Caracterización por electroforesis de campo pulsado de aislamientos de Salmonella Typhimurium recuperados en el programa de vigilancia de enfermedad diarreica aguda en Colombia, 1997-2004

Nélida Muñoz, María Elena Realpe, Elizabeth Castañeda, Clara Inés Agudelo

Grupo de Microbiología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C. Colombia.

Introducción. En Colombia, Salmonella Typhimurium es el segundo serotipo más frecuentemente aislado en muestras clínicas humanas después de S. Enteritidis, y representa el 28,2% (n = 468) de los 1.659 aislamientos recuperados en el programa de vigilancia por el laboratorio de enfermedad diarreica aguda liderado por el Grupo de Microbiología del Instituto Nacional de Salud.

Objetivo. Caracterizar molecularmente los aislamientos de S. Typhimurium que circulan en el país con el fin de establecer su perfil y determinar su relación genética.

Materiales y métodos. En 468 aislamientos remitidos por 14 laboratorios de salud pública departamentales, recuperados entre enero de 1997 y diciembre de 2004, se determinó el perfil genómico por electroforesis de campo pulsado con la enzima de restricción XbaI según el protocolo de la Red PulseNet (CDC, Atlanta); el análisis de los geles se realizó con el programa Fingerprinting II.

Resultados. Se obtuvieron 180 patrones electroforéticos. Los patrones prevalentes fueron COINJPX.X01.0062, encontrado en 101 aislamientos (21,3%), seguido por los patrones COINJPX.X01.0001 en 40 (8,4%), COINJPX.X01.0058 en 13 (3%), COINJPX.X01.0003 en 12 (2,5%), COINJPX.X01.0066 en 11 (2,3%) y COINJPX.X01.0108 en 6 (1,4%). COINJPX.X01.0001, fue el patrón predominante en Bogotá hasta 2002, reemplazado a nivel nacional por el COINJPX.X01.0062. El análisis de agrupamiento mostró tres grupos con similitudes genéticas entre 53% y 82%, lo que revela la heterogeneidad genética del serotipo.

Conclusiones. El estudio permitió identificar patrones electroforéticos prevalentes, tener una base de datos nacional disponible para la comparación de los perfiles en tiempo real, detectar brotes y relacionar casos aparentemente aislados.

Palabras clave: Salmonella Typhimurium, vigilancia epidemiológica, diarrea, electroforesis en gel de campo pulsado, Colombia.

Introduction. In Colombia Salmonella Typhimurium is the second most frequently isolated Salmonella serotype (after S. Enteritidis) from human clinical samples. This serotype represents 28.2% (n = 468) of the 1659 Salmonella isolates recovered by the Instituto Nacional de Salud (INS) Acute Diarrheal Diseases Surveillance Program from 1997 to 2004. Previously, little was known about the molecular attributes of these strains and commonality of genetic subtypes among S. Typhimurium isolated from humans in Colombia.

Objective. The purpose of this study was to characterize S. Typhimurium isolates circulating in Colombia using pulsed-field gel electrophoresis in order to establish genetic profiles and determine their potential relatedness.

Materials and methods. 468 S. Typhimurium isolates were submitted to INS by 14 Public Health Laboratories from January 1997 to December 2004. The pulsed-field gel electrophoresis was performed using restriction enzyme XbaI according to the PulseNet standard protocol (CDC, Atlanta). Restriction pattern analysis and cluster definition were performed using Molecular Analyst Fingerprinting II software.

Results. 180 distinct electrophoretic patterns were obtained. Pattern COINJPX.X01.0062 was the most common (21.3% of the 473 isolates, n=101), followed by COINJPX.X01.0001 (8.4%, n=40), COINJPX.X01.0058 (3%, n=13), COINJPX.X01.0003 (2.5%, n=12), COINJPX.X01.0066 (2.3%, n=11), and COINJPX.X01.0108 (1.4%, n=6). COINJPX.X01.0001, was the most prevalent pattern among S. Typhimurium isolated in Bogotá from 1997-2002, but appeared to be replaced both in Bogotá and nationally by COINJPX.X01.0062 in 2003-2004. Cluster analysis demonstrated three distinct groups with 53% and 82% similarity indicating heterogeneity within the serotype.

Conclusions. The study provides important electrophoretic pattern baseline data, which will be useful for prospective real-time comparison of profiles of future isolates. Cluster detection using this method will facilitate outbreak detection and will enhance our ability to find common sources for seemingly unrelated infections.

Keywords: Salmonella Typhimurium, epidemiologic surveillance, diarrhea, electrophoresis, gel, pulsed-field, Colombia.

