Doi: http://dx.doi.org/10.17584/rcch.2016v10i2.5652
1 Departamento de Alimentos, Universidad de Antioquia, Medellín (Colombia).
2 Escuela Ingeniería de Alimentos, Universidad del Valle, Cali (Colombia).
]]> 3 Autor para correspondencia: freddy.forero@udea.edu.coFecha de recepción: 06-04-2016. Aprobado para publicación: 24-11-2016.
RESUMEN
La mangiferina C19H18O11 (1,3,6,7-Tetrahydroxyxantona-C2-β-D-glucósido), se aisló a partir de la corteza seca de 40 cultivares del árbol de Mangifera indica L., por extracción líquido/sólido y análisis cuantitativo por espectrofotometría UV-Vis. El producto se caracterizó como un polvo amorfo, amarillo verdoso, soluble en etanol y metanol, punto de fusión 270±2°C, λmax 370 nm. Los cultivares Pig 693 y Rosa presentan los mayores contenidos del compuesto activo con 5.257,9±98 y 4.906,2±95 mg/100 g bs), los de menor concentración son Bocao e Itamaraca con 698,9±13 y 893,8±17 (mg/100 g bs), respectivamente. El análisis de conglomerados generó cuatro grupos, donde los mangos asiáticos tuvieron un contenido superior promedio de mangiferina, seguidos por los estadounidenses y los suramericanos. Este trabajo es la primera investigación exploratoria realizada sobre esta xantona en cultivares de mango ubicados en Colombia, sustancia de interés en las áreas de fitomedicina, cosmetología y nutrición.
Palabras clave adicionales: Colombia, fitoquímica, metabolitos, xantonas.
ABSTRACT
The mangiferin C19H18O11 (1,3,6,7-Tetrahydroxyxantone-C2-β-D-glucoside) was isolated from dry bark of 40 cultivars of Mangifera indica L, using liquid/solid extraction and quantitative analysis by UV-Vis spectrophotometry. The product was characterized as an amorphous and greenish yellow powder, soluble in ethanol and methanol, with melting point 270±2°C, λmax 370 nm. The cultivars Pig 693 and Rosa have the highest content of active compound with 5257,9±98 and 4906,2±95 (mg/100 g db), the lower concentrations are in Bocao and Itamaraca with 698,9±13 and 893,8±17 mg/100 g db, respectively. Cluster analysis originated four groups, where Asian mangoes had a higher average content of mangiferin, followed by the North Americans and South Americans. This work is the first exploratory research conducted about this xanthone on mango cultivar located in Colombia, this substance has multiple and effective applications in areas like phytomedicine, cosmetics and nutrition.
Additional key words: Colombia, metabolites, phytochemistry, xanthones.
INTRODUCCIÓN
Los estudios relacionados con la extracción y caracterización de mangiferina se remontan a trabajos en la década del sesenta (Bhatia y Seshadri, 1968), quienes aislaron y establecieron la estructura del compuesto, haciendo uso de pruebas selectivas. El producto se obtuvo inicialmente de la madera y corteza del mango (Mangifera indica L.) y fue identificado como un C-glicósido estable del grupo de las xantonas (1,3,6,7-Tetrahydroxyxantona-C2-β-D-glucósido). La mangiferina es un polifenol que se produce por una ruta biosintetica como muestra la de la figura 1 (Joubert et al., 2012; Chavan et al., 2015), está ampliamente distribuida en plantas superiores de las familias Anacardiacae, Gentianaceae y Guttiferae, llamada también una C-glucosilxantona, que se caracteriza por ser resistente a la hidrólisis química y enzimática, a diferencia de las xantonas O-glicósido, en los que el azúcar, está unida por un enlace carbono- oxígeno al núcleo y es sensible a la hidrólisis (Scartezzini y Speroni, 2000; Kawakami y Gaspar, 2015). Pocos compuestos pertenecen a este grupo y la mangiferina es la más frecuente, está presente en 60 especies, 18 géneros y 13 familias de dicotiledóneas y se encuentra asociada con C-glucoflavonas, pero no de otras xantonas, por lo que se ha usado como marcador en estudios quimiotaxonómicos (Ferreira et al., 2013; Kulkarni y Rathod, 2015).
]]>Desde el punto de vista de la extracción se ha observado que las muestras de corteza de mango presentan mayores rendimientos, respecto de la concentración encontrada en las hojas, los rendimientos y la demanda para la industria farmacéutica, ha motivado la búsqueda de nuevas fuentes y se han establecido condiciones para su síntesis, comparando espectroscópicamente la molécula obtenida con el compuesto de origen natural, observando similitud, dejando así las condiciones para la producción a escala de laboratorio (Ruiz-Montañez et al., 2014; Montes et al., 2016). Los C-glucósidos y con ello la mangiferina son fácilmente detectados mediante análisis cromatografico de extractos vegetales hidrolizados; con el desarrollo de los métodos modernos de análisis se han podido identificar nuevas fuentes y niveles de concentración (Han et al., 2010) (Qiu et al., 2016).
