Evaluación de la prueba rápida inmunocromatográfica Binax NOW® ICT Pf/Pv para el diagnóstico del paludismo en un área endémica de Colombia

Adriana Pabón, Gonzalo Álvarez, Jorge Yánez, Carlos Céspedes, Yensa Rodríguez, Ángela Restrepo, Silvia Blair

Grupo Malaria, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia

Recibido: 05/09/06; aceptado: 06/03/07

Introducción. Una de las estrategias para disminuir la morbimortalidad por paludismo es realizar un diagnóstico temprano mediante pruebas rápidas de baja complejidad técnica, altamente sensibles y específicas, que puedan ser realizadas e interpretadas por personas de la misma comunidad, garantizando un tratamiento antipalúdico adecuado y oportuno.

Objetivo. Determinar la sensibilidad y especificidad de la prueba inmunocromatográfica Binax NOW® malaria ICT P.f/P.v para el diagnóstico rápido de paludismo en Turbo, Antioquia.

Materiales y métodos. Se incluyeron 171 pacientes distribuidos en dos grupos: el primero "pruebas simultáneas", 118 pacientes con síndrome febril agudo compatible con paludismo a los cuales se les aplicó ICT Pf/Pv y gota gruesa simultáneamente. El segundo "pruebas secuenciales", 53 pacientes con diagnóstico positivo por gota gruesa quienes se estudiaron para diagnóstico confirmatorio y seguimiento parasitológico los días 4 y 7 con ICT.

Resultados. La sensibilidad y la especificidad de la prueba Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv para diagnosticar infecciones por Plasmodium falciparum fueron 54,2% (IC95%: 52%-53,4%) y 93,6% (IC95%: 93,1%-94,2%), respectivamente, mientras que para Plasmodium vivax fueron 80% (IC95%: 77,9%-82,1%) y 100% (IC95%: 99,5%-100%); hubo disminución de la sensibilidad hasta 21,4% para P. falciparum y 33,3% para P. vivax con parasitemias menores de 500 parásitos/ul. En cuanto al diagnóstico confirmatorio, la prueba ICT Pf/Pv presentó una sensibilidad global de 71,6% con 20,7% de falsos positivos y 5,6% de falsos negativos. En el seguimiento, ICT mostró 36% y 34% de falsos positivos para los días 4 y 7, respectivamente.

Introduction. One of the strategies to reduce malarial morbidity and mortality is to make an early diagnosis, using simple rapid tests which are highly sensitive and specific. Furthermore, the tests must be easy to perform and understand by local people in such a way that a suitable and prompt antimalarial treatment is guaranteed.

Objective. The sensitivity and specificity was determined for the immuno-chromographic malaria dipstick (ICT Pf/Pv) test for the rapid diagnosis of malaria in Turbo, Antioquia.

Materials and methods. The sample consisted of 171 patients distributed into two groups: the first group was 118 patients with acute febrile syndrome compatible with malaria to which ICT Pf/Pv and thick smears were applied simultaneously; a second group was 53 patients with positive diagnosis by thick smear, with follow-up on the 4th and 7th days after beginning treatment.

Results. Sensitivity and specificity of the ICT Pf/Pv test for Plasmodium falciparum infections were 54.2% (95%CI: 52.0-53.4%) and 93.6% (95%CI: 93.1-94.2%), respectively. In addition, for Plasmodium vivax the sensitivity and specificity were 80% (95%CI: 77.9-82.1%) and 100% (95%CI: 99.5-100%); there was a 21.4% loss of sensitivity for P. falciparum 21.4% and a 33% loss for P. vivax malaria with parasitaemias under 500 parasites/ul. For the confirmatory test, ICT Pf/Pv showed a global sensitivity of 71.6% with 20.7% false positive and 5.6% false negative results. During follow-up, ICT showed 36% and 34% false positive results for day 4 and 7, respectively.

Conclusions. The ICT Pf/Pv test has a poor sensitivity for P. falciparum malaria and its capacity to detect parasitemias under 500 parasites/ul is minimal. As a confirmatory test, the ICT Pf/Pv has a good sensitivity for P. falciparum. Its use for patient follow-up is not recommended.