Salmonella spp. son los principales patógenos causantes de las enfermedades transmitidas por alimentos en países en vías de desarrollo; al igual que, en países desarrollados donde Salmonella spp. suelen ser más importantes que Escherichia coli enterotoxigénica y Shigella sp, los cuales a menudo también son superados por otros agentes como Campylobacter spp. (1,2). Con base en la diversidad de los antígenos somáticos y flagelares, el género Salmonella se clasifica en 2.523 serotipos descritos en el esquema de Kauffmann y White (3,4). S. Typhimurium es uno de los serotipos más frecuentemente aislados en pacientes con salmonelosis en países como EEUU (5,6), Argentina y Brasil, entre otros (7). En nuestro país, la importancia de S. Typhimurium se debe a su frecuencia y perfil de multirresistencia antimicrobiana, representando el 28,2% del total de aislamientos de Salmonella spp. confirmados por el Grupo de Microbiología del Instituto Nacional de Salud en el Programa de Vigilancia de la Enfermedad Diarreica Aguda entre 1997 y 2004. Este serotipo presenta una resistencia a tetraciclina de 79,2%, a ampicilina de 69%, a trimetoprim sulfametoxazol de 54,2%, a cloranfenicol de 23,8%, y una multirresistencia de 53,1%, predominantemente a ampicilina, tetraciclina y trimetoprim sulfametoxazol (7,8).

Debido a la elevada prevalencia del serotipo Typhimurium y a la limitación de la técnica de serotipificación para diferenciar entre los aislamientos del mismo serotipo, se hace difícil el reconocimiento de brotes cuando éstos se relacionan con un número bajo de casos y se aislan con frecuencia (9,10); por consiguiente, se han empleado otras técnicas de tipificación de Salmonella spp. como la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana (3,7,10) y la fagotipificación (11), las cuales permiten establecer relaciones epidemiológicas. Las técnicas de subtipificación molecular como la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), considerada la prueba de oro para la diferenciación y el agrupamiento de aislamientos de Salmonella spp. de un serotipo específico, la cual es en la actualidad el método más ampliamente utilizado en las redes de vigilancia de enfermedades transmitidas por alimentos (12-16).

En 1996 se creó en EEUU la Red Nacional de Subtipificación Molecular de Patógenos Transmitidos por Alimentos, PulseNet, la cual emplea la técnica PFGE. PulseNet no es un sistema de vigilancia como tal, pero sí propone un método de subtipificación recomendado por el CDC de Atlanta para los programas de vigilancia de las enfermedades transmitidas por alimentos que permite establecer a través de las bases de datos de los patrones de PFGE una rápida comparación electrónica entre los perfiles de ADN de los diferentes laboratorios en cualquiera de las redes, logrando identificar los grupos clonales asociados con brotes a nivel local, nacional y regional. PulseNet cuenta con redes en EEUU, Canadá, Europa, Asia y América Latina (17).

Dado que en Colombia S. Typhimurium es el segundo serotipo más frecuentemente aislado en muestras clínicas y que su virulencia está rela-cionada con la multirresistencia a los antibióticos, se consideró necesario conocer más sobre su epidemiología molecular; este estudio buscó caracterizar por PFGE los aislamientos de S. Typhimurium recuperados en el Programa de Vigilancia de la Enfermedad Diarreica Aguda entre 1997 y 2004, con el fin de establecer su perfil y determinar su relación genética. Este conoci-miento permitirá realizar la vigilancia activa de la salmonelosis mediante la comparación de los perfiles genéticos en tiempo real con el fin de detectar brotes y sus posibles fuentes de infección y establecer la relación de casos aparentemente aislados.

De los 436 aislamientos clínicos, el 42% se recuperó de mujeres y el 58%, de hombres. La edad estuvo en un rango entre 0 y 83 años, con una media de 15 años y una desviación de 20,8 años con respecto a la media. Los menores de 15 años constituyeron el grupo de edad con mayor número de aislamientos 268(67,5%) y en este grupo, 146 (54,5%) correspondían a menores de cinco años, 140 (34,3%) a mayores de 15 años y 28 no registraban la edad de los pacientes.

Los aislamientos se encontraban almacenados a -70 °C en leche descremada (Difco) al 20% como parte del cepario del Grupo de Microbiología. Para su recuperación, cada uno de ellos se resembró dos veces en agar infusión cerebro corazón (BHI) (Becton, Dickinson) a 37°C en aerobiosis. El 10% del total de los aislamientos se confirmó bioquímicamente de acuerdo con el esquema de identificación estandarizado en el laboratorio (19), y serológicamente siguiendo el esquema de Kauffmann-White (3) con antisueros (Difco).

