AMDAR y PCR-extra-rápida para la identificación de la tottuga cabezona Caretta caretta (Testudines: Cheloniidae) utilizando el gen mitocondrial citocromo c oxidasa I (COI)

AMDAR and PCR-Extra-fast for Molecular identification of the loggerhead sea turtle Caretta caretta (Testudines: Cheloniidae) using the mitochondrial gene cytochrome c oxidase I (COI)

AMDAR e PCR extra-rápida para a identificação da Tartaruga-Comum Caretta caretta (Testudines: Cheloniidae), utilizando o gene mitocondrial citocromo c oxidase I (COI)

Daniel Lancheros-Piliego¹, Javier Hernández Fernández^1*

^*Edited by Alberto Acosta
¹Universidad Jorge Tadeo Lozano. Facultad de Ciencias Naturales e Ingeniería. Departamento de Ciencias Naturales y Ambientales. Grupo de investigación "GENBIMOL" Genética, Biología Molecular y Bioinformática, Carrera 4 No. 22-61, Bogotá, Colombia

Received: 03-09-2013 Accepted: 07-11-2013 Published on line: 18-11-2013

Para citar este artículo / To cite this article

Citation: Lancheros-Piliego D, Hernández Fernández J (2013) AMDAR y PCR-extra-rápida para identificación de la tortuga cabezona Caretta caretta (Testudines:Cheloniidae) utilizando el gen mitocondrial citocromo c oxidasa I (COI). Universitas Scientiarum 18(3): 321-330 doi: 10.11144/Javeriana.SC18-3.apit

Para identificación molecular de tortuga cabezona Caretta caretta, se utilizó Amplificación Mitocondrial DNA y Análisis de Restricción y PCR Extra-rápida. Se obtuvo muestras de sangre de juveniles de C. caretta de playa Don Diego (Magdalena; n=4) e Islas Del Rosario (Bolívar; n=2) en el Caribe colombiano. Se aisló DNA, se estandarizó la amplificación del gen mitocondrial citocromo c oxidasa I (COI) por PCR extra-rápida, obteniendo fragmentos de 650 pares de bases, disminuyendo en un tercio el tiempo de reacción. El producto amplificado de COI se analizó con enzimas HindIII, HyCH4III y MseI generando perfil electroforético que al compararlo in silico con secuencias para otras especies de tortugas marinas; permitió identificar patrón específico para la tortuga cabezona. Las secuencias nucleótidicas se analizaron con BLAST y similaridad entre 97-99 % con C. caretta en cinco secuencias y 92 % en otra. La información de tortugas muestreadas fue integrada en base datos BOLD y se generó el código de barras. La metodología descrita para identificación de C. caretta es procedimiento rápido y bajo costo que minimiza el tiempo de PCR mejorando su especificidad.

Palabras clave: Caretta caretta; PCR extra-rápida; Citocromo c oxidasa I (COI); AMDAR; Código de barras.

Abstract

We molecularly identified the loggerhead turtle Caretta caretta using high-speed PCR amplification and restriction analysis of mitochondrial DNA. We isolated the DNA from blood from juvenile C. caretta from Don Diego beach (Magdalena; n=4), in Islas Del Rosario (Bolívar; n=2) in the Colombian Caribbean. By using high-speed PCR amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase I (COI), we reduced reaction by one third and obtained fragments of 650 base pairs. We analyzed the amplified IOC product using enzymes HindIII, HpyCH4III and MseI and generated an electrophoretic profile, which compared in silico to other sea turtle species sequences, revealed the loggerhead's specific pattern. We found similarity between 97-99% with C. caretta in five of the BLAST analyzed nucleotide sequences and 92% in another. We generated a bar code for the sampled turtle information and sequences and stored them in the BOLD database. The methodology described for the identification of C. caretta is a fast and inexpensive procedure that minimizes time and improves PCR specificity.

