Con un tiempo de inmersión de 15 min. se obtuvo a las 18 semanas de cultivo el mayor número total de microtubérculos por SIT y el mayor número de microtubérculos aprovechables como material vegetal de plantación con diferencias significativas respecto al resto de los tiempos de inmersión evaluados (figura 1). Los microtubérculos aprovechables formados en el tiempo de inmersión de 15 min. presentaron, además, el mayor contenido de materia seca con diferencias estadísticas significativas en comparación con los formados en el resto de los tiempos de inmersión (figura 2).
En cuanto al tiempo de contacto del material vegetal con el medio de cultivo, con un tiempo de inmersión de 15 min se obtuvo también mayor posibilidad de que las plantas in vitro asimilaran los nutrientes del medio de cultivo, en comparación con un tiempo de inmersión de 10 min. Este mayor tiempo de contacto de las plantas in vitro con el medio de cultivo propició la mayor acumulación de sustancias de reserva en los microtubérculos, reflejado en los más altos valores para la masa fresca y seca de los mismos. Sin embargo, investigadores como Martre et al. (2001) han descrito que prolongados periodos de inmersión inducen estrés respiratorio y oxidativo en el material vegetal. En sus investigaciones consideraron que un tiempo de contacto del material vegetal con el medio de cultivo de apenas un minuto por encima del tiempo de inmersión, en el cual se logró la mayor tasa de crecimiento relativo de Hevea brasiliensis, fue suficiente como para causar una alta actividad de la superoxidasa dismutasa y de la peroxidación de los lípidos de las membranas provocando daños celulares. Esto debió haber ocurrido en las plantas de ñame cultivadas durante prolongados periodos de inmersión (20 y 25 min), y quizás esta fue la causa de los menores resultados en la formación de los microtubérculos en comparación con un tiempo de inmersión de 15 min, en el cual se obtuvieron la mayor formación de los microtubérculos de ñame y la formación de un mayor número de microtubérculos aprovechables como material vegetal de plantación en comparación con los obtenidos en el resto de los tiempos de inmersión evaluados. Lo anterior demuestra la necesidad de determinar el tiempo de inmersión para cada una de las especies y fases de cultivo en la micropropagación, pues del ajuste del tiempo de inmersión depende en gran medida la eficiencia del empleo de los SIT (Berthouly y Etienne, 2005; Escalona, 2006). Efecto de la frecuencia de inmersión en la formación de los microtubérculos En la formación de los microtubérculos, cuando se empleó en el SIT la frecuencia de inmersión cada 6 horas, se obtuvieron los mejores resultados para las variables evaluadas, con diferencias significativas respecto al resto de las frecuencias de inmersión (tabla 2). McAlister et al. (2005) y Mehrotra et al. (2007) han descrito que la frecuencia de inmersión influye en la renovación de la atmósfera interna del frasco de cultivo, así como en la disponibilidad y asimilación por el material vegetal del medio de cultivo, según el estado de desarrollo del mismo. Por lo anterior, se hace necesario determinar la frecuencia de inmersión según la fase de cultivo para satisfacer los requerimientos del material vegetal (Escalona, 2006). Con relación al número total de microtubérculos formados por SIT, y al número de microtubérculos aprovechables como material vegetal de plantación, también se obtuvieron con una frecuencia de inmersión cada 6 horas los mejores resultados, con diferencias significativas respecto al resto de las frecuencias de inmersión evaluadas (figura 3). Los microtubérculos aprovechables formados con una frecuencia de inmersión cada 6 horas presentaron, además, el mayor contenido de materia seca con diferencias estadísticas significativas en comparación con los formados en otras frecuencias de inmersión (figura 4). Influencia del volumen de medio de cultivo por planta cultivada in vitro en la formación de los microtubérculos En la formación de los microtubérculos se alcanzaron los mejores resultados al emplear un volumen de 60 ó 90 mL de medio de cultivo por planta cultivada in vitro en el SIT, sin diferencias significativas entre ellos para las variables evaluadas, excepto para la masa seca de los microtubérculos, en la cual se presentaron diferencias significativas entre ambos. Las plantas cultivadas en estos volúmenes de medio de cultivo presentaron diferencias significativas respecto a los demás volúmenes empleados (tabla 3). En cuanto al mayor número de microtubérculos formados por frasco de cultivo de inmersión temporal, con un volumen de 60 ó 90 mL de medio de cultivo por planta in vitro se obtuvieron los mejores resultados a las 18 semanas de cultivo sin diferencias significativas entre ellos, pero sí con respecto al resto de los volúmenes de medio de cultivo por planta in vitro evaluados. El mayor número de