Doi: http://dx.doi.org/10.17584/rcch.2015v9i2.4174
RANDY FORERO1, EMIRO ORTIZ1, WADITH DE LEÓN2, JUAN CAMILO GÓMEZ3, LILLIANA HOYOS-CARVAJAL4, 5
1 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Colombia, Bogota (Colombia).
2 Facultad de Ciencias Agrarias, Laboratorio de Fitopatologia, Universidad Nacional de Colombia, Bogota (Colombia). ]]>
Fecha de recepción: 09-09-2015. Aprobado para publicación: 20-11-2015.
RESUMEN
Fusarium oxysporumes un hongo devastador en plantaciones de especies comerciales del género Passiflora, por consiguiente el propósito de esta investigación es la evaluación de Passiflora maliformiscomo una posible fuente de resistencia a este patógeno. Para este fin se emplearon plantas provenientes de semilla sexual de P. maliformisy se evaluó su respuesta ante aislamientos patogénicos de F. oxysporum, previamente identificados y demostrados como agentes causales de marchitez por Fusarium en Passiflora edulis Sims. Las pruebas se realizaron bajo invernadero en plantas de 2,5 y 19 meses de edad con un seguimiento de 70 y 231 días respectivamente. Todos los aislamientos fueron patogénicos, sin embargo, para ambos ensayos F. oxysporum A54 fue particularmente agresivo, los síntomas observados incluyeron retraso en el crecimiento, clorosis, decaimiento y decoloración del tejido vascular. En plantas de 2,5 meses se alcanzó una incidencia de 80 a 90% a los 42 días posinoculación y en plantas de 19 meses del 40% a los 91 días posinoculación. Independientemente de la edad, las plantas inoculadas manifestaron emisión de rebrotes a nivel basal y producción de geles vasculares. Los resultados sugieren que P. maliformis, desde estados fenológicos tempranos tiende a adquirir niveles de resistencia/tolerancia al ataque del patógeno, lo cual se ve reflejado en su recuperación a través de la emisión de rebrotes basales y a la formación de geles en vasos xilemáticos.
Palabras clave adicionales: rebrotes, histopatología, geles, colonización, tejidos, tolerancia.
ABSTRACT
Fusarium oxysporumis a devastating fungus on commercial plantations of Passiflora species; therefore, the aim of this research was to evaluate P. maliformisas a possible source of resistance to this pathogen. For this purpose, this study used plants from sexual seeds of P. maliformisand observed their response to pathogenic isolates of F. oxysporum, previously identified and demonstrated as a causal agent of Fusarium wilt in P. edulis Sims. Tests were performed in a greenhouse with 2.5 and 19 month-old plants with a follow-up at 70 days and 7 months, respectively. All isolates were pathogenic; however, F. oxysporumA54 was particularly aggressive in both assays; observed symptoms included stunting, chlorosis decay and discoloration of the vascular tissue. In the 2.5-month-old plants, the incidence was 80 to 90% at 42 days post-inoculation and, in the 19-month-old plants; it was 40% at 91 days post-inoculation. Regardless of the age, the inoculated plants presented basal sprouts and produced vascular gels. The results suggest that P. maliformis, starting in the early growth stages, tends to acquire resistance/tolerance levels to attack from the pathogen, which is reflected in recovery through basal sprouting and gel formation in xylem vessels.
Additional key words: sprouts, histopathology, gels, colonization, tissues, tolerance.
Las pasifloras son plantas con usos farmacéuticos, ornamentales y comestibles. Estas pertenecen a la familia pantropical de las pasifloráceas y la gran mayoría de las especies conocidas y comerciales se ubican en el género Passiflora; las especies silvestres de este género se constituyen en un importante recurso subutilizado en su potencial genético para el mejoramiento de las especies cultivadas, especialmente en aquellas características como la resistencia a patógenos particulares (Yockteng et al., 2011). Los reportes a nivel mundial en pasifloras mencionan a Fusarium oxysporumf. sp. passiflorae y Fusarium solanicomo agentes causales de la marchitez y la pudrición del cuello, respectivamente (Holliday, 1980; Ploetz, 2003; Fischer y Rezende, 2008). la marchitez causada por F. oxysporumf. sp. passiflorae, ha sido reportada en Australia, Brasil, PanamK, SurKfrica, Oenezuela, Estados Unidos, Ecuador, Kenia, Nueva Zelanda, entre otros, en hospederos como P. edulis, P. foetida, P. mollisima, P. ligularisy P. edulirf. flavicarpa (Amata et al., 2009; Fischer y Rezende, 2008; Vardner, 1989; Vrech y Rijkenberg, 1991; Oalarezo et al., 2009; Ortiz y Hoyos-Carvajal, 2011; Purss, 1958; Silva et al., 2013; Young, 1970).