Keywords: Caretta caretta; High-speed PCR; Cytochrome c oxidase I (COI); AMDAR; Barcode.

Resumo

Identificámos molecularmente a tartaruga-comum Caretta caretta usando PCR amplificado de alta-velocidade e análise de ADN mitocondrial restrito. Isolámos o ADN do sangue de juvenis C. carreta das praias Don Diego (Magdalena ; n=4), das Ilhas del Rosario (Bolívas; n=2) no Caribe Colombiano. Ao utilizar a amplificação por PCR de alta velocidade da citocromo c oxidase I (COI ), reduzimos a reacção a um terço, e obtivemos fragmentos de 650 pares de bases. Analisámos o produto IOC amplificado com as enzimas de restrição HindIII , HyCH4III e MseI e gerámos um perfil eletroforético, que comparado em silico com outras seqüéncias de espécies de tartarugas marinhas, revelou padrão específico à tartaruga-comum. Encontramos semelhanças entre 97-99 %, com C. caretta em cinco das seqüéncias de nucleotídeos BLAST analisados e 92% com outro. Gerámos um código de barras para a informação e seqüéncias das tartaruga amostradas e foram armazenados na base de dados BOLD. A metodologia descrita para a identificação de C. caretta é um procedimento rápido e barato, que minimiza o tempo e melhora a especificidade da PCR.

Palavras-chave: Caretta caretta; PCR de alta velocidade; Citocromo c oxidase I (COI); AMDAR; Código de barras.

Introducción

La UICN (2013) cataloga a la tortuga cabezona en peligro A1 de extinción y al igual que las demás especies de tortugas marinas está protegida por leyes nacionales y acuerdos internacionales que pretenden mitigar la disminución de hembras anidantes por causas de origen antrópico (Barreto 2011, SWOT 2012, IUCN 2013). El declive de las poblaciones de esta tortuga en el Caribe colombiano es un fenómeno recurrente (Amorocho 2003, Invemar 2003, Barreto 2011). Ese declive poblacional está ocurriendo debido a factores como comercialización de la carne, los huevos, los caparazones y el aceite de las tortugas para el consumo humano (Rueda 2001, SWOT 2012), a esto se suma la captura incidental por pesquerías industriales y artesanales y la pérdida del hábitat (Eckert et al. 2000, Barreto 2011) y la polución marina (Barreto 2011, SWOT 2012).

El proyecto Barcode of life (código de barras del DNA), es la mayor iniciativa genómica mundial para inventariar la biodiversidad del Planeta (Herbert et al. 2004). En los últimos años se ha convertido en uno de los programas internacionales más importantes para la identificación molecular de gran cantidad de especies (Herbert et al. 2004, Herbert et al. 2003, Hubert et al. 2008). Este proyecto sugiere que un fragmento de 648 pb de la región del gen mitocondrial citocromo c oxidasa subunidad I (COI o coxl), puede servir como etiqueta molecular, convirtiéndose en un código de barras para la identificación de especies animales (Herbert et al. 2003). Sin embargo, Naro_Maciel et al. (2010) reportaron un fragmento de 815 pb del COI para identificar las siete tortugas marinas que habitan los océanos Atlántico y Pacifico. El gen COI constituye el fundamento de los códigos de barras de DNA debido a que su tasa de mutación permite estudiar la biodiversidad de modo eficiente por que la secuencia de nucleótidos se conserva a nivel intraespecífico y es variable a nivel interespecífico (Hubert et al. 2008). Utilizando esta metodología, a Octubre del año 2013, la página WEB del proyecto tiene un reporte de 2.615.761 códigos de barras que describen 192.670 especies (Sujeevan & Hebert 2007). El código de barras para especies amenazadas facilita un sistema de identificación de organismos, que permite clasificar de manera rápida, simple y rentable diferentes muestras de especímenes saqueados, comercializados y capturados ilegalmente (Hajibabaei 2012, Naro-Maciel et al. 2010). Esta iniciativa mejora el conocimiento taxonómico, que es clave para el desarrollo de estrategias de conservación adecuadas (DeSalle & Amato 2004).

