Artículo original / ORIGINAL ARTICLE
Biomarcadores genéticos de los sistemas MHC/HLA-DRB1* y PTPN22 asociados a enfermedad reumática: artritis idiopática juvenil y artritis reumatoide de instalación temprana. Un enfoque analítico en un estudio piloto
Genetics Biomarckers off the MHC/HLA-DRB1* and PTPN 22 Systems Associated to Rheumatics diseases: idiopatic juvenile arthritis and rheumatoid of early installation. A descriptive approach in a pilot study
Gloria Garavito1, Anderson Díaz1, Clara Malagón2, Antonio Iglesias3, Edgar Navarro4, Eduardo Egea1
Correspondencia: Gloria Garavito, División Ciencias de la salud, Laboratorio de Inmunología y Biología Molecular, Universidad del Norte. Km 5 vía a Puerto Colombia, Barranquilla (Colombia). Teléfono: 3509486, Fax; 3598852. ggaravit@uninorte.edu.co
Fecha de recepción: 10 de abril de 2013
Fecha de aceptación: 9 de junio de 2013
Resumen
Objetivos: Identificar biomarcadores de susceptibilidad para AIJ poliarticular y AR de instalación temprana por estudio del polimorfismos de MHC/HLA-DRB1* y PTPN22.
]]> Materiales y métodos: Se realizó un estudio de casos y controles con una relación 1:2. Todos los sujetos de investigación y los controles provinieron de una corta anidada perteneciente a un proyecto institucional; 30 pacientes con AIJ y 30 con AR de instalación temprana. Como controles se estudiaron 60 individuos sanos. El ADN se obtuvo por salting out modificado. La tipificación de los alelos MHC/DRB1* se realizó por PCR-SSP y en el polimorfismo (C1858T) del sistema PTPN22 se utilizó PCR-RTq.Resultados: Para AIJ Poliarticular, el alelo DRB1*0404 se asoció con susceptibilidad (OR=10.82; p<0.05), en el grupo con AR de instalación temprana, DRB1*0101 se mostró como marcador de susceptibilidad (OR=4.04; p<0.05). Se destaca que el alelo HLA-DRB1*0701 aparece como marcador protector para ambas patologías (OR=0,15; p<0,05). El polimorfismo del SNP (C1858T) PTPN22 no se asoció con AIJ Poliarticular. En contraste, en AR de instalación temprana, el Alelo CC se asoció con protección p<0.05. En el mismo grupo, CT/TT se mostró como un marcador de susceptibilidad <0.05. El análisis de la secuencia aminoacídica 70QRRAA74 del epítope compartido se asoció con susceptibilidad para ambas entidades (p<0.05) y la secuencia 70DRRGQ74 con protección en ambos grupos de pacientes (p<0.05).
Conclusión: Se destaca que en la asociación con la secuencia del epítope compartido, la ubicación del tipo de aminoácido y posición del mismo define probable asociación como marcador molecular de susceptibilidad en ambas entidades. Los polimorfismos compartidos sugieren un origen genético común para ambas entidades.
Palabras clave: Artritis idiopàtica juvenil poliarticular (AIJ), artritis reumatoide (AR) de instalación temprana, PTPN22, HLA-DRB1, polimorfismos, alelos, epítope compartido (SE).
Abstract
Objectives: To identify polymorphisms of MHCIHLA-DRB1* and PTPN22 systems as a genetic biomarker of susceptibility to JIA poliarticular and early installation RA. Material and methods; This was a pilot case control study with a relation of 1:2. Patients and control individuals involved in this study were selected from a nested cohort from an institutional previous RAIJIA project. The sample was represented by thirty patients with JIA and 30 diagnosed with early installation RA. Sixty unrelated healthy individuals were involved as a control DNA Isolation was obtained by a modified salting out technique. The oligotyping of the MHCIDRB1* alleles was performed by PCR-SSP and the typing of the PTPN22 polymorphism was done by RT-PCR.
