Artículo original

Resumen

Objetivo. Con el fin de aportar nueva información relevante para estudios de genotipificación y filogenética del género Leishmania, en este estudio se determinó y comparó la secuencia del maxicírculo de Leishmania braziliensis, cepa MHOM-BR-75-M2904, con las secuencias del maxicírculo reportadas para otras especies de tripanosomátidos. Materiales y métodos. La búsqueda de las secuencias del maxicírculo se realizó en las bases de datos de secuencias no ensambladas del GeneDB versión 2.1, así como en el GenBank, utilizando los genes ND8 y RPS12 de L. braziliensis como sonda inicial. Estas secuencias se ensamblaron y se compararon con sus homólogas en otros tripanosomátidos mediante el uso de herramientas bioinformáticas como LALIGN y ClustalW2. El tamaño total del maxicírculo se determinó mediante ensayos de Southern blot. Resultados. Se ensamblaron dos fragmentos del maxicírculo de L. braziliensis de 6535 y 4257 nucleótidos, cuyos genes presentaron elevada sintenia y similitud en sus secuencias con los previamente reportados en otras especies de Leishmania. Similitud que se extiende incluso a los patrones de edición de estas moléculas. Conclusiones. A pesar de ser L. braziliensis la especie más divergente del género Leishmania en cuanto a su genoma nuclear, el marxicírculo presenta una elevada conservación. Resultado que sugiere que el patrón de edición presente en las diferentes especies de Leishmania hasta ahora estudiadas se conserva también en el subgénero Viannia, lo que indica una elevada conservación en la edición de los transcritos mitocondriales a nivel de género.

Palabras clave: ADN del cinetoplasto (ADNk), edición del ARN, Leishmania (Viannia) braziliensis, maxicírculo.

Abstract

Objective. With the aim to provide new insights for genotyping and phylogenetic studies of the Leishmania genus, in this study the sequence of the maxicircle in Leishmania braziliensis, strain MHOM-BR-75-M2904, was determined and compared with those reported in other trypanosomatids species. Materials and methods. Searches for maxicircle sequences were performed in the unassembled sequences of GeneDB database version 2.1, as well as in the GenBank, using the ND8 and RPS12 genes of L. braziliensis as the initial probes. These sequences were assembled and compared with the homologous sequences of trypanosomatids using the bioinformatics tools LALIGN and ClustalW2. The size of maxicircle was determined by Southern blot assays. Results. Two maxicircle fragments of 6535 and 4257 nucleotides were assembled. The sequences of these genes showed high synteny and similarity with the sequences in other Leishmania species. This similarity even was extended to the editing patterns of these molecules. Conclusions. Although L. braziliensis is the most divergent species of the Leishmania genus in their nuclear genome, the maxicicircle has a high conservation. This result suggests that the pattern of editing present in the different Leishmania species studied has been conserved also in the subgenus Viannia. These results indicate a high conservation in the editing of mitochondrial transcripts at the genus level.

Keywords: kinetoplast DNA (kDNA), RNA editing, Leishmania (Viannia) braziliensis, maxicircle.

Resumo

Palavras-chave: ADN de kinetoplasto (ADNk), edição de ARN, Leishmania (Viannia) braziliensis, maxicirculo.

Introducción

Las Leishmaniasis son un grupo de enfermedades producidas por parásitos protozoarios pertenecientes al género Leishmania, los cuales son transmitidos en América por la picadura de insectos del género Lutzomyia (1). Esta enfermedad tiene un amplio rango de manifestaciones las cuales abarcan desde la infección cutánea, mucocutánea a visceral (2). Dentro de los principales agentes etiológicos de la leishmaniasis cutánea y mucocutánea en Colombia se encuentra la especie Leishmania (Viannia) braziliensis (1).