El perfil genómico se estableció mediante la técnica de PFGE. El total de aislamientos fue procesado con el protocolo estandarizado por el CDC de Atlanta para la subtipificación molecular de Salmonella, que utiliza discos de agarosa y el fago Lambda como marcador de peso molecular. Por la técnica de bloques que utiliza el protocolo de PFGE modificado por la Red PulseNet-EEUU (año 2000) y Salmonella Braenderup H9812 como marcador de peso de molecular se procesaron el 10% de los aislamientos que presentaron por la técnica de disco el mismo patrón electroforético y todos los aislamientos que presentaron un solo patrón.(16).

Para la preparación del ADN se mezclaron las suspensiones bacterianas con una absorbancia de 1,1 (a una longitud de onda de 610 nm) con 0,5 mg/ml de proteinasa K (Promega) y luego fueron embebidas en agarosa de bajo punto de fusión (Low-melting, Bio-Rad) al 2% en buffer TE para elaborar los discos. En la técnica de bloques, se mezclaron 200 ml de la suspensión con igual volumen de agarosa SeaKem Gold 1% (Cambrex, Cambridge Maryland, USA) y de dodecil sulfato de sodio (SDS) 1%. Posteriormente se sometieron a lisis celular en una solución tamponada (Tris 50mM, EDTA 50mM, pH 8,0), sarcosil 1% proteinasa K a 0,1 mg/ml) a 54 °C en baño de María con agitación constante a 200 rpm durante dos horas, y posteriormente se realizaron seis lavados a 50 °C por 15 minutos, dos con agua Milli Q y cuatro con buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Todos los aislamientos se analizaron usando la enzima de restricción XbaI (Promega). Los discos y los bloques se separaron en geles de agarosa al 1% (PFGE- grade, Bio-Rad y Seakem Gold, Cambrex, respectivamente). La PFGE se realizó en el CHEF DRII-Bio-Rad, con un tiempo inicial de 2,2 segundos, tiempo final de 63,8 segundos, voltaje de 6V/cm y tiempo de corrido de 18 horas a 14°C. Después del corrido electroforético, los geles se tiñeron con bromuro de etidio (1 µg/ml) en agitación constante durante una hora y se destiñeron después con agua destilada durante el mismo tiempo. Posterior-mente, el ADN se visualizó en un transiluminador con luz UV y la imagen se registró con una cámara Polaroid para su análisis.

Los geles de agarosa preparados con discos y con bloques fueron normalizados en el programa Fingerprinting II versión 3.0 (Bio-Rad) con el marcador de peso molecular respectivo (20). Las bandas obtenidas se definieron visualmente teniendo en cuenta su número y su posición y se compararon con la foto correspondiente.

Siguiendo las recomendaciones de la Red PulseNet, los perfiles de PFGE identificados en los aislamientos de S. Typhimurium para ingresarlos a la base de datos nacional se designaron con el código COINJPXX01.0001, que corresponde al país Colombia (CO), Instituto Nacional (IN), Typhimurium (JPX), enzima de restricción XbaI (X01) y número del patrón (0001) de S. Typhimurium. La numeración de los patrones se continuó de acuerdo a la secuencia de la base de datos descrita por Wiesner et al (21).

Los coeficientes de similitud se calcularon con el algoritmo Dice utilizado para comparar los patrones de macrorrestricción y para establecer la relación genética entre los aislamientos. Los elementos de la matriz fueron sometidos a análisis de agrupamientos empleando la técnica del algoritmo de emparejamiento de bandas con base en promedios aritméticos (UPGMA- unweighted pair-group metered using arithmetic average), método que utiliza un agrupamiento secuencial. La identificación y ordenamiento de las relaciones de manera decreciente con respecto a la similitud permitió una variación de 1,5% en la posición de la banda, de esta forma se construyeron los respectivos dendrogramas.

Se utilizaron tablas cruzadas para describir el comportamiento de los patrones electroforéticos con relación al lugar de procedencia y la fuente del aislamiento. La asociación entre estas variables se exploró utilizando la prueba estadística de ji cuadrado, generada con un 95% de confianza. Para su procesamiento se utilizó el software estadístico MINITAB versión 14.0.