La importancia comercial de mangiferina obedece a su amplio espectro de uso como suplemento nutricional, cosmético y fitomedicinal; en Cuba se desarrolló una decocción acuosa patentada como el producto comercial Vimang® (Beltrán et al., 2004), similar al Salaretin®, de Sri Lanka que se usa en los tratamientos de obesidad y diabetes tipo II; se han reportado aplicaciones como agente antiviral, modulador inmunológico y antioxidante (Martínez et al., 2000; Leiro et al., 2003; Mishra et al., 2006; Sethiya et al., 2015). El potencial del banco de germoplasma (colección nacional) de mango localizado en Corpoica (C.I. Nataima) facilita un estudio piloto tendiente a la extracción, purificación y cuantificación de mangiferina presente en la corteza de diversos cultivares de mango, lo cual ayuda comprender la fisiología y procesos bioquímicos de esta especie a fin de lograr su aprovechamiento con fines científicos y económicos, en el área de los productos naturales y de especial interés para Colombia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Las cortezas de Mangifera indica L. (Anacardiaceae) fueron colectadas en la colección nacional de Corpoica, Centro de Investigación Nataima (altitud: 420 msnm, temperatura promedio anual: 28°C, precipitación promedio anual: 1.400 mm, suelo franco arenoso, en El Espinal, Tolima, Colombia) donde se ha establecido una colección nacional con 86 variedades de mango, de las cuales se escogieron 40, teniendo en cuenta su importancia comercial, origen, edad y estado fisiológico (Tab. 1).
Las muestras se tomaron de ramas maduras, libres de hongos o enfermedades, retirándolas con un cuchillo de acero inoxidable, evitando cortes de madera; rotulando con fecha, número accesión, variedad, tipo embrionario y origen biogeográfico. Una vez clasificadas, se transportaron al laboratorio donde se pesaron (PE 3600±0,1 g, Mettler-Toledo International, Greifensee, Suiza) y secaron durante 8 h a 40±2°C (Hotbox Oven size 1, Gallenkamp) (Lab Merchant, London). La corteza seca (CS) fue molida a un tamaño de partícula de 2 mm (Lab. Mill model 4, Thomas-Wiley, Swedesboro, NJ) para finalmente ser empacadas en bolsas al vacío y almacenadas bajo congelación (-15±1°C).
]]> ExtracciónSe aplicó un protocolo base (Núñez et al., 2002), con ligeras modificaciones; corteza seca y molida (50 g) por triplicado, se sometió a extracción líquido/sólido en unidad Soxhlet (250 mL), para remoción de la fracción grasa con éter de petróleo 40:60 (250 mL × 8 h), posteriormente con Me2CO (250 mL × 8 h), para eliminación de taninos y finalmente con EtOH/H2O (70:30 v/v) (250 mL × 8 h) para la obtención del extracto total (ET), que fue concentrado a 150 mL en un rotovapor (Laborota 4011, Heidolph Instruments, Schwabach, Alemania) con posterior almacenamiento a -15±1°C y protegidos de la luz.
Purificación y caracterización
La mangiferina patrón se obtuvo usando una muestra de ET, filtrando al vacío (Vacuum Station, Barnant, Barrington, IL), empleando una membrana de 7 μm (Whatman GF/C), el ET filtrado fue concentrado y la mangiferina fue recristalizada en EtOH 96% bajo presión reducida y recuperada como un sólido cristalino que fue almacenado en frascos ámbar bajo temperatura de congelación (-15±1°C). Al producto patrón se le determinó punto de fusión (M5000, Krüss), rotación óptica (P1000-LED, Krüss) y análisis por espectrofotometría UV-Vis (EtOH) (Helios Zeta, Thermo Scientific: Thomas Scientific, Swedesboro, NJ) con un barrido en el rango 200 a 650 nm, evaluando el comportamiento ácido-base, para establecer los desplazamientos a máxima absorbancia, la información se verificó y complementó con datos reportados en la literatura científica.