Las leishmanias, al igual que los otros géneros pertenecientes al orden Kinetoplastida, se caracterizan por la presencia de un organelo denominado cinetoplasto, correspondiente al ADN mitocondrial o ADNk del parásito (3). El cinetoplasto es una red compleja formada por dos clases de moléculas de ADN circular concatenadas entre sí: los minicírculos y los maxicírculos. Los primeros tienen un tamaño que varía entre 0,7 - 1.0 kb dependiendo de la especie de kinetoplástido, se encuentran repetidos entre 5000 50000 veces por cinetoplasto, codifican para los ARN pequeños ricos en uridinas conocidos como ARN guías (ARNg) y se caracterizan por presentar una amplia variabilidad en sus secuencias (4 - 6). Los maxicírculos por su parte, con tamaños de 20 - 38 kb y 20 - 50 copias por cinetoplasto, son moléculas conservadas con excepción de la región divergente (DR), la cual se caracteriza por poseer elementos repetidos y tener una extensión variable, siendo de 4073 nt en Leishmania tarentolae (4, 7, 8).

Los maxicírculos contienen dos ARN ribosomales (ARNr), algunos ARNg y codifican para18 genes estructurales incluyendo la proteína ribosomal S12 (RPS12), varias de las enzimas de la cadena respiratoria mitocondrial como la apocitocromo b (CyB), las subunidades I, II y III de la citocromo c oxidasa (COI, COII, COIII) y las subunidades 1, 3, 4, 7, 8 y 9 de la NADH deshidrogenasa (ND1, ND3, ND4, ND7, ND8 y ND9), aparte de cuatro marcos de lectura abiertos conocidos como MURF1, MURF2, MURF4 o ATPasa 6 (9) y MURF5 (4, 5, 10, 11). La información codificante de algunos de estos genes se encuentra encriptada, los transcritos generados con frecuencia carecen de codones que indiquen el inicio o fin de la traducción y la secuencia codificante está incompleta (12). Antes de ser traducidos, estos transcritos van a experimentar un proceso de edición, que, mediante la inserción y deleción de residuos de uridinas en sitios específicos del ARN naciente o pre-editado, conduce a la creación de marcos de lectura correctos (13). Este mecanismo de edición, que tiene una progresión en sentido 3' - 5', es asistido por los ARNg, los cuales actúan de molde o plantilla (14 16). Así, el ARNg en su zona de anclaje en su extremo 5' forma una dúplex de 10 - 15 nt con el ARNm pre-editado. El número de uridinas adicionadas es guiado por la cantidad de adenosinas o guanosinas sin aparear con el ARN pre-editado presentes en el ARNg corriente abajo del dominio de anclaje. En tanto que los residuos de uridinas a delecionarse se marcan por su ausencia en el extremo 3' del fragmento que sobresale del dúplex ARNg:ARNm (16).

Actualmente se conoce la totalidad del genoma del maxicírculo de algunas especies de kinetoplastidos como L. tarentolae (5, 10), Leishmania donovani (11), Trypanosoma brucei (5, 17, 19) y Trypanosoma cruzi (20) y, secuencias parciales de los maxicírculos de Leishmania major (21), Leishmania amazonensis (22), Crithidia fasciculata (23, 24) y Phytomonas serpens (25, 26).

En este artículo se reporta la secuencia de dos fragmentos no contiguos de la región codificante del genoma del maxicírculo de L. braziliensis, para un total de cobertura de 10,7 kb y, se presenta un análisis comparativo de estas secuencias con las de otros kinetoplástidos previamente reportadas.

Materiales y métodos

Parásitos

Ensayos de Southern blot

Para determinar el tamaño total del maxicírculo se realizó un ensayo de Southern blot utilizando ADN total del parásito, obtenido de acuerdo a Requena y colaboradores (1988), digerido con las enzimas de restricción BamHI, BstBI, EcoRI, HindIII, PvuI, PvuII, SphI y Xhol, de acuerdo a las indicaciones de la casa fabricante (Promega®, Wisconsin, USA). Las enzimas se seleccionaron con base en la presencia de sitios únicos de restricción en el genoma del maxicírculo de L. tarentolae, L. donovani y L. major. Los fragmentos resultantes fueron resueltos mediante electroforesis horizontal, en un gel de agarosa al 0,8% y transferidos a membrana de nylon por el método de transferencia salina (28), para su posterior hibridación con un fragmento que contiene 155 pb correspondiente al extremo 5' no editado del gen ND8 de L. braziliensis (29, Material supl. 1), el cual no presenta identidad significativa con regiones del ADN nuclear del parásito. La sonda fue marcada con digoxigenina utilizando el estuche comercial DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche, Basel, Suiza). El protocolo de hibridación se realizó en condiciones de astringencia siguiendo las indicaciones del fabricante (Manual de Instrucción DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II). Posteriormente, se realizaron dos avados en condiciones astringentes con solución salina citrato (SSC) 0,1% y SDS al 0,1% a 68 °C por 15 min cada uno, seguidos de exposición a películas de rayos X Curix RP2 Plus (AGFA, Mortsel, Bélgica) durante 1h.