Key words: malaria/diagnosis, sensitivity and specificity, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax.

En vista del fracaso de los planes de erradicación del paludismo llevados a cabo entre 1958 y 1968, la Organización Mundial de Salud, OMS, ha priorizado la búsqueda de estrategias de control tales como "Hacer retroceder la malaria"; para ello ha diseñado objetivos a corto y largo plazo. Una de estas estrategias es realizar un diagnóstico temprano mediante pruebas rápidas que sean prácticas, fáciles de realizar, accesibles, económicas y muy sensibles y específicas (1-4).

Según la OMS, el paludismo es una de las principales causas de morbimortalidad en regiones tropicales y subtropicales del mundo y es una de las enfermedades infecciosas de mayor importancia en Colombia, dado que 70% de la población está expuesta a ella. Según el Informe Epidemiológico Nacional, en Colombia durante el 2005 se presentaron 107.866 casos de paludismo en 22’403.000 personas expuestas, de los cuales, el 65% (70.066) fueron por Plasmodium vivax, 33,5% (36.190) por Plasmodium falciparum y 1,5% (1.610) como malaria mixta (5).

Sin embargo, por ser una prueba que depende del operador, en ocasiones, la gota gruesa no detecta parasitemias bajas (entre 50-500 parásitos/µl) (7). Estos casos de paludismo que se reportan como negativos retrasan el tratamiento, y contribuyen a la presentación de complicaciones y al aumento de la mortalidad. En zonas rurales que carecen de recursos como microscopios, personal experto e infraestructura eléctrica, se limita su uso. Por lo anterior, se han estimulado investigaciones para el desarrollo de pruebas rápidas de diagnóstico que detecten antígenos de Plasmodium spp.

A mediados de los años 90 se desarrollaron las pruebas rápidas de diagnóstico, que consisten en la detección de antígenos específicos expresados por los parásitos del paludismo presentes en individuos infectados, mediante la captura con anticuerpos. Algunas pruebas rápidas pueden detectar solamente una especie (P. falciparum o P. vivax), otras detectan la presencia sólo del género Plasmodium (8-10).

Estos métodos suscitaron el interés porque prometían un diagnóstico rápido, fácil, oportuno, accesible, que potencialmente podría ser utilizado en regiones rurales endémicas de paludismo, carentes de servicios de salud y de infraestructura para el diagnóstico de malaria con gota gruesa.

La primera generación de pruebas rápidas se concentró en diseñar pruebas para la detección de infecciones por P. falciparum, como ParaSight-F®, que se basa en la detección de la proteína rica en histidina II (HRP II). Varios estudios han reportado una sensibilidad entre 61% y 95,1% y una especificidad entre 81,1% y 100% (11,12). Esta prueba no ha sido recomendada para uso diagnóstico, puesto que no permite la detección de infecciones por P. vivax y es inútil su aplicación en zonas endémicas donde predomina esta especie parasitaria (13).

Posteriormente, se desarrolló la prueba ICT Pf, también conocida como MalaQuick®, que utiliza un anticuerpo monoclonal para detectar el antígeno HRP II y diagnosticar las infecciones por P. falciparum (14).

Luego se desarrollaron las pruebas de diagnóstico rápido de segunda generación, capaces de detectar además las infecciones por P. vivax, como OptiMAL®, que se basa en la detección de la proteína lactato deshidrogenasa específica de especie. Ella ha mostrado que su valor diagnóstico varía, con valores de sensibilidad para P. falciparum entre 40,0% y 98,1% y de especificidad entre 96% y 99,7% (15-18) y para P. vivax sensibilidad entre 60% y 97% y la especificidad entre 89% y 100% (7,15-18), mostrando resultados contradictorios en cuanto a su posible utilización. La prueba ha mostrado una baja sensibilidad (44%) cuando la parasitemia es menor de 500 parásitos/µl (7).