Results: The DRB1*0404 allele was associated with susceptibility to JIA(OR=10.82, P<0.05). In the early installation RA group the DRB1*0101 allele was showed as a marker of susceptibility to JIA patients (OR=4.04, P<0.05). It is noteworthy that the HLA-DRB1*0701 appears as a possible protective marker for both diseases (OR=015, p<0.05). The polymorphism of (C1858T)PTPN22 was not associated with poliarticular JIA. In contrast, in the early installation RA group of patients, the CC PTPN22 polymorphism was found to be as a protective marker (p<0.05). On the other hand, the amino acid sequence 70QRRAA74 of the share epitope was a marker for susceptibility to both entities (p<0.05) By contrast, the sequence 70DRRGQ74 of the same epitope was showed as a possible marker for protection on both entities (p<0.05.).
Conclusion: The model that was used for searching association between the shared epitope -region 70-74 of the DRB1* alleles and these two entities showed the importance of the location and also the type of amino acid in those positions. The polymorphisms found as molecular markers of susceptibility for both entities suggested a common origin and could suggest its probable roll as a molecular marker of susceptibility.
Keywords: juvenile idiopathic arthritis (JIA), poliarticular, early installation reumatoid arthritis, PTPN22, HLA-DRB1, polymorphisms, alleles, shared epitope(SE).
Introducción
]]> diferencia de artritis reumatoide del adulto (AR). AIJ presenta variantes clínicas, lo que la hace más interesante para estudiar desde el punto de vista genético (fenotipos y endofenotipos) (2). Por definición, el inicio de esta última ocurre antes de los 16 años de edad y está clasificada en diferentes grupos clínicos bajo criterios de EULAR: AIJ oligoarticular, AIJ.Las enfermedades autoinmunes afectan aproximadamente entre el 5 al 10 % de la población mundial. Entre las más frecuentes se destacan artritis idiopática juvenil (AIJ) en población pediátrica y artritis reumatoide en el adulto (1). En la práctica reumatológica pediátrica, AIJ es la entidad menos estudiada inmunogenéticamente, a Poliarticular y AIJ sistémica (3, 4). El diagnóstico es básicamente clínico. El Colegio Americano de Reumatología estableció en 1977 criterios diagnósticos para artritis reumatoide. Esta es una enfermedad autoin-mune inflamatoria y sistémica, cuya causa aún no ha sido precisada. Varios factores son importantes en su patogenia, entre ellos los genéticos, y en particular aquellos asociados con los sistema MHC y PTPN22 (5).
La patogénesis de la enfermedad puede determinarse por alteraciones a nivel del complejo trimolecular, constituido por un antígeno putativo, el receptor de linfocitos T (TcR) y el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC). La carga genética se ve influenciada por la interacción de numerosos sistemas genéticos, como son los genes de los sistemas PTPN22 (C1858T) y MHC/ DRB1*(6). La existencia de regiones cromosómicas asociadas a numerosas enfermedades autoinmunitarias con expresión genética similares entre ellas deja entrever la existencia de factores genéticos comunes en el desarrollo de estados de autoinmunidad. En los últimos años se han producido grandes avances en el conocimiento de estos posibles marcadores genéticos, entre ellos el gen PTPN22, el cual es un importante regulador de la respuesta de los linfocitos. La existencia de marcadores genéticos asociadas a enfermedades autoinmunes con expresión genética similares entre ellas permite suponer la existencia de factores genéticos comunes con los mecanismos de autoinmunidad en estas entidades (6).
Varios genes han sido implicados en las enfermedades autoinmunes, resultantes de estudios en familia en los que se ha observado un alto grado de segregación, mostrando patrones de expresión similares mas no idénticos para AIJ y AR (7).
Está bien establecida la asociación en diferentes grupos étnicos del polimorfismo del exón DRB1*04 con susceptibilidad en AR y AIJ. En familias se ha demostrada la segregación de los haplotipos que contienen el DR4, lo cual confiere un riesgo relativo de 4.6 para AR. En algunos grupos étnicos, como en indios, paquistaníes e israelitas, la asociación no es con el DR4, sino con el DR1, DR6 o DR10, lo mismo que en los caucásicos, africanos u orientales (8,10). Es evidente que ciertos subtipos del exón DRB1, *0401, *0404, *0405, *0408, condicionan la susceptibilidad para AR en caucásicos y que los alelos parecen conferir protección. Estos datos indican que la variación estructural en ciertos sitios de la cadena DRB1 y sus efectos en el reconocimiento de los linfocitos T están muy relacionados con la inmunopatogenia en AR. Se predice que ciertos aminoácidos ubicados en la tercera región hipervariable del primer dominio DRB1 interactúan con el péptido que se une al nicho del antígeno clase II y con el TCR (8, 12, 13).