Obtención de la secuencia parcial del maxicírculo de L. braziliensis

La construcción de la secuencia parcial del maxicírculo de L. braziliensis se realizó mediante análisis BLAST de las secuencias reportadas en las bases de datos GeneDB de secuencias no ensambladas (http://old.genedb.org/genedb/lbraziliensis/ y GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Como sonda inicial para los análisis de hibridación in silico del fragmento de 6535 pb se utilizó un fragmento de 155 pb correspondiente al extremo 5' no editado de la secuencia del gen ND8 del parásito (29, Material supl. 1), mientras que para el fragmento de 4257 se utilizó el gen RPS12 de L. braziliensis. La elongación de la secuencia en construcción se logró mediante pasos reiterativos de análisis BLAST/n de los extremos del fragmento ensamblado, seguido de análisis LALIGN con cada una de las entradas encontradas en el BLAST/n. Los números de acceso de las secuencias empleadas para el ensamblaje del maxicírculo se muestran en la Tabla 1 (Material supl. 2A y 2B), con su correspondiente valor de "e" de significancia de los análisis BLAST.

Las secuencias génicas de L. braziliensis se identificaron por similitud con las secuencias reportadas en L. tarentolae (N° de acceso al GenBank M10126), cuyo maxicírculo ha sido secuenciado en su totalidad. Para ello, se compararon de forma individual cada una de las secuencias obtenidas con su contraparte en L. tarentolae utilizando la herramienta LALIGN (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html). La comparación de varias secuencias se realizó mediante la herramienta ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Los perfiles de restricción in silico se determinaron utilizando la herramienta NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/). La determinación de la sintenia se realizó mediante comparación del orden de los genes entre los distintos maxicírculos de las especies analizadas. La dirección de la transcripción de los genes se determinó de acuerdo a la presencia del marco de lectura abierto, luego del ensamblaje del genoma, en la cadena sentido o antisentido. La presencia putativa de dominios funcionales en la proteína putativa MURF5 se determinó mediante la herramienta InterproScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/).

Resultados y discusión

El maxicírculo completo de L. braziliensis posee un tamaño aproximado de 23 kb como se observa claramente en las digestiones realizadas con las enzimas HindIII y BstBI (Figura 1). Resultados que concuerdan con lo reportado para L. tarentolae, 21 kb (10) y L. donovani, 20 kb, (11), y otros tripanosomátidos como T. brucei, 23 kb, y T. cruzi, 20 kb cepa CL Brener y 22 kb, cepa Esmeraldo (17 20).

A partir de 44 secuencias previamente reportadas en diferentes bases de datos, se logró determinar gran parte de la secuencia del maxicírculo de L. braziliensis. Se ensamblaron dos fragmentos del maxicírculo, el primero con un tamaño de 6535 nt que contiene tres ARN guías (ARNg) y los ARN ribosomales (ARNr) 12S y 9S, además de codificar para las secuencias pre-editadas de las proteínas ND7, ND8, ND9, COIII, CyB y MURF5 (Figura 2, Material supl. 2A). El segundo fragmento con un tamaño de 4257 nts codifica para las secuencias correspondientes a los genes ND4, ND3 (conocido también como región G5), RPS12 y ND5, así como la región G4 (Figura 2, Material supl. 2B). La separación entre ambos fragmentos no es conocida, aunque su tamaño aproximado se puede deducir si se considera que los genes ND4 y CyB en L. tarentolae están separados por 6672 nt (10).