La identificación molecular es de gran utilidad en biología de la conservación, en cuanto a censos de biodiversidad y cuando los métodos tradicionales son ineficaces, como en la identificación de huevos, formas larvarias, o en el análisis del contenido del estómago o los excrementos para determinar redes alimentarias (Stoeckle 2003). Además pueden ser potencialmente empleados en casos forenses para identificar muestras de tejidos obtenidos a partir del comercio ilegal o el uso de huevos y la carne (Hajibabaei et al. 2006). Los Códigos de barras de ADN también son aplicables en la investigación de campo para la identificación de los nidos perdidos y tortugas varadas en las playas que con frecuencia se encuentran en un avanzado estado de descomposición, lo que complica la identificación de especies correctamente. Otra posibilidad es la rápida identificación de híbridos interespecíficos, que puede ser tan frecuente, como el 45 % de la población de E. imbricata de Bahía, Brasil (Lara-Ruiz et al. 2006, Sarah et al. 2009).

Considerando la importancia ecológica y socio-cultural que tiene la tortuga caguama y su afectación por el tráfico ilegal y la pérdida del hábitat, esta investigación tuvo como fin establecer metodología rápida, de bajo costo y efectiva para identificar especímenes de C. caretta utilizando la etiqueta molecular representada por el gen mitocondrial COI. A su vez, se colaboró con la Librería de Códigos de barras documentando la biodiversidad en el Caribe Colombiano.

Materiales y Métodos

Obtención de muestras: Se recolectaron muestras de la sangre periférica de dos hembras adultas y cuatro juveniles de C. caretta provenientes de dos zonas en el Caribe Colombiano: La playa de anidación Don Diego en zona de influencia del PNNT (N=4), departamento del Magdalena y la isla San Martín de Pajarales en el PNNCRSB, departamento de Bolívar (N=2). Las muestras se obtuvieron a nivel del seno cervical siguiendo la metodología de Dutton (1996) y fueron almacenadas en tubos estériles con solución 0.1 M Tris-EDTA (Greiner Bio-one^®, Kremsmünster, Austria) para transportarlas en refrigeración hasta el Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Jorge Tadeo Lozano en Bogotá, donde se preservaron a 4° C.

Extracción de DNA: El DNA genómico se obtuvo utilizando el kit de extracción UltraClean^TM Tissue & Cells DNA Isolates siguiendo el protocolo suministrado por la casa comercial fabricante (MO BIO Laboratories, Inc, California, EE.UU.). Las extracciones fueron reveladas por electroforesis en gel de agarosa al 1 % p/v en solución tampón TBE 0.5X con tinción de bromuro de etidio (2 μg/ml) en una cámara horizontal GelXL UltraV-2 (Labnet International, Inc. New Jersey, EE.UU.). El resultado de la separación fue registrado con el fotodocumentador UVP GelDoc-It^TM System (UVP, Upland, EE.UU.) utlizando luz UV y se analizó con el programa Vision Works^® LS Image Acquisition and Analysis Software (Imaging system, EE.UU.).

