Desarrollo de herramientas moleculares para la genotipificación de especies de Leptospira spp
RONALD G. PELAÉZ SĂNCHEZ1, PIEDAD AGUEDELO FLOREZ1
1Instituto Colombiano de Medicina Tropical â Universidad CES
Introducción: leptospirosis es causada por especies patógenas del género Leptospira, el cual incluye 20 especies, entre patógenas y saprófitas. Tradicionalmente se ha usado para su tipificación el método serológico que ha definido más de 250 serovariedades (1). Por ser un método ambiguo se han propuesto alternativas de genotipificación basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Este estudio pretende realizar transferencia de metodologías moleculares disponibles sólo en laboratorios de referencia a nivel mundial, que permitan discriminar especies de Leptospira en forma universal y reproducible.
]]> Objetivo: desarrollar pruebas de PCR múltiple, número variable de repeticiones en tandem (VNTRs) y tipificación por secuenciamiento de múltiples locus (MLST's) para la genotipificación de especies patógenas y saprófitas de Leptospira spp.Metodología: se usaron 22 cepas de referencia, incubadas en medio líquido a 30 °C y con crecimiento igual al estándar 0,5 de MacFarland. La extracción de DNA se realizó mediante método Wizard® y se cuantificaron por Nanodrop®. Las pruebas de PCR se realizaron usando secuencias de cebadores de referencia (2,3) y fueron estandarizadas de acuerdo a la temperatura de disociación de cada cebador y tamaño del amplificado. Se desarrollaron en un termociclador C1000 Thermal Cycler®. El revelado se realizó en geles de agarosa al 1,5 %, teñido con bromuro de etídio y revelado en transiluminador Epichemi-darkroom®
Resultados:se desarrolló PCR múltiple para diferenciar especies patógenas y saprófitas con genes blanco rRNA universal para el género Leptospira y gen SecY presente en especies patógenas. Para la identificación de serovariedades por VNTRs se obtuvo un patrón de bandeo diferencial en las 22 serovariedades. Se desarrolló MLSTs con la amplificación de 13 genes de expresión constitutiva (adk, icda, LipL41, rrs2, secY, LipL32, pntA, sucA, pfkB, tpiA, mreA, gluU, fadD) que discriminó cada una de las 22 serovariedades de referencia.
Discusión:la implementación de herramientas moleculares para la genotipificación de especies de Leptospira, permitió la diferenciación hasta el nivel de serovariedad. Disponer de pruebas que caractericen la diversidad genética de Leptospira spp, permitirá ampliar el conocimiento de la ecoepidemiología de este problema de salud pública en Colombia.
REFERENCIAS
1. Ko AI, Goarant C y Picardeau M. Leptospira: the dawn of the molecular genetics era for an emerging zoonotic pathogen. Nature Reviews 2009; 7: 736-747. [ Links ]
2. Salaün L, Mérien F, Gurianova S, Baranton G, Picardeau M. Application of multilocus variable-number tandem-repeat analysis for molecular typing of the agent of leptospirosis. J Clin Microbiol 2006; 44:3954-62. [ Links ] 3. Ahmed N, Devi SM, Valverde Mde L, Vijayachari P, Machang'u RS, Ellis WA, Hartskeerl RA. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2006; 5:28. [ Links ]
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