La organización genómica de la secuencia parcial del maxicírculo de L. braziliensis, esquematizada en la Figura 2, es bastante similar a la de L. tarentolae tanto en el orden (12S, 9S, ND8, ND9, MURF5, ND7, COIII, CyB-G4, ND4, ND3, RPS12 y ND5), como en la posición, longitud y secuencia de los genes.

Más aún la orientación de la transcripción de los genes parece ser idéntica, en donde los genes 12S, 9S, ND8, ND7, COIII, CyB, ND4, RPS12 y ND5, se transcriben de la hebra sentido, mientras que los genes ND9, MURF5 y ND3 son transcritos a partir de la hebra anti-sentido. Al comparar con la secuencia parcial de los maxicírculos de otras especies como L. major (cepa MHOM/SU/73/5ASKH, N° de acceso al GenBank EU140338), L. donovani (cepa MHOM/SD/62/1S-C12D, N° de acceso al GenBank FJ416603) y L. amazonensis (cepa LV78, N° de acceso al GenBank HM439238) también se observaron resultados similares con excepción de algunas diferencias en el tamaño de las secuencias pre-editadas (Tabla 2). Por ejemplo, en relación a L. donovani se observan diferencias de 70 nts en los genes ND8 y CyB; mientras que en comparación con L. major las diferencias más notorias se presentaron con los genes ND8, ND9 y MURF5. Cabe resaltar que si bien la secuencia que codifica para MURF5 no ha sido descrita en el maxicírculo de L. donovani, esta fue identificada en este estudio en las posiciones 2159 2457 de la hebra antisentido, mediante un alineamiento con el gen respectivo de L. tarentolae.

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Al extender el análisis a otros tripanosomátidos como T. cruzi (cepa CL Brener, N° de acceso al GenBank DQ343645 y cepa Esmeraldo, N° de acceso al GenBank DQ343646) y T. brucei (cepa EATRO 427, N° de acceso al GenBank M94286) se observaron diferencias marcadas con relación al tamaño de las regiones pre-editadas de los genes codificantes para ND7 y COIII presentando diferencias de 406 - 460 nts. También se observó variabilidad en relación a los genes ND8 y ND9 cuyo tamaño se conserva en T. cruzi pero no en T. brucei. A diferencia de la secuencia de CyB; el resto de las secuencias presentan diferencias hasta de 150 nts. Con relación a los kinetoplástidos P. serpens y C. fasciculata se encontraron diferencias en el tamaño de todas las regiones pre-editadas reportadas con un rango de 25 a 462 nts de diferencia (Tabla 2).

Los anteriores resultados muestran una considerable sintenia de los genes del maxicírculo entre las distintas especies del parásito que infectan lagartos y mamíferos, independientemente del subgénero. Así mismo, el elevado porcentaje de similitud entre los genes pre-editados tanto en longitud como en secuencia sugiere patrones similares de edición entre las distintas especies. En este mismo sentido, las diferencias encontradas con otros géneros de tripanosomátidos como Trypanosoma, P. serpens y C. fasciculata, presuponen patrones de edición más distantes entre los mismos.

Secuencias pre-editadas

Secuencia pre-editada de la proteína ND8: anteriormente conocida como región G1, en L. tarentolae, esta secuencia se caracteriza por sufrir "pan-editing", es decir edición extensiva a lo largo de toda la molécula (11, 22, 29, 32). Al comparar la secuencia pre-editada de L. braziliensis con la correspondiente en L. tarentolae se observó una identidad de 65,2%, valores muy cercanos a los observados al comparar con las regiones equivalentes en L. donovani y L. major, pero más distantes a los resultados obtenidos con otros tripanosomátidos, especialmente para T. brucei y P. serpens (Tabla 3). De especial interés, Ramírez et al. mostraron como los ARN respectivos de este gen sufren edición, alcanzando una identidad del 91,9% con respecto a la secuencia de L. tarentolae en la región editada (29).