Desde el informe de Stastny se han reportado varios alelos MHC/DRB1* asociados a esta entidad, los cuales comparten la secuencia aminoacídica 70-74 de la cadena beta en la molécula HLA-DR, tales como (70QRRAA74, 70RRRAA74, 70QKRAA74). Esta región se ha denominado epítope compartido, el cual se encuentra dentro de la fosa de anclaje al péptido, y está involucrado directamente en la presentación antigénica, lo cual sugiere un mecanismo que explicaría la susceptibilidad a la enfermedad (14).
Algunos estudios han demostrado en poblaciones del Caribe, africana, europea y anglosajona alelos que siguieren protección a la enfermedad. Estos datos también se presentan en población de China y japonesa (2, 8, 15, 17, 18).
Con relación al sistema PTPN22 se ha descrito la asociación entre el alelo C1858T PTPN22 con AR (susceptibilidad). Este alelo se comporta como un factor de riesgo en aproximadamente el 28% de los pacientes con AR. Este alelo posee una región rica en prolina (P1), la cual es importante para la interacción con proteínas cinasas CSK, enzima importante en la diferenciación y función de los linfocitos T (5, 11). La mayoría de estos estudios han sido llevados a cabo con pacientes caucásicos y anglosajones. Muy pocos son los trabajos realizados en grupos multiétnicos y ninguno en la población del Caribe colombiano (7, 12, 18, 19).
Estudios de secuenciación de estos alelos, en las muestras de pacientes caucasoides que sufren de AR y AIJ poliarticular, han revelado un incremento en la expresión de las frecuencias de los alelos DR|31*0401 y *0404 para ambas entidades. Igual hallazgo se encontró para el alelo DR|31* 0405 en pacientes japoneses. Lo anterior permite soportar el concepto de que AIJ poliarticular está estrechamente asociado, desde el punto de vista genético, con AR en el adulto. De otra parte, desde el punto de vista clínico, el cuadro sindromático y varios marcadores serológicos de autoinmunidad son muy similares. Es importante resaltar que en la literatura se han informado, tanto por nosotros como por otros grupos, secuencias del epítope compartido similares entre ambas enfermedades (8, 12, 19-22).
En los últimos años se han descrito asociaciones de genes comunes como el SNP Funcional PTPN22 (C1858T), el MHC/ HLA DRB1* y de DQB1*con AR y AIJ, además de otros genes, tales como PDCD1, FCRL3, SUMO4, CD25, PADI4 y SLC22A4 (5, 18, 23-26).
]]> En lo que respecta al sistema PTPN22, la literatura muestra varios informes que asocian polimorfismos de este sistema como factor de riesgo para el desarrollo de múltiples enfermedades autoinmunes (27). Este gen ha sido señalado como un factor de riesgo implicado en la producción de autoanticuerpos, ya que las enfermedades autoinmunes con las que muestra asociación son aquellas en las que los anticuerpos son sumamente importantes en su fisiopatología.Algunos estudios mencionan una posible interacción del gen PTPN22 (C1858T) con el MHC/HLA-DRB1* y de estos con el medio ambiente como características dominantes comunes en el desarrollo de la artritis reumatoide y artritis idiopática juvenil poliarticular (30, 31). Aproximadamente un 42 % de la susceptibilidad para la presencia de AR corresponde a un componente genético con un mayor porcentaje del Sistema MHC/ HLA-DRB1, el gen donde el PTPN22 se ha
encontrado mayormente asociado con susceptibilidad en poblaciones ancestrales del norte de Europa, con un riesgo atribuible de aproximadamente del 8 % (29-33). El gen PTPN22 codifica la fosfatasa linfoide de la tirosina, la cual es una proteína con una función potencial en regulación de umbrales para activación de los linfocitos B y T, de ahí la hipótesis de una posible interacción entre ellas (32-36).
