactato de calcio, el cual, además cumple la función de compuesto fisiológicamente activo. Entre los días 15 y 20 el pH permanece constante en 3,8. La vitamina C, el Calcio y la oligofructosa permanecen totalmente solubilizados en el jugo sin producir alteraciones en la viscosidad o pH. El microorganismo crece exponencialmente los primeros 10 días de almacenamiento, posteriormente su concentración permanece constante en 7,21 * 109. Con esto y según la resolución 333 del 2011 del Ministerio de Protección Social de la República de Colombia, el jugo de naranja desarrollado en este trabajo se puede considerar como alimento probiótico.
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Juan Carlos Lucas Aguirre Es Ingeniero Agroindustrial, Magister en Ingeniería de alimentos y candidato a doctor en ciencia agrarias de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, es Profesor-Investigador de carrera del programa de Ingeniería de alimentos de la Universidad del Quindío.
Victor Dumar Quintero Castaño Es Químico, Magister en Química de alimentos, es Profesor-Investigador de carrera del programa de Ingeniería de alimentos y Coordinador de la Maestría en Procesos Agroindustriales de la Universidad del Quindío.
María Cecilia Londoño Castaño es química de la Universidad del Quindío, egresada en año 2014. Se ha desempeñado como auxiliar de investigación en proyectos ejecutados por el grupo de investigación de agroindustria de frutas tropicales de la Universidad del Quindío durante los años 2012 y 2013.
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