Secuencia pre-editada de la proteína ND9: también conocida como G2, esta secuencia, al igual que para la secuencia codificante de la proteína ND8 en L. tarentolae, presenta una edición extensiva del mismo (11, 22, 32). Los porcentajes de identidad de la secuencia pre-editada de L. braziliensis resultaron ser de 71,9%, 71,2%, 66,5% y 53,4% con las secuencias de L. tarentolae, L. donovani, L. amazonensis y L. major, respectivamente. Al comparar con el resto de secuencias de las especies de tripanosomátidos analizados se observaron porcentajes de identidad inferiores, entre 43,9 y 55,3% (Tabla 3).

Secuencia pre-editada del marco de lectura abierto MURF5: estudios recientes de Maslov (22) indican que esta secuencia parece no sufrir edición en tripanosomátidos. Sin embargo, se constató que existe una variabilidad significativa tanto en su extremo amino como carboxilo terminal entre las distintas especies de Leishmania y kinetoplástidos en general (22). Así, al realizar un alineamiento múltiple de la secuencia de L. braziliensis con las previamente reportadas, esta parece ser la situación en esta especie (Figura 3). Llamativamente, a semejanza de T. brucei y P. serpens, el codón de inicio de este marco de lectura parece corresponder a la tradicional metionina, en lugar de la leucina reportada en L. tarentolae, L. donovani, L. major y L. amazonensis (10, 11, 21, 22). A este respecto es importante señalar que al igual que para otros ADN mitocondriales el código genético del ADNk rompe con las reglas del código universal, en el sentido de que la tripleta UGA no representa un codón de terminación sino que codifica para el aminoácido triptófano (10), además de las tripletas que codifican para codones de inicio diferentes a la metionina como las codificantes para leucina e isoleucina (33-35). Queda por definir si la variabilidad de los extremos de la proteína putativa MURF5 ejerce algún impacto en su posible función. Sin embargo, análisis in silico de dominios funcionales putativos muestran que esta proteína presenta un dominio trans-membrana, localizado en la región conservada de la misma.

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Secuencia pre-editada de la proteína ND7: en L. tarentolae esta secuencia presenta edición en el extremo 5' de la molécula y en una región interna 170 nts corriente abajo del AUA de inicio (22). Al alinear la región pre-editada de L. braziliensis con la secuencia editada de L. tarentolae y realizar la simulación del proceso de edición in silico (Figuras 4A y 4B), se observó que esta secuencia puede presentar el mismo patrón de edición, común a las otras especies del parásito reportadas.

Más aún, al comparar la secuencia putativa de aminoácidos resultante de la edición in silico de L. braziliensis con la secuencia reportada para otras leishmanias, se observó un porcentaje de identidad de 87,2% (Figura 4C), estando al igual que en otras especies del parásito, las divergencias ubicadas en el extremo carboxi terminal de la proteína. De especial interés, al igual que lo reportado para L. tarentolae, L. amazonensis y L. major, el codón de inicio de esta proteína parece corresponder al aminoácido no canónico isoleucina, al igual que en P. serpens (AF079967). Por otra parte, al comparar las regiones pre-editadas con las otras especies del parásito se encontraron porcentajes de identidad similares (86,7 - 87,3%, Tabla 3). Por el contrario, los porcentajes obtenidos con las otras especies de tripanosomátidos estuvieron alrededor del 40%, posiblemente debido al "pan-editing" que sufren estas secuencias en T. cruzi (DQ343645 y DQ343646) y T. brucei (M94286).

Secuencia pre-editada de la proteína COIII: esta secuencia al igual que la respectiva de la proteína ND7, sufre edición en el extremo 5' de la molécula en las diferentes especies del parásito reportadas (11, 22, 36). Al realizar el alineamiento entre la secuencia pre-editada de L. braziliensis y la editada de L. tarentolae se observó el mismo patrón de edición (Figuras 5A y 5B), observándose un porcentaje de similitud de 89,2% (Figura 5C), Resultado coherente con los porcentajes de identidad obtenidos al comparar las secuencias pre-editadas con las especies analizadas los cuales variaron entre 84,5 - 87,3% (Tabla 3). Al igual que para la secuencia ND7, el porcentaje de similitud fue significantemente más bajo con las secuencias de T. brucei y T. cruzi, debido a que el patrón de edición difiere significativamente del de las especies de Leishmania (37).