Se ha propuesto que el polimorfismo PTPN22 (C1858T) está asociado con susceptibilidad por una falta de supresión para las células de T autorreactivas, lo cual predispone a autoinmunidad. La variación en el gen podría, por lo tanto, predisponer a AR, creando un ambiente permisivo para una alteración de la inmunomodulación y una respuesta hacia las propias proteínas (37).
El objetivo de este estudio fue identificar polimorfismos de los sistemas genéticos MHC/HLA-DRB1* y PTPN22 (SNP's C1858T) en una muestra que incluyó dos grupos de pacientes colombianos que sufren de AIJ poliarticular y AR de instalación temprana con el propósito de asociarlos como marcadores de susceptibilidad para desarrollar artritis idiopática juvenil poli articular y artritis reumatoide de instalación temprana.
Materiales y métodos
Este fue un estudio analítico de corte transversal de casos y controles con una relación 1:2. Cada uno de los sujetos en el estudio firmó el consentimiento informado, previamente aprobado por el Comité de Bioética de la Fundación Universitaria del Norte.
Pacientes
Se involucraron dos grupos de estudio: 30 muestras de pacientes con artritis idiopática juvenil (AIJ) poliarticular y 30 de pacientes con artritis reumatoide de instalación temprana. Las muestras se tomaron al azar usando un número impar y provinieron de una cohorte anidada previamente constituida en la ciudad de Barranquilla, del proyecto de Colciencias referenciado: 1215-343-19299. El principal criterio de inclusión fue cumplir con los criterios diagnósticos para AIJ poliarticular y AR de instalación definidos por la ACR y ILAR (38-40).
Controles
]]> El grupo control estuvo representado por 60 sujetos, clínicamente normales, no relacionados familiarmente con los pacientes con (AIJ) poliarticular o AR de instalación temprana, provenientes de la misma corte, que no tenían antecedentes de enfermedad autoinmunes personales o familiares de alérgicas. Además se tuvo en cuenta la edad, el género y condiciones sociodemográficas cotejadas con los pacientes.Identificación de los alelos MHC/ DRB1*
El ADN de los pacientes y los controles se aisló a partir de linfomononucleares de sangre periférica por el método de Salting Out modificado (38). La Tipificación Molecular de los alelos MHC/HLA Clase-II: (DRB1*) se realizó por la técnica de PCR-SSP con sondas de secuencia específica (BIOTEST). Se tipificó el exón 2 de la cadena |31 del alelo HLA-DRB1(39).
Identificación de los alelos del (C1858T) PTPN22
El polimorfismo del alelo C1858T- PTPN22 (Roche) se estudió por Rtq-PCR (120). La genotipificación molecular del alelo PTPN22 polimorfismo (C1858T), homocigoto silvestre (C/C), heterocigoto mutado (C/T) y homocigoto mutado (T/T) se realizó con sondas de hibridación-PCR en Tiempo Real en el equipo LightCycler® 2.0 Carousel-Based System (Laboratorio Roche, división Roche Molecular Biochemicals).
Análisis de las secuencias del epítope compartido en AIJ poliarticular y AR de instalación temprana
A partir de las secuencias aminoacídicas de la región 70-74 de los diferentes alelos que portan el epítope compartido se llevó a cabo un análisis in silico. Para ello se escogieron solo aquellas secuencias aminoácidicas con significancia estadística, que se mostraron asociadas a susceptibilidad o protección en AIJ poliarticular y AR de instalación temprana. El análisis permitió una clasificación arbitraria apoyada en el papel que los aminoácidos pueden cumplir en el reconocimiento antigènico. Se implementó la siguiente clasificación:
Análisis de las Secuencias de alelos HLA-DRB1* con (SE) de protección para ambas patologías: AIJ poliarticular y AR de instalación temprana
Las secuencias (SE) de alelos HLA-DRB1* asociados a protección se clasificaron con la convención (F). Estas mostraron en la posición 70 el aminoácido D del bolsillo 4 en la molécula MHC-DRB1* y en cualquier posición de forma individual o repetida entre las posiciones 71 a 74 del (SE) el aminoácido (R) con un posible papel en el cambio de conformación espacial de la molécula al momento de acoplar el antígeno. Se Sistematizó la siguiente agrupación:
]]> Secuencias de alelos HLA-DRB1* con (SE) de susceptibilidad para ambas patologías: AIJ poliarticular y AR de instalación tempranaF: epítopes compartidos con el aminoácido (D).