La pudrición del cuello ocasionada por Fusarium solanise caracteriza por presentar hundimientos o cancros a nivel basal del tallo y pardeamiento del tejido vascular, en contraste con la marchitez vascular o secadera producida por F. oxysporumque se caracteriza por producir síntomas como falta de turgencia en la planta, pudrición del ápice caulinar y decoloración de los haces vasculares (Ploetz, 2006; Fischer y Rezende, 2008; Ortiz y Hoyos-Carvajal, 2013).
Dado el mecanismo de infección que utilizan estos patógenos, se ha planteado como estrategia de manejo el uso de patrones resistentes, lo cual ha resultado exitoso en otras plantas susceptibles a ataques de Fusarium spp. Algunas de las especies utilizadas como portainjertos y sugeridas por los estudios de Menezes (1990), Nogueira (2003) y Fischer et al. (2010) comprenden a P. alata, P. giberti, P. quadrangularis, P. macrocarpa, P. coccinea, P. nitida, entre otras. Según Molina et al. (2005), especies como P. maliformisson aún inexploradas y representan un potencial interés con respecto a ser incluidas en programas de mejoramiento genético por presentar resistencia a enfermedades y plagas. Estudios realizados por Ssekyewa et al. (1999) y Fischer et al. (2010), en diversas pasifloras han identificado a P. maliformiscomo una planta candidata para su uso como portainjerto en cultivos de P. edulis f. edulis y otros híbridos susceptibles como forma de manejo sostenible ante la enfermedad de la pudrición del cuello causada por F. solani(teleomorfo: Nectria haematococca). Fischer et al. (2010) reportan que el uso de P. maliformis como portainjerto en plantas de maracuyá (P. edulisf. flavicarpa) resulta en tolerancia a la pudrición del cuello causada por dicho patógeno permitiendo una menor incidencia con relación a las plantas no injertadas. Estudios llevados a cabo por Tamayo (1999), sobre detección de resistencia a F. solani en P. maliformis, indicaron retraso en la expresión de síntomas (resistencia horizontal).
Poco ha sido estudiada la interacción entre F. oxysporumy P. maliformis, ya que la mayoría de los estudios han sido orientados a la interacción con F. solani, por ser un patógeno de mayor impacto en los cultivos de maracuyá y granadilla, cultivos para los cuales se ha proyectado el uso de P. maliformiscomo portainjerto. Para este estudio, se propone como objetivo determinar el efecto de F. oxysporumsobre P. maliformis con aislamientos procedentes de plantas sintomáticas de gulupa (P. edulisSims), con el fin de prospectar el uso de P. maliformiscomo portainjerto en plantaciones de pasifloras de amplio interés comercial como maracuyá o gulupa.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y condiciones de crecimiento
El material vegetal empleado en todos los ensayos se obtuvo a partir de semillas de frutos de cholupa cultivada en el departamento del Huila (Colombia). La germinación se llevó a cabo en una cámara de germinación con alternancia de temperaturas de 20 a 30°C cada 12 h, bajo oscuridad constante y con previa inmersión en ácido sulfúrico (Delanoy et al., 2006). La plantulación se realizó en turba estéril y posteriormente cuando las plántulas presentaron dos hojas verdaderas se sembraron en materas, dividiéndose en dos grupos. El primer grupo se sembró en materas de 250 g, posteriormente estas plantas fueron inoculadas a los 2,5 meses después de siembra. El segundo grupo se sembró en materas de 10 L de capacidad, siendo inoculadas a los 19 meses después de siembra. Ambos grupos de plantas fueron mantenidas en un túnel bajo invernadero con temperatura entre 15 y 34°C y humedad relativa entre 70% y 90%.
Pruebas de patogenicidad
Para las inoculaciones se emplearon tres aislamientos de F. oxysporum, codificados como A27, A32 y A54, provenientes de plantas de P. edulisSims., afectadas por marchitez vascular, previamente identificados mediante marcadores morfológicos y moleculares (A54) o marcadores morfológicos (A27, A32) (Ortiz, 2012). Con el fin de analizar resistencia de tipo ontogénica, se realizaron inoculaciones en los siguientes estados fenológicos:
]]> a) Plantas de 2,5 meses: debido a que manifestaban desuniformidad en la altura, se decidió subdividirlas en dos grupos, plantas de porte bajo (7-13 cm) y plantas de porte alto (13-26 cm). Estas plantas se inocularon con los aislamientos A54 y A32.b) Plantas de 19 meses: estas plantas presentaban altura uniforme por lo cual no se subdividieron. Para su inoculación se emplearon los aislamientos descritos anteriormente y se incluyó el aislamiento A27, con el propósito de complementar la información.