Así, se encontró el mismo patrón de edición en L. braziliensis al realizar un alineamiento entre la secuencia pre-editada de esta y la correspondiente en L. tarentolae (Figuras 6A y 6B), encontrándose un porcentaje de identidad de 96,5% (Figura 6C). Estos resultados se corroboraron al observase el porcentaje de identidad obtenido al comparar las secuencias pre-editadas de este gen con las correspondientes en el resto de tripanosomátidos encontrándose valores de 82,4 - 90,5% (Tabla 3), evidenciándose la alta conservación de esta secuencia en los diferentes géneros de la familia Trypanosomatidae.

Secuencia pre-editada de la proteína ND3: conocida también como región G5, en los diferentes tripanosomátidos estudiados, esta secuencia se caracteriza por sufrir "pan-editing" (11, 22, 34). De acuerdo a lo anterior, al comparar la secuencia pre-editada de L. braziliensis con las respectivas de las distintas especies del género, se observó una identidad máxima con L. amazonensis de 67,8% y de 30 55% con otros tripanosomátidos (Tabla 3).

Secuencia pre-editada de la proteína RPS12: anteriormente conocida como región G6, esta secuencia también presenta edición a lo largo de la misma (11, 22) y utiliza como codón de inicio la tripleta no canónica AUU, creada durante el proceso de edición. Para L. braziliensis, se observaron porcentajes de identidad para la secuencia preeditada de 70,2 71,8% con las otras especies de este parásito, mientras que para las otras especies de tripanosomátidos se obtuvieron porcentajes de identidad que variaron entre 40,2 y 42,1%. (Tabla 3).

Secuencia pre-editada de la proteína ND5: diferentes reportes indican que esta secuencia génica no sufre ningún proceso de edición (17, 22). Al comparar con la secuencia obtenida de L. braziliensis, se observó un alto grado de identidad con las secuencias reportadas para los otros tripanosomátidos estudiados variando de 74,1 a 83,7% (Tabla 3), Resultados que indican un alto grado de conservación de esta secuencia en este grupo de parásitos. Por otra parte, en la secuencia de L. braziliensis se observó la falta del codón de inicio. Sin embargo, al eliminar dos timinas ubicadas en las posiciones 2 y 3 del marco de lectura abierto, se obtuvo una secuencia de 590 aa., con un 79,8% de identidad con la secuencia de aa de la proteína de L. tarentolae (datos no mostrados), por tanto es posible que en L. braziliensis estas posiciones sean editadas, aunque no se puede descartar que se deban a algún artefacto de secuenciación.

ARN guías

Se encontraron cinco ARNg, el primero corresponde a un ARNg homólogo al gM150 descrito en L. tarentolae el cual fue descubierto como parte de una edición errónea y su papel en la edición es aún desconocido (38). El segundo y tercero son los denominados gND7-II y gND7-I respectivamente, que como sus nombres lo indican, en L. tarentolae son los dos ARNg que participan en la edición del ARNm codificante para la subunidad ND7 (31). La modelación in silico del apareamiento de las bases entre el ARNg ND7-II y la respectiva región a guiar en el proceso de edición del ARNm de ND7, apoya la existencia del patrón de edición anteriormente sugerido (Figura 7A). Se encontró también el ARNg CyB-II que en L. tarentolae se ha visto es el segundo ARNg que participa en la edición del ARNm que codifica para la proteína CyB (31). Similar a lo encontrado para gND7, al modelar in silico la unión de este ARN con su respectivo ARNm, se evidenció claramente la región a guiar (Figura 7B). Llamativamente, para este ARNg en L. braziliensis, la región codificante inicia en el extremo 3' del gen que codifica para el 9S (Figura 2), al igual que para L. tarentolae. Sin embargo, en L. major estas regiones codificantes no se sobrelapan pero tampoco existe una región intergénica que las separe (21). Con relación al ARNg respectivo de L. donovani, este gen se ubica en la hebra sentido a diferencia de las otras especies. Por último, se encontró el gMURF2-II, que como su nombre lo indica participa en la edición del marco de lectura abierto MURF2. Como se puede observar en la Tabla 4 las secuencias de todos los ARNg se conservan entre 52,7 - 83,7% en relación a otras especies del parásito y entre 45,3 65,4% al comparar con otros tripanosomátidos. Resultados que apoyan un patrón de edición compartido por distintas especies del género Leishmania y más disímil al compararse entre miembros de la familia Trypanosomatidae.