F1: para las secuencias (D/RR/).
F2: para las secuencias (D/R//).
F3: para las secuencias (DRR//).
/: Cualquier otro aminoácido diferente a (D) o (R) dentro del (SE).
Las secuencias (SE) de alelos MHC/HLA: DRB1* asociados a susceptibilidad se clasificaron con la convención de la letra (S); ellas poseen en la posición 70 el aminoácido (Q) y en cualquier posición el aminoácido (R) entre las posiciones 71 a 74 del (SE). Se sistematizó la agrupación de la siguiente forma:
S: epítope compartido con el aminoácido (Q) en la posición 70 del bolsillo 4 de la molécula MHC/HLA-DRB1*.
Sji para las secuencias (Q/R//).
S2: para las secuencias (Q/R/R).
S3: para las secuencias (QRR//).
/: Cualquier otro aminoácido diferente a (Q) o (R) dentro del (SE).
Secuencias de alelos HLA-DRB1* con (SE) y demás aminoácidos neutros para ambas patologías: AIJ poliarticular y AR de instalación temprana
Secuencias de aminoácidos con un papel neutro que no se pudieron asociar con protección o susceptibilidad para las patologías (AIJ) poliarticular y AR de instalación temprana. Se sistematizó la siguiente agrupación:
]]>X1: Secuencias (neutras).
Una vez identificadas y determinadas las secuencias de protección o susceptibilidad según la clasificación arriba descrita, se decidió realizar la sumatoria (Σ) de las secuencias proponiendo la siguiente convención:
Para las secuencias con el aminoácido (D) en la posición 70 seguido del aminoácido (R) en cualquier posición del (SE) asociadas a protección, con la convención de (-) en ambas patologías: AIJ poliarticular y AR de instalación temprana, entonces la sumatoria de (SE) de posible protección con la convención de (F) fue representada como: ΣF (-).
Para las secuencias con el aminoácido (Q) en la posición 70 seguido del aminoácido (R) en cualquier posición del (SE) asociadas a susceptibilidad, con la convención (+) en ambas patologías: AIJ poliarticular y AR de instalación temprana, se hizo la sumatoria
de (SE) de posible susceptibilidad con la convención de (S), quedando representado como: ΣS (+).
Esta clasificación ayudó a calcular y proponer de manera global el papel del (SE) en las dos patologías, considerándolo como un posible sistema común para ambas patologías.
Lo anterior, dentro del modelo que se usó, permitió agrupar las secuencias a la siguiente convención:
El modelo anterior permitió finalmente el análisis de la secuencia aminoacídica (70-74) del epítope compartido del bolsillo 4 de MHC/DRB1*:
ΣSE (-): F1+F2+F3
ΣSE (+): S1+S2+S3
X1
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó usando los programas estadísticos SPSS 11.5 y EpiInfo versión 6.0 para el análisis de asociación en cuanto a OR, intervalo de confianza y valor de p (X2, corrección de Yates y Fisher).
Para la asociación de los polimorfismos en AR de instalación temprana y AIJ poliarticular se construyeron tablas de contingencia (2x2). Se calculó el OR y se consideró significativo aquel con un IC del 95% y un valor de p<0.05. Se contrastó la hipótesis de asociación mediante un test de x2, con su respectivo valor de p<0,05, con un IC del 95%. Se tuvo en cuenta el test exacto de Fisher y se calculó el valor de p corregido de Yates en aquellos casos en los que la frecuencia esperada fue menor de 5 (Test de Yates) y menor de 3 (Test Exacto de Fisher). Se utilizó corrección de Bonferroni como un método usado para contrarrestar el problema de las comparaciones múltiples. Para determinar el equilibrio de Hardy Weinberg se utilizó la calculadora virtual para pruebas de comprobación biológica de estudios de aleatorización mendeliana de la American Journal of Epidemiology (Hardy-Weinberg calculadora incluyendo el análisis de sesgo de evaluación.