Amplificación del gen mtDNA citocromo c oxidasa I por PCR-Extra rápida: Para amplificar el gen mtDNA COI citocromo c oxidasa I por PCR Extra-rápida se realizó la reacción como se describe previamente (Liu & Shearn 1995, Mariño et al. 1996) y se completó un ensayo con el objetivo de disminuir en la PCR los tiempos de denaturación, hibridación y extensión desde 1 minuto hasta 1 segundo cada uno. Fueron utilizados los primers-oligonucleótidos heterológos VF2 (5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3') y VR1 (5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'), publicados previamente (Ward et al. 2005, Ivanova et al. 2007) y diseñados para amplificar el gen COI en la tortuga Chelonia mydas (Wang et al. 2012). La reacción de PCR Extra-rápida se realizó utilizando el termociclador de bloque PTC-100^TM Programmable Thermal Controller (MJ Research, Madison, EE.UU.) en mezclas de reacción con volumen final de 25 μ, las cuales contenían cada una 20 ng de DNA, 0.5 mM de cada primer-oligonucleótido, 1.5 mM MgCl2, 1 U de Taq Polimerasa (Bioline Inc., California, EE.UU.), 200 mM de cada dNTP's (Bioline Inc., California, EE.UU.) y solución PCR-tampón 1X (50 mM KCl y 10 mM Tris-HCl pH 8,3). Los parámetros de amplificación incluyeron desnaturalización 2 min a 94°C, seguida por 35 ciclos de 94°C por 1s, 53°C por 1s y 72°C por 1s, finalizando con una extensión de 10 min a 72°C.

Para determinar la calidad de los productos de la PCR Extra-rápida, 2 μ de cada amplificado fueron mezclados con el mismo volumen de tampón de carga (30 % Glicerol y 0.05 % Azul de bromofenol p/v) y esta mezcla se sirvió en los pozos de un gel de agarosa al 1 % (p/v) en TBE 0,5X. El gel fue teñido con bromuro de etidio (2 μg/ml). La amplificación del gen COI de C. caretta fue verificada evidenciando en el gel la presencia de una única banda de 650 pares de bases (bp) utilizando el marcador de peso molecular Hiperladder II (Bioline Inc., California, EE.UU.). El proceso fueregistrado con el fotodocumentador UVP Gel-Doc-IT^TM System (UVP, Upland, EE.UU.) y analizado con el programa Vision WorksLs (Imaging system, EE.UU.).

Secuenciación del COI de C. caretta: Para obtener la secuencia nucleotídica del gen COI de C. caretta, 25 μ de cada uno de los productos purificados de la PCR Extra-rápida junto con los oligonucleótidos VF2 y VR1 fueron secuenciados automáticamente en ambas direcciones (5'-3' y 3'-5') utilizando el método tagDye Deoxy Terminator Cycle-sequencing en un secuenciador 3730XL (Applied Biosystems).

Análisis in silico y experimental por AMDAR del gen mtDNA COI: Se realizó un análisis AMDAR (Amplificación Mitocondrial de DNA y Análisis de Restricción) in silico con datos de secuencias del gen COI de tortugas de la familia Cheloniidae previamente publicados en las bases de datos BOLD-MAS (http://www.boldsystems.org/views/login.php) y GENBANK (http://www.ncbi.nlm.nih.gov; (Tabla 1) utilizando las enzimas de restricción HindIII, HpyCH4III y MseI. Para este análisis se utilizó la herramienta en línea NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php de New England BioLabs^®, Inc. Ipswich, EE.UU.) la cual permite utilizar enzimas de restricción para cortar una secuencia de DNA y finalmente generar mapas de restricción corriendo una electroforesis virtual y producir el perfil de cada especie (Vincze et al. 2003). Estas huellas moleculares obtenidas in silico fueron utilizadas para hacer comparaciones con el análisis AMDAR in vitro obtenido experimentalmente.

Para obtener in vitro la huella dactilar del gen mtDNA COI de C. Caretta se realizaron cuatro restricciones enzimáticas sobre el producto de amplificación obtenido por PCR Extra-rápida utilizando las mismas enzimas que en el análisis in silico y siguiendo el protocolo de la casa comercial fabricante (INVITROGEN CORP, California, EE.UU.). Las enzimas fueron utilizadas para cortar individualmente y en conjunto los amplicones del gen COI y los perfiles producidos fueron revelados en gel de agarosa al 2 % p/v. El proceso fue registrado con el fotodocumentador UVP Gel-Doc-IT^TM System (UVP, Upland, EE.UU.) y análizados con el programa Vision WorksLs (Imaging system, EE.UU.).