Para la preparación de los inóculos, se sembraron discos de micelio joven (5 d) en medio líquido de extracto de malta y se incubaron bajo condiciones de oscuridad, agitación constante (125 rpm) y 25-27°C. Seguidamente, las suspensiones conidiales se ajustaron a una concentración de 1x106 conidias/mL. Todas las plantas se inocularon mediante la inmersión de raíces en 200 mL de suspensión conidial a una concentración de 1x106 conidias/mL durante 2 min (Gardner, 1989; Oakalounakis, 1996), lo anterior, con el fin de descartar algún efecto del volumen del inóculo. Como controles negativos se utilizaron plantas inmersas en 200 mL de agua estéril.
Posterior a la inoculación, las plantas se mantuvieron bajo las condiciones de invernadero anteriormente descritas. Finalmente, se realizaron muestreos destructivos a los 49 días posinoculación para las plantas de 2,5 meses y a los 217 d posinoculación para las de 19 meses, en los cuales se realizó caracterización de la sintomatología, reaislamiento e identificación del patógeno. Dicha identificación se hizo mediante la evaluación de características macroscópicas como color y forma de la colonia al crecer en PDA, y características microscópicas con relación a la morfología de microconidias y macroconidias (Leslie y Summerell, 2006).
Diseño y análisis estadístico
Para todos los ensayos se aplicó un diseño completo al azar. El número de repeticiones por tratamiento para los ensayos con plantas de 2,5 meses y 9 meses, fue de 10 y 5 respectiva- mente. Se realizaron evaluaciones semanales de incidencia y severidad para cada uno de los tratamientos. La evaluación de la severidad se realizó mediante la adaptación de la escala de Vakalounakis et al. (2005) (tabla 1). Con relación al análisis estadístico, mediante la función AUDPC, del paquete Agricolae, desarrollado por De Mendiburu (2012), se obtuvo el área bajo la curva (ABC) para incidencia, en virtud del tiempo (70 d después de la inoculación) y se analizaron las tendencias.
Análisis histopatológico
Para la observación de los cambios originados en tejidos por la presencia del patógeno, se tomaron plantas de vivero con síntomas de la enfermedad al final del ensayo y se realizaron cortes transversales delgados de raíz, cuello y tallo que después fueron sometidos al proceso de fijación descrito para P. edulisSims. por Ortiz et al., 2014. Por último, se confeccionaron y cortaron los bloques en parafina con micrótomo de rotación tipo Minot modelo 820 Spencer (American Optical, Delhi) con grosor de 7μm y para contrastar los tejidos se aplicó la técnica de doble tinción Astra Blue, fucsina básica (Kraus et al., 1998).
]]> RESULTADOS Y DISCUSIÓNRespuesta de P. maliformisa la inoculación con aislamientos de F. oxysporum
En los estados fenológicos evaluados algunos individuos de P. maliformisinoculados con F. oxysporummanifestaron síntomas de marchitez vascular, como clorosis, decoloración vascular y decaimiento, así mismo, se comprobó el cumplimiento de los postulados de Koch.
Para analizar estadísticamente la severidad en las plantas de 2,5 meses de edad, se tomaron los valores de las áreas generadas del monitoreo de esta variable durante 49 días y se procesaron mediante la prueba de estadística no paramétrica Kruskal-Wallis, debido a su falta de ajuste a la normalidad, encontrándose diferencias estadísticas altamente significativas entre tratamientos (valor de P: 0,00000510). En las plantas inoculadas se alcanzó un 50-90% de incidencia (figura 1), no obstante, la mayor severidad se produjo en las plantas de porte bajo (figura 2). En las plantas inoculadas con el aislamiento F. oxysporumA54, el periodo de incubación en el 50% de la población evaluada fue de alrededor de 25 días independientemente del porte. Por su parte, en las plantas inoculadas con A32, este periodo se prolongó a los 56 días, además, la incidencia que causó en las plantas de porte alto solo llegó al 50%, lo cual indica una menor virulencia de este aislamiento en las plantas más desarrolladas (figura 1).