]]> ResultadosFrecuencias alélicas del exón HLA-DRB1* más frecuentemente expresadas en pacientes con AIJ poliarticular y AR de instalación temprana y sujetos controles
En la Tabla 1 se observa que los pacientes que sufren de AIJ poliarticular expresaron más frecuentemente el alelo MHC/HLA-DRB1* 0301, seguido de los alelos DRB1*0404 y DRB1*0405 (8 %). Para los pacientes con AR de instalacion temprana, el alelo DRB1*0101 se mostró como el más frecuente ( 20 %,) seguido del DRB1*1501, con un 12 %. Otros alelos expresados en este grupo de pacientes fueron DRB1*0301 (10 %) y DRB1*0901, con un 8 %.
El alelo HLA-DRB1*0404 se comportó como un posible marcador de susceptibilidad para AIJ poliarticular (OR=10.82; IC: 1.18250.67; p=0,016.) Se destaca que DRB1*0701 se mostró como un marcador de protección tanto para AIJ poliarticular (OR= 0.15; IC: 0.02-0.71); p=0.011) como para AR de instalación temprana (OR= 0.15; IC: 0.02-0.71
p=0.011) y el alelo HLA-DRB1*0101 como un posible marcador de susceptibilidad para AR de instalación temprana (OR= 4.04; IC: 1.37-12.19) p=0,007.
Secuencia aminoacídica del epítope compartido (posición 70-74) del exón DRB1* y su asociación con artritis reumatoide de instalación temprana
La Tabla 2 describe los diferentes alelos del Exon DRB1 que comparten la secuencia 70-74 del bolsillo 4 de la tercera región hipervariable de la cadena HLA-DRB1. Se encontró al alelo DRB1*0701(DRRGQ) asociado a protección (OR=0,15; IC: 0,02-0, 71, p=0,01). Los alelos DRB1*0101, 0404, 0405 y 0408, que expresan una secuencia 70-74 QRRAA, se asociaron a susceptibilidad (OR= 4,48; IC: 1,56-10,37 p=0,001).
Para AIJ poliarticular, el alelo HLA-DRB1*0701, cuya secuencia en la posición (70-74) del bolsillo 4 de la tercera región hipervariable de la cadena HLA-DRB1* es 70 DRRGQ74, y se expresó como un posible marcador de protección (OR= 0,15; IC: 0,020,71 p=0,01). Los alelos HLA-DRB1*0101, *0404, *0405, *0408 y *1402, que comparten una secuencia 70QRRAA74, se asociaron a susceptibilidad (OR=3,75; IC (1,58-8,13 p=0,005).
]]> Análisis de asociación de las frecuencias alélicas del polimorfismo C1858T de PTPN22 con AIJ poliarticular y AR de instalación tempranaLa Tabla 3 muestra las frecuencias alélicas más frecuentemente expresadas de estos polimorfismos. En los pacientes con artritis idiopática juvenil poliarticular, los alelos más frecuentemente expresados fueron C/C (90 %), seguido de C/T, con un 6,7 %, y T/T, con un 3,3 %. El polimorfismo C/C (C1858T) se expresó como un alelo de protección (OR=0,23; p=0,070543).
Para los pacientes que sufren de AR de instalación temprana, el alelo C/C fue el de mayor frecuencia alelica (73,3 %), seguido de C/T con un 20 %.
Este grupo de pacientes se encuentra en equilibrio de HW, ya que estuvo por debajo de 3,84, con un valor de p>0.05; los pacientes con el alelo silvestre (C/C) se expresó con un OR=0,06; p=0,0005*, y se lo sugiere como un alelo de protección para AR. El alelo mutado (C/T) mostró un OR=16,09; p=0,0037*, lo cual indica que es un alelo asociado con susceptibilidad en esta entidad. El cálculo de Bonferroni demuestra que la posición de los alelos del PTPN22, específicamente el alelo mutante (CT), es un marcador de susceptibilidad para (AR) de instalación temprana, con un valor de p<0,025.