De los 101 aislamientos que presentaron el patrón COINJPX.X01.0062, 53 (52,4%) provenían de Antioquia y 24 (23,8%) de Bogotá. Este patrón también fue dominante en los 24 (23,8%) aislamientos restantes provenientes de otros departamentos. Otros patrones comunes en Antioquia fueron el COINJPX.X01.0058 y el COINJPX.X01.0108, los cuales se encontraron respectivamente en 92% (11/12) y 83,3% (5/6) del total de los aislamientos con estos genotipos. Los patrones COINJPX.X01.0001 y COINJPX. X01.0003 se encontraron respectivamente en el 48,8% (20/41) y 85,7% (12/14) del total de los aislamientos con estos genotipos provenientes de Bogotá. En Nariño, el patrón COINJPX.X01.0066 se presentó en 90% (9/10) del total de los aislamientos con este genotipo. En Santander y Valle no se encontraron patrones predominantes.

En cuanto a la distribución de los patrones por grupos de edad, en el grupo de niños entre 0 y 5 años y mayores de 15 años, el predominante fue COINJPX.X01.0062 con 25,7 y 28,5%, respec-tivamente. En el grupo de edad entre 6 y 14 años no se demostró un patrón común. En ambos géneros los patrones COINJPX.X01.0062 y COINJPX.X01.0001 se relacionaron con 21,3 y 8,3%, respectivamente.

La relación de los patrones electroforéticos por fuente de infección mostró que en las 346 mues-tras de materia fecal, los patrones más frecuentes fueron COINJPX COINJPX.X01.0058 en 12 (3,4%), COINJPX.X01.0003 en 10 (2,8%) y COINJPX.X01.0108 en 5 (1,4%). No se encontró asociación estadísticamente significativa entre el patrón electroforético y la fuente (ji cuadrado = 10,6; p > 0,05).

El análisis de los perfiles de PFGE estableció relación genética de los dos aislamientos que epidemiológicamente estuvieron involucrados en el brote de enfermedades transmitidas por alimentos en Nariño en el 2000, con cuatro aislamientos adicionales recuperados de pollo crudo en el mismo año y en diferentes localidades del departamento, ya que presentaron el mismo patrón electroforético, COINJPX.X01.0066. En el segundo brote ocurrido en el 2003, se encontró el mismo patrón de PFGE, COINJPX.X01.0120, en tres alimentos preparados y en cuatro pacientes.

El dendrograma del total de aislamientos de S. Typhimurium permitió determinar un rango de similitud genética de entre 53 y 82% con tres grupos principales.

Los aislamientos del primer y tercer grupo presentaron una baja similitud genética (inferior a 80%), lo cual confirma la heterogeneidad genética de este serotipo.

El grupo II se dividió a su vez en 46 subgrupos que relacionaron aislamientos indistinguibles genéticamente (100% de similitud) y 255 (53,9%) aislamientos que presentaron 149 patrones electroforéticos diferentes con una similitud genética superior a 80%. Esto indica que a pesar de la alta diversidad genética dada por el número de patrones electroforéticos encontrados, la mayoría de los aislamientos colombianos de S. Typhimurium están relacionados genéticamente.

Al explorar la asociación entre el lugar de procedencia y el patrón electroforético se encontró que esta fue estadísticamente significativa (ji cuadrado = 193,6; p <0,001).

Este trabajo determinó la relación genética en los 468 aislamientos colombianos de S. Typhimurium, observándose que, debido al número de patrones electroforéticos encontrados, el serotipo Typhimurium presenta una considerable diversidad genética, lo que coincide con los hallazgos de otros autores que han utilizado la PFGE y describen aislamientos muy heterogéneos recuperados en una misma región (21,22). Esta diversidad, representada por los subtipos de PFGE, probablemente muestra que las infecciones proceden de diferentes fuentes (10). Así, siempre que exista una estrecha relación epidemiológica, el hallazgo de aislamientos con perfiles de PFGE indistinguibles en este serotipo podría evidenciar la relación con un brote (14).

El análisis numérico de los perfiles de macrorrestricción es de gran utilidad para evaluar las interrelaciones entre los aislamientos de S. Typhimurium y tiene aplicaciones prácticas en los estudios de vigilancia epidemiológica a corto y largo plazo (23-25). Al explorar la relación entre el lugar de procedencia y el patrón electroforético se encontró que el patrón COINJPX.X01.0062 fue predominante en los departamentos de Antioquia (53/232 &#091;22,8%&#093;) y en el Distrito Capital (24/126 &#091;19%&#093;; p <0,001). Este patrón se relacionó, además, con una alta frecuencia en el grupo de niños menores de cinco años (25,7%) y fue común en las muestras de sangre (36,5%).