Una de las técnicas más recientes de diagnóstico rápido es la prueba inmunocromatográfica de sangre total (ICT P. falciparum/P. vivax) Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv, la cual se basa en la detección de los antígenos HRP-II y panmalárico (15). Estos dos son capturados por anticuerpos monoclonales de tipo IgM; la HRP-II es una proteína que se expresa en la membrana del eritrocito infectado con P. falciparum y se libera a partir de las formas asexuales y de los gametocitos jóvenes (19) y el antígeno panmalárico o aldolasa específica de parásito, es producido por las cuatro especies del Plasmodium que infectan al hombre (P. vivax, P. falciparum, P. ovale y P. malarie) (20).

Para evaluar la capacidad diagnóstica de la prueba ICT Pf/Pv, se han llevado a cabo varios estudios en los que se informa una sensibilidad de 81% a 97,5% y una especificidad de 81% a 99,2% para P. falciparum y una sensibilidad de 44% a 100% y una especificidad de 94,8% a 100% para P. vivax (7,15,21,22, Mendoza NM, García M, Vela CM, Erazo R, Pérez P, Cortés LJ. Evaluación de dos pruebas rápidas ICT Pf/Pv y OptiMal para el diagnóstico de malaria en Tumaco, Colombia. Resúmenes XI Congreso Colombiano de Parasitología y Medicina Tropical. Biomédica 2003:23 (Supl.1):140). Al igual que con las otras pruebas, varios estudios han reportado que la sensibilidad disminuye acentuadamente, hasta 23%, cuando la parasitemia está por debajo de 500/µl (7).

Una de las aplicaciones que se le ha atribuido a la prueba ICT Pf/pv, es la detección de antígenos del parásito cuando hay un secuestro del mismo, que dificulta su diagnóstico en sangre periférica; por ejemplo, en el caso de secuestro de parásitos en la placenta de mujeres embarazadas (23,24).

Por otra parte, se han reportado falsos negativos en altas parasitemias debido al fenómeno prozona por la gran antigenemia (26,27) o por la ausencia del gen que codifica para la proteína HRP –II en un 2% a 3 % de los parásitos de la malaria (16).

Teniendo en cuenta los pocos estudios en Colombia para evaluar la capacidad diagnóstica de la técnica Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv en paludismo, se determinó la sensibilidad, la especificidad y la capacidad confirmatoria de la prueba inmunocromatografica ICT Pf/Pv para el diagnóstico rápido de paludismo en Turbo, Antioquia, zona endémica para paludismo, durante un periodo no epidémico de 2003.

Descriptivo de evaluación de una prueba diagnóstica.

Turbo, Antioquia, municipio localizado en la zona del Urabá antioqueño el cual presentó en el año 2003, 4.057 casos de paludismo, de los cuales, 1.120 casos fueron por P. falciparum y 2.937 por P. vivax. Este municipio registró un índice parasitario anual (IPA) para ese año de 27,11 por 1.000 (28,29). La investigación se hizo durante un periodo no epidémico, entre los meses de junio y julio de 2003.

Conformada por los pacientes que asistieron por su propia iniciativa al puesto de diagnóstico de paludismo de los centros de salud San José, El Dos y Currulao, o al hospital Francisco Valderrama. Fueron pacientes ambulatorios, sin complicaciones, de uno u otro sexo, de uno o más años de edad, residentes en el municipio de Turbo, Antioquia, en la zona urbana o rural.

Los pacientes incluidos se dividieron en dos grupos independientes:

Grupo 1. Pruebas simultáneas o grupo de tamizaje: conformado por pacientes que consultaron a los centros de salud por fiebre o antecedentes de fiebre en las 48 horas previas al momento de la consulta, a quienes se les realizó el examen por gota gruesa y Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv de forma simultánea para evaluar la capacidad diagnóstica de la prueba.

Grupo 2. Pruebas en secuencia o grupo para diagnóstico confirmatorio: conformado por pacientes a quienes se les aplicó un diseño secuencial. Tuvieron inicialmente un diagnóstico positivo para malaria por gota gruesa y se les aplicó el mismo día la prueba ICT Pf/Pv. También se utilizó esta prueba rápida los días 4 y 7 para evaluar su utilidad en estudios de seguimiento de la respuesta terapéutica. Todos los pacientes palúdicos fueron tratados por el personal de salud del Hospital de Turbo de acuerdo con el resultado de la gota gruesa y conforme a las disposiciones del Ministerio de Salud de Colombia.