Análisis de asociación entre los aminoácidos que hacen parte del bolsillo 4 en la posición 70-74 del epítope compartido MHC/ HLA- DRB1*implicados en la susceptibilidad o protección para las dos entidades: AIJ poliarticular y AR de instalación temprana
La Tabla 4 describe cómo el aminoácido de la posición (70) del bolsillo 4 de la región hipervariable de la cadena DRB1, el cual corresponde al aminoácido ácido aspártico (D), contribuye, en ambas patologías, como un aminoácido de posible protección. Para AIJ poliarticular, el aminoácido ácido aspártico (D) un OR=0,49; IC (0,25-0,97) y un valor de p=0,0397* y se sugiere como posible protector, y para artritis reumatoide de instalación temprana, el aminoácido (D) un OR=0,22; IC (0,10-0,48) y un valor de p=0,0000*, sugiriéndolo como posible protector para no presentar la enfermedad. Con relación al aminoácido Glutamina (Q), en la posición (70) del bolsillo 4 de la región hipervariable de la cadena DRB1 se encontró asociado como un aminoácido de posible susceptibilidad en las dos entidades clínicas: AIJ poliarticular y AR de instalación temprana.
Para AIJ poliarticular, un OR= 2,0; IC (1,01-3,96), con un valor de p=0,045*, y para artritis de instalación temprana un OR=3,71; IC (1,84-7,53), con un valor de p=0,0001*, con un posible papel en la susceptibilidad de presentar la enfermedad. En pacientes con artritis reumatoide de instalación temprana se encontró asociado de posible susceptibilidad a la enfermedad, con un OR=3,35; IC: (1,02-11,30) y un valor de p=0,045** para este grupo de pacientes colombianos.
Análisis de las secuencias del epítope compartido ubicadas en la posición (70-74) del bolsillo 4 de los alelos MHC/HLA- DRB1* implicados en la susceptibilidad o protección en las dos entidades en un grupo de pacientes con AIJ y AR de instalación temprana
]]> Nótese en la Tabla 5 cómo la secuencia [F3] se sugiere como posiblemente asociada a protección en pacientes con AR de instalación temprana, con un OR=0,18; IC (0,06-0,52) y un valor de p<0,05. La secuencia (S1) se encontró posiblemente asociada a susceptibilidad, con un OR=2,74; IC (1,06-7,15) y un valor de p<0,05. La secuencia (S3) se encontró como un epítope de posible susceptibilidad, con un OR=4,00; IC (1,56-10,37) y un valor de p<0,05.Sumatoria de las frecuencias de epítopes compartidos del bolsillo (4) posición (70-74) del exón 4 de los alelos MHC: HLA-DRB1* implicados en la susceptibilidad o protección en las dos entidades en AIJ y AR
Cuando se realizó la sumatoria de las secuencias del epítope compartido (Tabla 6), aquellas asociadas a protección (ΣSE(' ):F1+F2+F3 ), tanto en AIJ poliarticular como en AR de instalación temprana, se encontró que esta es significativa, y se sugiere como marcador protector en los pacientes con AIJ poliarticular cuando el aminoácido presente en la posición (70) correspondía a un ácido aspártico (D); OR=0,49; IC (0,25-0,97) p<0,05, y para los pacientes con AR de instalación temprana igual con un OR=0,22; IC (0,10-0,48) p<0,05. Al asociar el aminoácido (R) precedido por (Q) en la posición (70) con las siguientes secuencias (ΣSE (+):S1+S2+S3) se encontró que este se asoció como marcador de susceptibilidad para AIJ poliarticular: OR=2,00; IC (1,01-3,96) p<0,05. Igual significancia para AR de instalación temprana: OR=4,31; IC (2,12-8,80) p<0,05.
Discusión
Son muchos los sistemas genéticos implicados en la susceptibilidad o protección en AR de instalación temprana y e AIJ poliarticular. Los resultados de este estudio sugieren el papel de los polimorfismos de dos sistemas genéticos: PTPN22 (C1858T) y HLA-DRB1*, como marcadores de susceptibilidad o protección en estas enfermedades autoinmunes, lo cual se considera como un hallazgo que permite suponer una posible base genética común en ellas.