La investigación espacial y temporal de los patrones de PFGE en este estudio estableció que hubo un cambio en la circulación de los patrones, pues se encontró que el genotipo COINJPX.X01.0001 fue predominante a partir de 1998 para luego ser desplazado por el genotipo COINJPX.X01.0062 en años posteriores (2002). A pesar de observarse un incremento en el número de aislamientos provenientes de Antioquia y Bogotá a partir del año 2002, podría pensarse que tal situación es resultado del muestreo que se obtuvo, pero surge entonces la pregunta de por qué el patrón COINJPX.X01.0001 desaparece cuando aparece el COINJPX.X01.0062.

El estudio de 958 aislamientos de S. Typhimurium con la PFGE permitió a Bender y col (10) confirmar diez brotes de intoxicación alimentaria que involucraban un número bajo de casos en centros institucionales, los cuales no habrían sido reconocidos sin la subtipificación molecular. En forma similar, el análisis de los perfiles de ADN por PFGE en uno de los dos brotes estudiados en Colombia demostró la relación del alimento contaminado (pollo) con cuatro aislamientos más obtenidos de muestras de pollo crudo procedentes de cuatro localidades diferentes, pero que según los datos epidemiológicos provenían de una fuente común (un mismo distribuidor). El hecho de que las muestras clínicas y las de alimentos presentaran el mismo genotipo sugiere una posible ruta de infección y demuestra que sin la subtipificación por PFGE estos aislamientos no se habrían podido relacionar epidemiológicamente.

El alto poder discriminatorio de la PFGE aplicada a los 468 aislamientos de S. Typhimurium estudiados no constituyó una sorpresa, ya que la PFGE ha sido exitosa en la subtipificación de Salmonella spp., según se informa en varios estudios (10,13,24-26). Nuestro estudio confirma que, en las regiones donde S. Typhimurium es altamente endémico, la PFGE es de gran utilidad epidemio-lógica para la caracterización y comparación de aislamientos de este serotipo, a diferencia de los métodos de vigilancia convencionales que carecen de la sensibilidad para detectar aislamien-tos relacionados con brotes de S.Typhimurium, especialmente cuando involucran un número reducido de casos con cercanía en el tiempo.

S. Typhimurium es un organismo considerable-mente diverso en comparación con el serotipo S. Enteritidis, que es altamente clonal (21,27). Por ello, la detección de aislamientos estrechamente relacionados en diferentes áreas geográficas podría ser una señal de diseminación o aparición de grupos clonales que han incrementado su virulencia (28). Este hallazgo puede confirmarse con el uso de protocolos de PFGE estandarizados y la existencia de una base de datos nacional compartida, condiciones que fortalecen a los laboratorios que cuentan con programas de vigilancia molecular.

La identificación por medio de la PFGE de un incremento de casos en un subtipo específico puede ser la indicación del comienzo de un brote. En la labor de la Red Nacional de Subtipificación Molecular de Patógenos Transmitidos por Alimentos, Swaminathan y col (14) recomiendan que una vez detectado un grupo de aislamientos genéticamente relacionados, la investigación epidemiológica debe iniciarse para determinar si hay una fuente común, facilitando así el rápido reconocimiento de brotes y la definición de los casos aislados que se agrupan en el tiempo. Cuando los patrones no están relacionados por PFGE no es necesario realizar dichas acciones (25,29).

En este trabajo, los patrones de PFGE demostraron ser estables a través del tiempo, hallazgo que sugiere que la PFGE es un método altamente confiable no solamente para la discriminación de brotes en un tiempo corto sino también para la vigilancia de la epidemiología del serotipo Typhimurium a través de períodos prolongados (10).

La identificación y control de las infecciones transmitidas por alimentos dependen del rápido diagnóstico microbiológico y de la subtipificación molecular para identificar el agente causal. Se requiere de esfuerzos continuos para incrementar el número de aislamientos remitidos por los laboratorios de salud pública al Laboratorio Nacional de Referencia del INS con el fin de que el estudio molecular de Salmonella spp. sea de rutina y refleje la situación real de la vigilancia molecular de este importante enteropatógeno en el país.

Agradecemos a la Red Nacional de Laboratorios participantes en el Programa de Vigilancia de la Enfermedad Diarreica Aguda por el esfuerzo continuo para la recuperación de los aislamientos y reconocemos con gratitud el aporte de sus conocimientos a Jean Wichard (CDC, Atlanta) y a Elkin Hernández.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Financiación

Este estudio fue financiado por el Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología, Francisco José de Caldas, Colciencias, código 2104-04-12679.

Correspondencia:

Nélida Muñoz, Grupo de Microbiología, Instituto Nacional de Salud, Avenida calle 26 # 51-60 zona 6 CAN, Bogotá, D. C., Colombia.

Teléfono: 2207700 extensión 445

Fax: (+571) 2207700-446

Recibido: 28/04/06; aceptado: 03/08/06

Referencias