Dentro de la secuencia del maxicírculo se encontraron los ARNr 12S y 9S, de los cuales se conoce que en otras especies del parásito participan en la síntesis proteica que tiene lugar en la única mitocondria de estos kinetoplástidos (4, 19). Estos ARN son muy similares en cuanto a tamaño y ubicación en las distintas especies analizadas (Tabla 2); presentando incluso identidades en su secuencia entre 88,7 y 92,5% (Tabla 4). Al comparar con otros tripanosomátidos, si bien el ARNr 9S prácticamente conserva su tamaño, los porcentajes de identidad disminuyen a 77,7 - 82,2% (Tablas 2 y 4). Por su parte, el ARNr 12S presenta variabilidad tanto en su tamaño, con un rango del 1141 - 1173 nucleótidos (Tabla 2), como en su secuencia, con un porcentaje de identidad de 77,7 a 80,7% (Tabla 4).

Regiones intergénicas

Como se observa en la Tabla 5 se identificaron 5 regiones intergénicas que separan las secuencias codificantes de 12S y 9S, 9S y ND8, ND7 y COIII, COIII y CyB y RPS12 y ND5 para todas las especies de tripanosomátidos analizadas, observándose que en general son regiones cortas con un promedio de 34 - 94 nt con variaciones en tamaño entre las distintas especies del género de 19 - 130 nt. Tamaños que pueden obedecer a la necesidad de tener un genoma compacto; a diferencia de los genes nucleares en donde se observan regiones intergénicas extensas dada la necesidad de codificar en las mismas los elementos implicados en la regulación de la expresión espacio - temporal (39). Finalmente, a diferencia de la elevada conservación de las secuencias pre-editadas tanto en secuencia como en longitud, estas regiones presentan una mayor variabilidad, resultado de esperarse teniendo en cuenta que en líneas generales, la presión evolutiva actúa preferencialmente en las regiones codificantes y secuencias regulatorias de los genomas.

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Material Suplementario 1

5'GATCATGACCAAGATGTACCAGAGAGGTTTCGGG
AATCAGCGATTTTGATTGGGGGAACGGAGCCGTCGA
GGAAATGCCCTAGAGCTTTAGAGCGGGAGAAGAGT
TTTGGATCGACTGAAGAAAAGATCGTTTTCGGAAGG
GGAGCAGGTCCAACCTTTTGATTTCTTTGCTAATCA ]]> CATCATGTTTTGTTTTATTTTGTGTTTTGGTTGCCA
TGTATTTATGTGCACCATATATTTGTTTTATTTGGTT
GTTGTTTTATGTTATTTGATTTTTATTTGTGTTTTGTT
TAATTATTATACGAGTATTTTTTTATATTTTTTATGT
AGTTTGCTTTAACAATAAAAAAGAAATTTTAAAA
AAAAAAAAAAAAAAGAATTCCG 3'

Material suplementario 1. Localización en el inserto del clon pLb70-3U-600D (ADNc parcialmente editado del gen ND8 de L. braziliensis, número de acceso FR686353 del EMBL-EBI/GenBank) del fragmento del gen ND8 utilizado como sonda en los ensayos de Southern blot. El fragmento fue amplificado utilizando los iniciadores Lb1824 y LbND8-R, los cuales se indican en negrita y subrayado, respectivamente. En gris se señala la región de 155 nts correspondiente al extremo 5' no editado del gen.

Material Suplementario 2

2A.

2B.