Cuantificación y análisis estadístico
La cuantificación de la mangiferina en los ET, se realizó mediante espectrofotometría UV-VIS, a una longitud de onda de 370 nm, para lo cual se preparó una curva patrón de mangiferina en EtOH/H2O (70:30 v/v), usando la muestra previamente recristalizada y caracterizada, las concentraciones utilizadas fueron 1, 5, 10, 20, 30, 50, 70 ppm de mangiferina, cada concentración fue preparada por triplicado. Una vez construida la curva de calibración, la determinación del contenido de mangiferina se realizó sobre los ET homogenizados y atemperados, tomando un volumen de 3 μL (Micropipette 841, Socorex, Suiza), completando a 1 mL con EtOH/H2O (70:30 v/v) en una celda de cuarzo y leyendo los valores de absorbancia a 370 nm, previa calibración del equipo con un blanco EtOH 96%, los resultados finales se expresaron en mg de mangiferina por 100 g CS.
Todos los datos generados se analizaron con el paquete estadístico Statgraphics 5 Plus® (StatPoint Inc.), efectuando pruebas intra e intervariedades para verificar si existían diferencias significativas (95% confianza) para el contenido de mangiferina, con el fin de identificar posibles relaciones multivariantes de agrupación se utilizó el análisis de conglomerados para clasificar a un conjunto de individuos (variedades) en grupos homogéneos, el método usado fue el de Ward, aplicando la distancia métrica euclidiana.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Material vegetal y extracción
Se evidenció que la etapa de molido tiene especial importancia, ya que el tamaño de partícula elegido fue limitante, con tamaño menor a 2 mm se formó una masa semisólida, que dificultó la recirculación y penetración del solvente. La eliminación de lípidos y taninos facilita en gran medida el proceso de cuantificación de la mangiferina, de no ser así, estos compuestos serían arrastrados por el EtOH, debido a un efecto de cosolvencia, lo cual provoca un error significativo al interferir en la banda de absorbancia máxima.
]]> El uso de EtOH en la etapa final está justificado por ser uno de los solventes menos costosos, tener una toxicidad muy baja y permitir la extracción a temperatura menor de 80°C, limitando la formación de compuestos no deseados, la principal ventaja del uso de mezclas de solventes en procesos de extracción reside en la capacidad de incremento de la relación de polaridades que contribuyó de manera selectiva a la eficiencia de la extracción, la polaridad estimada para la mezcla EtOH/H2O (70:30 v/v) fue de 63,4 más baja que el agua (80) pero mayor el etanol (24,6) (Faizi et al., 2006).Caracterización
El compuesto patrón de mangiferina obtenido se caracterizó como un polvo amorfo de color amarillo verdoso, soluble en EtOH y MeOH; presentó punto de fusión de 270±0,5°C, y rotación específica [α]25 D ≥ 34°, el espectro UV-VIS (Fig. 2) presentó señales de máxima absorbancia a 259, 316 y 370 nm que son coincidentes con moléculas tipo xantona y en particular con la mangiferina.
Se observaron cuatro bandas de absorción principales a λmax 240 nm de transiciones electrónicas π→*π del núcleo aromático, la segunda entre 230 y 260 nm debida a la transición π→*π de uno de los anillos continuos al núcleo central que contiene el enlace carbonilo, la tercera banda de menor intensidad con un máximo a 317 nm relacionada con la transición n→*π del anillo aromático, la última banda con λmax 370 nm cercana al rango visible, podría ser asignada a la transferencia de carga intermolecular (Gómez-Zaleta et al., 2006).
La molécula de mangiferina extraída, presentó un marcado comportamiento ácido-base, los cambios en el pH del solvente indujeron desplazamientos a longitudes de onda mayor (efecto batocrómico). A pH 4,0, la primera banda de absorción presentó un efecto hipercrítico, seguido por un efecto hipocrómico, después de alcanzar un pH cercano a 7,6 que se acompaña de un marcado efecto batocrómico de 257 a 271 nm que puede estar relacionado a la formación de un ion enolato y extinción de la tercera banda; la última banda alcanza su máximo de absorción a pH 9,6 con (390 nm), con un pronunciado efecto hipocrómico (Fig. 3), este comportamiento es similar al reportado por otros autores (Mishra et al., 2006).
La fracción mayoritaria de los extractos blandos obtenidos de las cortezas, está conformada por polifenoles, donde se destaca la presencia de mangiferina como el componente mayoritario. De su estructura química, se concluye que la mangiferina cumple con los cuatro requisitos descritos en la literatura científica para lograr la mejor biodisponibilidad por vía oral: (1) peso molecular menor de 500, (2) menos de cinco funciones donantes para enlaces de hidrógeno, (3) menos de 10 funciones aceptoras de enlaces de hidrógeno, (4) log P (potencial) calculado menor de +5 (logP mangiferina = + 2,73) (Beltrán et al., 2004).