La tipificación de los alelos MHC/DRB1* en el grupo de pacientes con AIJ poliarticular mostró al alelo DRB1*0404 como un probable marcador de susceptibilidad para esta entidad (OR=10.82; p<0.05). En las muestras del grupo de pacientes con AR de instalación temprana, el alelo HLA-DRB1*0101 se asoció como un marcador de susceptibilidad (OR=4.04; p<0.05,). Se resalta que el alelo HLA-DRB1*0701 se identifica como un marcador de protección en ambas entidades (OR=0,15; p<0,05). De otra parte, en el sistema PTPN22, el polimorfismo (C1858T) no se asoció con AIJ poliarticular. En las tipificaciones de las muestras de pacientes con AR de instalación temprana, el polimorfismo CC se sugiere como marcador protector (p<0.05) y el polimorfismo CT/TT como marcador de susceptibilidad (p<0.05).
En el análisis de la secuencia aminoacídica 70QRRAA74 se encontró que esta se asoció como un marcador de susceptibilidad para ambas entidades (p<0.05). En el mismo sentido, la secuencia 70DRRGQ74 estuvo asociada a protección en ambas entidades (p<0.05). En la clasificación del epítope compartido que se usó se muestra que el aminoácido (Q) en la posición 70 tiene un posible papel para la susceptibilidad en ambas entidades (p<0.05). En esta misma posición, el aminoácido (D) sugiere protección en ambas patologías (p<0.05). El análisis del aminoácido (R) encuentra que, independientemente de su posición dentro del (SE), este estaría asociado a susceptibilidad.
Los resultados de las asociaciones en los dos sistemas genéticos: PTPN22 (C1858T) y MHC/ DRB1*, con AR de instalación temprana y con AIJ poliarticular se comportan con un patrón similar al informado en la literatura. Se destaca que a pesar del número de pacientes estudiados se encontró una significancia estadística en las asociaciones con los biomarcadores genéticos.
]]> Se desea resaltar que el modelo utilizado para estudiar el epítope compartido mostró en ambas entidades a los aminoácidos guanina, arginina y aspártico como importantes marcadores de asociación con la susceptibilidad o protección. Dichos aminoácidos en la molécula MHC/HLA- DRB1*, en razón a su carga eléctrica, podrían tener un papel importante a través de las fuerzas intermoleculares que interactúan, produciendo cambios en el espacio o conformación molecular del (SE), contribuyendo a la presentación antigénica de péptidos artritogenicos. Estos resultados permiten suponer que los aminoácidos de la posición (70) del bolsillo 4 en el exón MHC/DRB1*, en ambas entidades, conferirían a través de su potencial electrostático un acople con el péptido artritogénico, debido al cambio conformacional. Estos polimorfismos, posiblemente comunes en artritis reumatoide de instalación temprana y artritis idiopática juvenil poliarticular, son moléculas que participan en mecanismos cruciales de la cascada inflamatoria en la fisiopatología de la enfermedad autoinmune, y a la vez están implicados en la activación de linfocitos T CD4. Los resultados obtenidos por nosotros en este estudio muestran que los epítopes compartidos (SE+) de los alelos (MHC/HLA-Clase II: DRB1*) y el polimorfismo del (C1858T) PTPN22 podrían considerarse como posibles marcadores moleculares comunes.En la literatura hay una escasa información sobre la correlación existente entre estos dos sistemas genéticos como posibles genes comunes para la presentación y pronóstico de AIJ poliarticular y AR de instalación temprana (34, 36, 37). Sin embargo, es necesario comentar que debido a la estratificación presente en una población multiétnica, como es la del Caribe colombiano, llevar a cabo un estudio con un mayor número de pacientes que involucre un análisis de ligamiento familiar para PTPN22 y HLA-DRB1* en estos pacientes afectados con las dos entidades, podrá validar estos resultados.
Agradecimientos
Expresamos nuestros agradecimientos a todos los pacientes que participaron en este estudio y a Ana Sofía Moreno Woo, por el soporte técnico que aportó en el desarrollo de este proyecto.
Financiación: Esta investigación fue parcialmente financiada por fondos del proyecto referenciado Código: 1215-343-19299 y de fondos provenientes de la Universidad del Norte.
Conflicto de interés: ninguno.
Notas
1Laboratorio de Inmunología y Biología Molecular, Universidad del Norte, Barranquilla (Colombia).
2Servicio de Reumatologia, Clínica del niño, IS Bogotá, D.C. (Colombia).
3Departamento de Reumatologia, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C. (Colombia).
]]> 4Departamento de epidemiologia, Universidad del Norte, Barranquilla (Colombia).Referencias
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