Algunas plantas inoculadas con ambos aislamientos de F. oxysporumA32 y A54 mostraron una ligera disminución en el grado de severidad debido a la emisión de rebrotes en el tercio inferior del tallo (tabla 1, clase 3). Según esto, el 20% de las plantas de porte bajo inoculadas con el aislamiento F. oxysporumA32, presentaron remisión de síntomas. Solo una de las plantas alcanzó la clase 1 (decaimiento de foliolos, clorosis leve generalizada) a los 42 d posinoculación, posteriormente se recuperó y así continuó hasta el final de la evaluación; otra planta alcanzó al mismo tiempo la clase 2 (clorosis intermedia y ondulación del borde foliar), pero posteriormente a los 63 d posinoculación tuvo una leve recuperación de la clorosis, quedando de nuevo en la clase 1 hasta el día 70 posinoculación. El 10% de las plantas de porte alto inoculadas con el mismo aislamiento, también presentaron una disminución de la severidad, pasando de clase 1 a 0. Ninguna de las plantas que alcanzó la clase 3 se recuperó.
Lo anterior se podría explicar por la pérdida de dominancia apical debido a la afección severa que sufrió el ápice caulinar a causa del patógeno, lo cual estimuló la emisión de rebrotes basales, efecto fisiológico ampliamente documentado por Taiz y Zeiger (2006), no obstante, las plan- tas con este comportamiento se recuperaron a pesar de estar infectadas, limitando o impidiendo el avance de la enfermedad. En consecuencia, el fenómeno observado sugiere la expresión de tolerancia en las plantas recuperadas, como un mecanismo de compensación fisiológica para contrarrestar el efecto que causa la infección de F. oxysporum, en concordancia con lo expuesto por Paige y Whitham (1987); Marquis (1992); Rosenthal y Welter (1995) y Strauss y Agrawal (1999), quienes señalan que las plantas pueden tolerar la infección incrementando la concentración de clorofila en las hojas, incrementando el número de nuevas hojas o el número de ramas, adelantando el momento de la apertura de los botones florales, retrasando la senescencia de tejidos infectados o incrementando la asimilación de nutrientes.
]]> En plantas de 19 meses, el tiempo de evaluación se extendió durante 231 d, encontrándose que para estas el periodo de incubación fue de 21 d posinoculación, valor similar al que se presentó en plantas de 2,5 meses. La incidencia se estabilizó con un porcentaje del 40%, a los 42 d posinoculación para las plantas inoculadas con F. oxysporumA27 y a los 56 d posinoculación para las plantas inoculadas con F. oxysporumA32 y A54 (figura 3).
En cuanto a la severidad, las plantas inoculadas con F. oxysporumA27 presentaron un promedio de 0,8 a los 63 d posinoculación, descendiendo paulatinamente hasta llegar a 0 al finalizar el ensayo. Las plantas inoculadas con F. oxysporumA32 y A54, alcanzaron promedios de severidad de 0,8 y 1,6 a los 140 y 196 d posinoculación respectivamente, valores que se mantuvieron hasta el final del ensayo (figura 4).
Puede aducirse que la respuesta diferencial en plantas de cholupa frente al ataque de F. oxysporum, es debida a su variabilidad genotípica al provenir de semilla sexual, lo cual es consistente con lo reportado por Londoño (2012). Sin embargo, la incidencia en plantas adultas no supera el 40%, lo cual indica que hay niveles de resistencia/tolerancia al patógeno en P. maliformis, y por tanto es necesario para su uso como patrón, realizar una selección de linajes con resistencia completa a este hongo, constituyéndose así en una posible alternativa para el control de la enfermedad en campo mediante el uso de injertos.
Análisis histopatológico
Según Zhang et al. (2015) la infección por F. oxysporumen tejidos es un proceso complejo dividido en dos estados determinantes, el primero de ellos incluye la fijación al tejido, penetración por la epidermis radicular, córtex y tejido endodérmico y la colonización del sistema extravascular, el segundo estado comprende la penetración del hongo en los vasos del xilema y el establecimiento en la planta a través de este tejido. Histopatológicamente a nivel de raíz, cuello y tallo se observó el avance del patógeno vía haces vasculares correspondiendo al segundo estado descrito por Zhang et al. (2015), pero exclusivamente en haces vasculares de raíz. En este tejido, en una planta sana se observan haces vasculares despejados y funcionales y células acompañantes íntegras (figura 5A), pero una vez hay procesos de infección por F. oxysporum, es posible notar la presencia de geles (figura 5B y C) o material denso en diversos tipos de células, pero igualmente invasión de micelio en células de haces vasculares. Estos materiales densos pueden ser producto de la respuesta de la planta o procesos de degradación celular por parte del hongo en los tejidos, también es posible notar comparativamente el engrosamiento de paredes de células de haces vasculares en procesos de infección, consistentemente con lo reportado por Zhang et al. (2015).