La información generada en ambos procedimientos fue analizada de acuerdo a la cantidad de bandas y el peso molecular de los fragmentos de corte que se produjeron.

Generación del código de barras: Las secuencias obtenidas por PCR Extra-rápida del gen mtDNA COI de C. caretta fueron ensambladas con el programa CLC DNA WorkBench 5.6.1 (CLC Bio, Dinamarca). La comparación e identificación a nivel de género y especie de cada una de las secuencias fue realizado con la herramienta de Búsqueda de Alineamiento Básico Local, BLAST (Altschul et al. 1997).

Resultados y Discusión

El DNA genómico aislado a partir de las muestras de sangre de las seis tortugas procedentes del Caribe colombiano fue viable, obteniéndose concentraciones entre 80-95 μg/ml. Por su parte, las amplificaciones del gen COI realizadas por PCR Extra-rápida mostraron una buena resolución en la electroforesis con bandas de 648 bp (Figura 1). Estos productos amplificados se utilizaron seguidamente, en análisis de restricción enzimática y posteriormente en secuenciación.

Identificación molecular por AMDAR del gen mitocondrial COI: Se realizó un análisis AMDAR (Amplificación Mitocondrial de DNA y Análisis de Restricción) in silico utilizando secuencias del gen mitocondrial COI de las siete especies de tortugas marinas realizando restricción con las enzimas HindIII, HpyCH4III y MseI. El objetivo del análisis fue identificar las secuencias a nivel de especie mediante la obtención de patrones de bandeo in silico distintivos para cada taxón. Los perfiles electroforéticos obtenidos del gen COI para las siete especies de tortugas marinas mostraron diferencias observables, que permitían en principio la identificación de Caretta caretta (Figura 2a). Se obtuvieron como resultado cinco patrones de bandeo diferentes al analizar los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción para las 7 tortugas evaluadas (Figura 2a). Dos de estos perfiles electroforéticos fueron compartidos por dos especies cada uno y los otros tres perfiles fueron únicos para las especies C. caretta, L. kempii y D. coriacea. Para C. caretta los fragmentos de restricción obtenidos fueron de 228, 147, 139, 76 y 48 pb. Para L. kempii fueron de 458, 179, 82 y 15 pb y para D. coriacea fueron de 274, 194, 103 y 82 pb. Por su parte C. mydas y N. depressus obtuvieron idéntico patrón electroforético revelando fragmentos de 335, 194, 103 y 82 pb. De la misma forma E. imbricata y L. olivacea obtuvieron idéntico patrón de restricción mostrando fragmentos de 458, 194 y 82 pb.

El AMDAR in vitro realizado con los productos amplificados del gen COI de C. caretta por PCR Extra-rápida con una mezcla de las enzimas HindIII, HpyCH4III y MseI produjo un perfil electroforético con los fragmentos de restricción predichos por el análisis AMDAR in silico, conformado por cuatro bandas con pesos de 228, 147, 139 y 76 pb aproximadamente (Figura 2b).

Identificación molecular por código de barras: Se obtuvieron las secuencias nucleótidicas de cada uno de los amplicones. Mediante análisis con BLAST se detectó para las seis secuencias la filiación comparando con secuencias previamente descritas para Caretta caretta en GenBank y BOLD, la composición media de Guanina y Citocina (GC) fue del 44.99 % ± 0.489.

En el análisis de similitud realizado con el Motor taxonómico de BOLD, las secuencias mostraron niveles altos de homologías con códigos de barras de tortugas marinas previamente registrados en la base de datos. Las secuencias nucleótidicas de las seis muestras fueron identificadas como pertenecientes a la especie Caretta caretta con valores de similitud porcentual altos (> 97).