]]> CuantificaciónLa determinación cuantitativa procedió luego de establecer la linealidad de la curva de calibración, el coeficiente de correlación fue de 99,92% (r2 = 0,9992), el rango dinámico de respuesta varió entre 0,232 a 0,975 unidades de absorbancia, equivalente a 0,005-0,020 mg mag/mL, para los límites de detección mínimo y máximo, respectivamente, los cuales estuvieron dentro de los parámetros analíticos reportados en otras investigaciones (Ruiz-Montañez et al., 2014).
Los datos para los contenidos totales de mangiferina presentaron una distribución normal, la cantidad de mangiferina extraída se ve afectada por la variedad (P≤0,05), por lo que se procedió a efectuar la prueba de rangos múltiples (Tukey HSD) para encontrar qué variedades se agrupaban en grupos homogéneos (Tab. 2). Los cultivares Pig 693, Rosa y Julie, fueron los dos grupos con mayor contenido de mangiferina con 5.257, 4.906,2 y 4.879,1 mg mag/100 g CS, respectivamente, caso contrario se observó en los materiales Bocao (698,9) e Itamaraca (893,8) que tienen los contenidos de mangiferina más bajos. Esta marcada diferencia puede ser determinada por factores genéticos, ontogenéticos y ambientales, pues la producción de compuestos bioactivos se da a nivel secundario del metabolismo y este a su vez es una función de la expresión génica (Ribeiro et al., 2008).
Al efectuar el análisis de conglomerados (Fig. 4), teniendo como variables de agrupación la variedad, origen, tipo de embrión y contenido de mangiferina, se identificaron cuatro grupos claramente diferenciados, donde se aprecia que los factores origen y contenido de mangiferina fueron los de mayor peso en el proceso de agrupación.
En el conglomerado 1 se encuentran ubicados las variedades de Centro y Suramérica (CYSA) caracterizados por ser en su mayoría (90%) del tipo poliembrionico (Pe) y presentar el nivel promedio más bajo en el contenido de mangiferina; los mangos de Asia se ubicaron en el conglomerado 2 con una distribución homogénea (50:50) para el tipo de embrión y un contenido de mangiferina alto; las variedades de Estados Unidos fueron 88% monoembrionicas y con un contenido de mangiferina medio, siendo todas ellas pertenecientes al grupo 3, finalmente el conglomerado 4 lo componen 6 variedades de orígenes mixtos y con muy altos contenidos del compuesto activo mangiferina.
Es necesario tener en cuenta el factor ontogenético, porque la concentración de compuestos bioactivos como la mangiferina varió de acuerdo al origen y desarrollo de la planta, en ese sentido, las variedades autóctonas (CYSA), con escasa importancia económica y no sometidas a procesos de mejoramiento, podrían ser una explicación para presentar un menor contenido de compuestos bioactivos (Kulkarni y Rathod, 2014). Por otro lado, los factores ambientales pueden modificar la producción de metabolitos secundarios, influenciando directamente la expresión de los genes, en ese sentido, los genes responsables para la producción de metabolitos se pueden activar o desactivar de acuerdo con las condiciones climáticas o nutricionales, ataque de plagas (Ribeiro et al., 2008).
]]> La identificación de las variedades con altos contenidos de mangiferina es un resultado importante desde el punto de vista tecnológico, teniendo en cuenta que los subproductos, como la corteza, son generalmente desechados durante las labores de mantenimiento del cultivo de mango, siendo posible utilizarlos como materia prima para obtener compuestos de alto valor agregado y disminuir simultáneamente posibles contaminantes ambientales.CONCLUSIONES
Los métodos empleados para la extracción, purificación y cuantificación de la mangiferina fueron adecuados, encontrándose que la corteza del árbol de mango es una gran fuente de este metabolito secundario, se identificaron diferencias significativas intra e intergrupos para el contenido de mangiferina, encontrándose a las variedades Pig 693 y Rosa, como las de mayor concentración de mangiferina, la limitación en el uso de estas variedades podría ser la poca área plantada a nivel comercial. Se identificó una gran variabilidad en los contenidos de mangiferina que puede ser explicada por el cruzamiento de manera natural, formando un complejo de híbridos interraciales e intraraciales, los cuales han dado origen a más de un millar de variedades de mango. El procedimiento presentado y variedades promisorias es una iniciativa preliminar que puede ser evaluada a nivel de laboratorio y posteriormente en planta piloto con fines de comercialización, en este sentido habría que considerarse la recuperación de los solventes, lo cual se reducirá el posible impacto ambiental y costos de producción.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan su agradecimiento a la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica, Centro de Investigación Nataima), por su apoyo en la consecución del material vegetal y logística.
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