Los aspectos éticos de este estudio se rigieron bajo las "Normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud", resolución No. 008430 de 1993. El proyecto fue sometido a evaluación y aprobado por parte del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia (comunicación CIM, agosto 2003). A cada paciente que aceptó participar se le informó del estudio, sus objetivos, riesgos y beneficios. Una vez aceptada su participación (o la de su hijo), se obtuvo la firma del consentimiento informado que cumplía con los requisitos establecidos por el Comité de Ética de la Universidad de Antioquia.

Gota gruesa: la gota gruesa fue utilizada como prueba estándar de referencia; ésta se obtuvo por la punción capilar de un dedo de la mano o del talón. Luego de realizar la antisepsia respectiva, se descartó la primera gota de sangre y las siguientes se utilizaron para el examen de la gota gruesa, el extendido de sangre periférica y la prueba ICT Pf/Pv.

La tinción de la gota gruesa se hizo con la coloración de Field y la lectura se llevó a cabo en microscopio de luz con objetivo de de 100X. La parasitemia se calculó con base en 200 leucocitos y un estándar de 8.000 leucocitos/µl y se expresó en parásitos/µl (30). En este estudio, el examen de gota gruesa se consideró positivo si se observaron formas asexuales del parásito acompañadas o no de gametocitos y se consideró como negativo cuando sólo había formas sexuales de P. falciparum o no se observó ninguna forma asexual en mínimo 200 campos microscópicos (22,30). La lectura de la gota gruesa la realizó un bacteriólogo experto en diagnóstico de paludismo en forma ciega, es decir, sin conocimiento de los resultados obtenidos en la prueba ICT Pf/Pv.

Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv: para la realización de la prueba rápida se siguieron las indicaciones del fabricante. En resumen, se tomaron 15 µl de sangre capilar y se impregnaron en la almohadilla violeta de la tirilla; se aplicaron dos gotas de reactivo A en la almohadilla blanca inmediatamente por debajo del lugar de aplicación de la sangre; posteriormente, se aplicaron cuatro gotas del mismo reactivo A en la almohadilla de la parte superior izquierda de la tarjeta de prueba; se esperó hasta que la sangre recorriera toda la tirilla; luego de esto, se cerró la tarjeta de prueba y se dejó en posición horizontal sobre una superficie plana durante 10 minutos e inmediatamente se realizó la lectura de la prueba. Las pruebas Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv procedían del lote 011590 referencia 660000.

Para la interpretación, se tuvieron en cuenta las siguientes definiciones:

verdaderos positivos, son los resultados que fueron positivos en la gota gruesa para P. falciparum o P. vivax y positivos para igual especie por ICT Pf/Pv;

verdaderos negativos, son los resultados negativos para paludismo por gota gruesa y con prueba ICT Pf/Pv, en los que sólo se visualizó la línea de control;

falsos positivos, se presentaron cuando la gota gruesa fue negativa y la prueba ICT Pf/Pv fue positiva para cualquier especie o cuando la gota gruesa detectó P. vivax y por ICT Pf/Pv se detectó P. falciparum, o viceversa;

falsos negativos, se presentaron cuando la gota gruesa fue positiva para cualquier especie y con el ICT Pf/Pv sólo se visualizó la línea de control.

Para el manejo de la información se utilizó el programa EpiInfo versión 6.04. Se creó una base de datos con toda la información contenida en la encuesta. Los resultados de la evaluación diagnóstica (sensibilidad, especificidad, valores de predicción positivos y negativos) se expresaron en porcentaje y fueron calculados con el programa EPIDAT Versión 3.0.

Se evaluaron 171 pacientes distribuidos en los dos grupos: 118 en el grupo de pruebas simultáneas y 53 pacientes en el estudio de pruebas secuenciales. El 51% fueron hombres, la edad promedio fue 22,7±16,5 años, 75% residían en la zona rural y el tiempo promedio de residencia en la zona fue de 10,2±13,1 años. El 31% de los pacientes presentaron, como mínimo, un episodio de malaria en los 12 meses anteriores.