Los sitios variables en las secuencias del mismo gen se acumulan de manera natural en el genoma de los organismos y su estudio se ha modelado matemáticamente para ilustrar y explicar la evolución de las mutaciones en las secuencias de nucleótidos de DNA. La divergencia media intraespecífica, calculada como la cantidad de posiciones variables encontrada sobre el número total de posibles cambios fue 0.036 % (Tabla 2) cifra inferior al 0,9 % encontrado por Naro-Maciel et al. (2010) para Caretta caretta en la costa de Brasil, y por otra parte, la divergencia media interespecífica con respecto a L. olivacea, (la especie más cercana según el análisis de COI) fue del 7,2 % comparado con 6,3 % reportado por Sarah et al. (2009).

Deben utilizar los mismos juegos de primers o iniciadores oligonucleótidos para la amplificación por PCR del gen mtDNA COI (Allard et al. 1994, Dutton 1996, FitzSimmons et al. 1997). En este caso y con los cebadores seleccionados los códigos de barras discriminaron los especímenes de C. caretta de las demás especies de tortugas marinas y claramente abren la posibilidad de evaluar su utilidad para identificar específicamente huevos, neonatos, juveniles y adultos así como carne, aceite, piel, huesos y caparazones para evitar la depredación y el tráfico ilegal de esta especie.

Las secuencias del COI para las seis tortugas evaluadas se registraron en la base de datos de BOLD Systems con los números de acceso CCOL001-10 a CCOL006. Con los datos de las secuencias y el análisis de las distancias se desarrolló el código de barras de la tortuga C. caretta permitiendo su caracterización hasta el nivel de especie en forma confiable y rápida. Este resultado concuerda con diversos estudios del gen COI en tortugas marinas (Sarah et al. 2009, Naro-Maciel et al. 2010) y en diversos grupos animales (Herbert et al. 2004, Hubert et al. 2008, Sinniger et al. 2008, Schander & Willassen 2005).

Conclusión

El gen COI puede ser amplificado por PCR Extra rápida y es un marcador molecular idóneo para la identificación específica de la tortuga cabezona Caretta caretta. El proceso taxonómico puede ser abordado de dos maneras tras conseguir las amplificaciones de COI: Primero el patrón de bandeo obtenido con AMDAR utilizando las enzimas HindIII, HpyCH4III y MseI presentó una huella dactilar que diferenció a C. caretta de las demás especies de tortugas marinas en análisis computacionales y es una metodología rápida y económica. El proceso de secuenciación presentó información suficiente para generar el código de barras y es una herramienta útil que ofrece la posibilidad de estudiar la diversidad en el grupo de los Chelonios marinos. Antes de este estudio no estaban disponibles métodos analíticos precisos en Colombia que permitieran identificar esta especie amenazada, este estudio contribuye proporcionando una herramienta para el avance de las investigaciones científicas y los programas de conservación de la especie en el Caribe colombiano, creando la necesidad de evaluar la utilidad de los marcadores AMDAR y Código de barras del gen mtDNA COI para la identificación taxonómica de muestras de otro tipo de tejidos de neonatos, juveniles y adultos, así como huevos y productos derivados de la especie.

Con el método descrito en esta investigación la identificación de la tortuga marina C. caretta se convierte en un procedimiento rutinario, rápido y de costo efectivo ya que no precisa de taxónomos especializados para obtener resultados confiables y puede ser ultimado en pocas horas tras la obtención de las muestras.

Agradecimientos

Agradecemos al Oceanario CEINER en la isla de St. Martin Pajarales y al Acuario y Museo del Mar en Santa Marta Rodadero para la colaboración en la obtención y suministro de muestras de la tortuga cabezona Caretta caretta para el desarrollo de este estudio. A la Dirección de Investigación, Creatividad e Innovación de la UJTL por la financiación. Las muestras fueron obtenidas bajo permiso de investigación concedido por el Ministerio de Medio Ambiente y Desarrollo Territorial (N ° 24, de 22 de junio de 2012) y el Contrato de Acceso a los Recursos Genéticos (N° 64, de 23 de abril de 2013).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

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