microtubérculos aprovechables como material vegetal de plantación se alcanzó con 60 mL de medio de cultivo por planta in vitro cultivada en el SIT, con diferencias significativas respecto al resto de los volúmenes de medio de cultivo evaluados (figura 5). Los microtubérculos aprovechables obtenidos con el empleo de un volumen de 60,0 mL de medio de cultivo por planta in vitro presentaron el mayor contenido de materia seca con diferencias significativas respecto al resto de los volúmenes evaluados por planta in vitro (figura 6). Según Pérez et al. (2001), el volumen de medio de cultivo por planta cultivada influyó en la producción de microtubérculos de papa en SIT. Estos investigadores, con un volumen de 50 mL de medio de cultivo por planta cultivada, propiciaron que en cada inmersión un mayor número de yemas axilares recibieran el estímulo inductor del medio de cultivo. Con ese volumen de medio de cultivo obtuvieron como resultado la formación de 280 microtubérculos por frasco de cultivo. Piao et al. (2003) también estudiaron cinco diferentes volúmenes de medio de cultivo para la tuberización de la papa en un biorreactor de inmersión temporal y obtuvieron, igualmente, con un volumen de 50 mL de medio de cultivo por planta in vitro, un incremento en la masa fresca de los microtubérculos. Con ese volumen de medio de cultivo por planta cultivada in vitro lograron obtener de los microtubérculos formados un 55% de microtubérculos con una masa fresca superior a 1,0 g. Estos investigadores, cuando emplearon volúmenes superiores de medio de cultivo por explante, evidenciaron la formación de microtubérculos con apariencia acuosa debido a la carencia de oxígeno. Estos resultados apoyan los del presente trabajo para la tuberización in vitro en el cultivo del ñame. El volumen de medio de cultivo que se debe emplear por esqueje en la tuberización de la papa en inmersión temporal está determinado, según Jiménez (2005), por el volumen del frasco de cultivo, así como por el tiempo y la frecuencia de inmersión empleados. Este investigador empleó un volumen de 75,0 mL de medio de cultivo por esqueje y produjo microtubérculos de papa a gran escala en frasco de cultivo tipo Clearboys de 10,0 L de capacidad. Conclusiones Se desarrolló por primera vez un protocolo para la formación de microtubérculos de ñame clon Pacala Duclos en sistema de inmersión temporal conformado por frasco de cultivo de 10 L de capacidad. Se logró la mayor formación de microtubérculos aprovechables como material vegetal de propagación con un tiempo de inmersión de 15 min cada 6 horas y con el empleo de un volumen de 60 ml de medio de cultivo por planta in vitro. Referencias bibliográficas 1 Berthouly, M.., Etienne, H. 2005. Temporary immersion systems: a new concept for use liquid medium in mass propagation. En: Hvoslef-Eide, A. K. y Preil, W. (eds.). Liquid Culture Systems or in vitro Plant Propagation. Netherlands: Springer. pp. 165-195. [ Links ] 2 Chakrabarty, D., Dewir, Y.H., Hahn, E.J., Datta, S., Paek, K.Y. 2006. The dynamics of nutrient utilization and growth of apple root stock ‘M9 EMLA’ in temporary versus continuous immersion bioreactors. Plant Growth Regulation 43: 184-189. [ Links ] 3 Chen, F.Y., Wang, D., Gao, X., Wang, L. 2007. The effect of plant growth regulators and sucrose on the micropropagation of Dioscorea nipponica makino. Plant Growth Regulation 26: 38-45. 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Como no fue posible encontrar referencias respecto al efecto del tiempo de inmersión en el SIT sobre la formación de microtubérculos de ñame, los resultados se discuten con los logrados por investigadores como Teisson y Alvard (1999) y Pérez (2001), quienes evaluaron varios tiempos de inmersión en la producción de microtubérculos de papa en SIT. Teisson y Alvard (1999), en el sistema de cultivo tipo RITA, obtuvieron los mejores resultados con un tiempo de inmersión de 60 min. Mientras, Pérez (2001), en el SIT conformado por frasco de cultivo de 3500 mL de capacidad obtuvo con 2 min de inmersión las mejores respuestas en la formación de los microtubérculos para las variables evaluadas: número de microtubérculos por frasco de cultivo, peso freso y diámetro de los mismos. Según estos investigadores, con ese tiempo de inmersión se logró en cada uno de los sistemas de cultivo en función de los requerimientos de las plantas un ambiente gaseoso favorable para el proceso de tuberización, debido a que fue posible mantener en el interior del frasco de cultivo una concentración de oxígeno y dióxido de carbono cercana a la concentración atmosférica, y se logró remover completamente la acumulación de etileno de la atmósfera interna del mismo. Estas condiciones de cultivo que favorecieron el proceso de microtuberización en el cultivo de la papa se debieron haber presentado durante la formación de microtubérculos de ñame en el SIT con un tiempo de inmersión de 15 min.