Grupo 1. Pruebas simultáneas: a 118 pacientes se les aplicó de manera simultánea el examen de gota gruesa y la prueba ICT Pf/Pv. Antes de la realización del estudio, no se hizo un cálculo del tamaño de muestra para evaluar la prueba diagnóstica. Al calcular el tamaño de la muestra post hoc, con una sensibilidad de 73,5%, una prevalencia del 41,5%, una precisión absoluta del 12% y un nivel de confianza del 95%, arrojó un tamaño de muestra de 125 individuos de los cuales 73 debían ser sanos y 52 enfermos. Este número es similar al evaluado en este estudio.

La parasitemia media en todo el grupo fue de 4.391±8.550 parásitos/µl de sangre. Para las infecciones por P. falciparum el promedio de parasitemia fue de 3.476±7438 anillos/µl y para P. vivax de 5.270±9568 parásitos/µl. De los 49 casos positivos detectados por gota gruesa, la prueba ICT Pf/Pv no detectó 13, de los cuales, dos fueron positivos para P. vivax, con una parasitemia de 332±28 parásitos/µl, y 11 fueron positivos para P. falciparum, con una parasitemia de 60±37 anillos/µl.

Grupo 2. Pruebas secuenciales: de los 53 casos positivos por gota gruesa, la prueba rápida mostró que fueron positivos 27 (50,9%) para P. vivax y 23 (43,4%) para P. falciparum, y 3 (5,7%) fueron negativos. Como diagnóstico confirmatorio, la prueba ICT tuvo una sensibilidad total de 71,6%; para P. falciparum la sensibilidad fue de 95% y para P. vivax fue de 76%.

En el presente estudio, se encontró que la prueba Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv posee en forma global una sensibilidad y una especificidad para diagnosticar paludismo de 73,4% (IC 95%: 72,7%-74,5%) y 95,7% (IC95%: 94,9%-96,4%), respectivamente. Por especie, la prueba Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv mostró para P. falciparum una sensibilidad de 54,2% (IC95%: 51,9%-56,3%) y una especificidad de 93,6 (IC95%: 93,1%-94,2%), mientras que para P. vivax la sensibilidad fue de 80% (IC95%: 77,9%-82,1%) y la especificidad de 100% (IC95%: 99,5%-100%). Con parasitemias menores de 500 parásitos/µl, la prueba Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv mostró una sensibilidad de 21,4 % para P. falciparum y de 33% para P. vivax. Cuando la prueba Binax NOW® malaria ICT P.f/P.v se utilizó para un diagnóstico confirmatorio, presentó una sensibilidad global de 71,6% con 20,7% de falsos positivos y 5,6% falsos de falsos negativos. En el seguimiento, la ICT mostró 36% y 34% de falsos positivos para los días 4 y 7 de seguimiento, respectivamente.

En este estudio, los resultados obtenidos después de la aplicación de la prueba Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv se consideran válidos, ya que en todas las muestras se visualizó correctamente la línea de control, lo que garantiza que las condiciones ambientales y de almacenamiento no alteraron su desempeño.

En Colombia, en el municipio de Tumaco (Costa Pacífica colombiana), Mendoza y colaboradores, en el 2002, evaluaron la capacidad diagnóstica de la prueba ICT Pf/Pv y encontraron una sensibilidad y una especificidad para malaria por P. falciparum de 98,2% y 98,1% y, para P. vivax, una sensibilidad y una especificidad de 100%. Además, encontraron buena concordancia en el diagnóstico de malaria al compararlo con la gota gruesa (Mendoza NM, García M, Vela CM, Erazo R, Pérez P, Cortés LJ. Evaluación de dos pruebas rápidas ICT P.f./P.v. y OptiMal para el diagnóstico de malaria en Tumaco, Colombia. Resúmenes XI Congreso Colombiano de Parasitología y Medicina Tropical. Biomédica 2003:23 (Supl.1):140). Estos resultados no concuerdan con los obtenidos por nosotros, ya que la sensibilidad y la especificidad mostradas por la prueba ICT fueron menores en nuestro estudio, pero están dentro de los rangos encontrados por otros autores en estudios realizados en regiones holoendémicas, sin epidemias (7,15,20,21). Es sabido que el número de casos de una enfermedad influencia los valores de predicción positivo y negativo (31). Además, en nuestro estudio consideramos como resultados falsos positivos los provenientes de pacientes que sólo tuvieran formas sexuales de P. falciparum, ya que la presencia de gametocitos de P. falciparum no indica enfermedad malárica (22,26).