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Figura 5La figura 5C muestra como a un aumento de 100X hay presencia de micelio del hongo en células xilemáticas, observado de un tono más oscuro, demostrando la colonización de F. oxysporumen raíces de P. maliformis. En tejidos de cuello de raíz puede observarse que la configuración normal del tejido es similar a las raíces (figura 6A), con inclusiones posiblemente de almidón dentro de las células, semejante a lo observado en plántulas de P. edulis(Ortiz et al., 2014), en estos tejidos puede apreciarse la formación de geles o material denso en las células de los paquetes de haces vasculares (figura 6B). Cortes laterales del tallo de P. maliformismuestran como en plantas inoculadas, líneas de células de tejido de haces vasculares se encuentran taponados por materiales densos (geles/tilosis), pero no es posible saber si estos corresponden a deposiciones de materiales celulares como defensa o daños realizados por el patógeno.
Las observaciones histológicas realizadas sobre P. maliformisson consistentes con lo referido por autores como Brammall y Higgins (1988), quienes afirman que la producción de geles o papilas es una respuesta común al ataque de F. oxysporum. Así mismo, comúnmente se afirma que la acumulación de geles en los vasos del xilema tiene como objeto impedir el avance de la colonización del patógeno, no obstante en estas plantas se nota la colonización del hongo y la formación de geles en un mismo corte en diferentes células, porque sencillamente una planta no podría acumular geles en todas sus células, ya que autores como Baayen y Elgersma (1985) afirman que, esta acumulación excesiva de geles, a la larga, contribuye a la obstrucción de dichos vasos xilemáticos ocasionando síntomas de marchitez, por ello esta respuesta histológica tiene una eficiencia relativa en impedir el avance del patógeno. Por otro lado, Saniewska (2004) menciona que algunas veces el patógeno alcanza a sobrepasar dicha barrera y alcanzar órganos superiores como hojas y secciones superiores del tallo.
Es claro que la respuesta histológica, que incluye la producción de geles, el engrosamiento de paredes, aunado a respuestas químicas, puede contribuir a la resistencia/tolerancia a Fusarium. Autores como Van den Berg et al. (2007) encontraron que en clones de Musa tolerantes a F. oxysporumf. sp. cubense hay inducción de compuestos fenólicos asociados a pared celular. Consistentemente con esto, en el patosistema melón-Fusarium, Chang et al. (2015) observaron que la acumulación de compuestos fenólicos de la pared de las células y aumento de la actividad peroxidasa en los ápices radiculares, junto con la rápida deposición de lignina en las paredes celulares de los haces vasculares en plantas de semillero de un genotipo resistente a F. oxysporum, concluyendo que estos puede proporcionar barreras estructurales a estas plantas. Un fenómeno similar fue encontrado en Vigna sesquipedalis frente al ataque por Fusarium (Zhang et al., 2006), por tanto plantas con respuestas histológicas como estas pueden ser potencialmente resistentes/tolerantes al patógeno. Por otro lado, además de las estrategias evaluadas en el presente artículo, es importante anotar que la detoxificación de toxinas del hongo es usada por las plantas para escapar al ataque de patógenos, como lo demostraron Bacon et al. (2008) en maíz. Este tipo de enfoque ha sido explorado por autores como Flores et al. (2012) en pasifloráceas para hacer selecciones iniciales de plántulas con potencial resistencia a Fusarium, evaluando sobre P. edulis ácido fusárico obtenido de F. oxysporumf. sp. passiflorae, demostrando que ante presencia de la toxina hay una inducción de producción de raíces, que posteriormente puede ser determinante en la tolerancia al hongo.
CONCLUSIONES
Puede señalarse que el material de P. maliformisevaluado presenta una respuesta diferencial de resistencia/tolerancia frente al ataque del patógeno, probablemente influenciada por su variabilidad genética. Por consiguiente, algunos mecanismos de resistencia parcial involucrados estarían mediados por la formación de geles en vasos xilemáticos. Por otra parte, la respuesta fisiológica que puede notarse en algunas de estas plantas como el macollamiento o emisión de rebrotes de la planta, sugiere un mecanismo de tolerancia, el cual implica un mayor costo energético, no obstante, esta característica es percibida en campo como "resistencia". Por lo tanto, es importante evaluar la variabilidad de las respuestas de poblaciones de plantas de P. maliformis ante el ataque de Fusarium permitiendo conocer y seleccionar líneas de P. maliformiscomo materiales promisorio para el manejo de Fusarium en plantaciones comerciales de otras pasifloras mediante injertación.
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