En este estudio, el 51% de los positivos por gota gruesa tenían parasitemias mayores a 1.000 parásitos/µl y, en este caso, la sensibilidad que mostró la prueba Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv fue de alrededor de 100%, lo cual sugiere que, si la mayor parte de los pacientes con malaria en una región endémica se ubican en este rango de parasitemia, la prueba tendrá un buen porcentaje de acierto al descartar o confirmar la infección malárica; sin embargo, con parasitemias menores a 500 parásitos/µl, la sensibilidad (34%) disminuyó significativamente, lo cual plantea la necesidad de conocer las parasitemias que alcanzan los pacientes de la región donde se contemple el uso de esta prueba. Los 13 valores falsos negativos de la prueba Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv en el grupo 1 (11 para P. falciparum y 2 para P. vivax) se encontraron en pacientes que presentaron parasitemias bajas (40 a 564 parásitos/µl). Esto se puede explicar por la baja cantidad de antígeno circulante que tendría el paciente. De igual forma, como se ha reportado en otros estudios, se encontró que la sensibilidad disminuye cuando las parasitemias son bajas (2,8).

Los casos falsos positivos detectados en la pruebas ICT Pf/Pv se puede atribuir a que la prueba no sólo detecta antígenos que son liberados por las formas asexuales, sino también, por las formas sexuales del parásito que causan la enfermedad (13). Sería ideal que existiera una prueba rápida de diagnóstico basada únicamente en la detección de antígenos que fueran liberados sólo por las formas asexuales del parásito, ya que de esta manera los casos falsos positivos explicados por la presencia únicamente de formas sexuales podrían evitarse. Sin embargo, también es posible que los valores falsos positivos se deban a la presencia de bajas parasitemias que, en algunas ocasiones, no son detectadas por la gota gruesa. En este sentido sería muy importante repetir la gota gruesa después de uno o dos días, que puedan indicar si se presenta la infección malárica o no (32).

La incidencia de infección mixta parece ser importante en el total de casos de malaria. En este caso, la prueba ICT Pf/Pv presentó confusión entre el diagnóstico de especies, pues no diferencia infecciones mixtas de infecciones por P. falciparum y, según lo observado, tampoco de P. vivax. Solamente se puede indicar su posible presencia, hecho que puede alterar la forma del tratamiento antimalárico. Sería ideal el desarrollo de pruebas que detecten antígenos específicos de cada especie y así lograr una adecuada distinción entre estas especies, de forma que se pueda optimizar el diagnóstico y por consiguiente el tratamiento.

En resumen, se encontró que la prueba Binax® ICT Pf/Pv no posee una gran sensibilidad y especificidad global para el diagnóstico de malaria de forma rutinaria. Sin embargo, podría ser de utilidad cuano no se pueda acceder al diagnóstico microscópico. Para diagnóstico confirmatorio y de seguimiento, no podría utilizarse la prueba Binax NOW® malaria ICT Pf/Pv.

Los autores agradecen a los pacientes y al personal del Hospital Francisco Valderrama de Turbo, Antioquia, por su gran colaboración; a la bacterióloga Alexandra Ríos y al médico Juan Gabriel Piñeros por su incondicional ayuda durante el trabajo de campo. Los autores también desean agradecer al profesor Jaime Carmona por la revisión del manuscrito.

Los autores no tienen ningún nexo con las entidades comerciales que venden o distribuyen las pruebas para diagnóstico rápido de paludismo. No tienen conflicto de interés ni compromiso alguno con estas entidades.

El Grupo de Malaria financió el presente trabajo con recursos para el sostenimiento asignados por la Universidad de Antioquia.

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