ARTÍCULO CORTO
Diversidad de levaduras asociadas a chichas tradicionales de Colombia
Yeast diversity associated to Colombian traditional "chichas"
William Andrés López-Arboleda1 , Mauricio Ramírez-Castrillón1 , Luz Adriana Mambuscay-Mena1 , Esteban Osorio-Cadavid2
1 Grupo de Investigación en Biología Molecular de Microorganismos, Universidad del Valle, A.A. 25360. Cali-Colombia. E-mail: willi8702@gmail.com, mauriciogeteg@gmail.com, luza607@gmail.com
2 Profesor Titular sección de Genética, Departamento de Biología, Universidad del Valle, Cali-Colombia. E-mail: esteban.osorio@correounivalle.edu.co
Recibido: marzo 25 de 2010 Aprobado: noviembre 5 de 2010
Resumen
]]> En Colombia el conocimiento de la comunidad levaduriforme ha sido limitado, ya que los estudios se han enfocado principalmente en especies de interés clínico. Las fermentaciones espontáneas a partir de diversos sustratos representan hábitats de gran importancia para el estudio de la dinámica de las poblaciones de levaduras nativas, por esta razón, en el presente estudio se aislaron e identificaron las levaduras asociadas a las chichas de maíz, piña y arracacha, que son bebidas fermentadas de manera artesanal en Colombia.Se realizó el aislamiento de las levaduras más representativas de la chicha durante sus tres fases de fermentación: inicial, tumultuosa y final. Inicialmente, se hizo una caracterización parcial de los aislados, que incluyó pruebas fisiológicas, y medición de su capacidad para producir filamentos y esporas. Sin embargo, debido a que estas técnicas no fueron suficientes para identificar los aislados hasta el nivel taxonómico de género o de especie, se complementó el estudio de cada aislado empleando técnicas moleculares basadas en el análisis de restricción del gen rRNA 5.8S y los espaciadores transcritos internos (ITS1 e ITS2). Cuando el empleo de esta técnica no permitió obtener resultados definitivos y para confirmar las asignaciones realizadas usando PCR-RFLPs, se secuenció el dominio D1/D2 del gen 26S rRNA de los aislados más representativos.
Mediante estas técnicas se lograron identificar las especies más representativas de los tres tipos de chicha: Candida tropicalis, Pichia kluyveri, Pichia guilliermondii, Hanseniapora guilliermondii, Pichia fermentans, Saccharomyces cerevisiae, Candida maltosa, Rhodotorula glutinis, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora uvarum, Kazachstania exigua, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lypolitica, Candida parapsilosis, Debaromyces hansenii, Cryptococcus arboriformis, Saccharomyces martiniae, Dekkera anomala, Aureobasidium pullulans y Candida pseudointermedia. La caracterización preliminar de los aislados obtenidos, basada en pruebas de tolerancia a etanol y halo-tolerancia, permitió identificar levaduras nativas con posible utilización biotecnológica en el sector industrial.
Palabras clave: Levaduras, diversidad, chicha, identificación molecular, biotecnología
Abstract
In Colombia, knowledge about yeast communities has been limited because most reports have focused on yeast species with clinical relevance. The spontaneous fermentation of different substrates creates important habitats for analyzing wild yeast populations; for this reason, in this study we isolated and identified yeasts associated with the "chichas" of corn, pineapple, and "arracacha," which are traditional fermented Colombian beverages.
The most representative yeasts were isolated from "chicha" during its three phases of fermentation: initial, tumultuous and final. Initially, we made a partial characterization of isolated yeasts, including macroscopic and microscopic descriptions, physiological tests, and measurement of capacity for producing spores and filaments. However, because these techniques were not sufficient for identification of isolated yeasts to the level of genus and species, the study was complemented by using molecular techniques based on restriction analysis of the ITS1-5.8S rRNA gene-ITS2. When this technique did not permit us to obtain positive results and confirm the PCR-RFLP results, we used the sequence of the D1/D2 domain of the 26S rRNA gene instead for most representative isolates.
With these techniques, we identified the most representative yeast species of the three classes of "chicha": Candida tropicalis, Pichia kluyveri, Pichia guilliermondii, Hanseniapora guilliermondii, Pichia fermentans, Saccharomyces cerevisiae, Candida maltosa, Rhodotorula glutinis, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora uvarum, Kazachstania exigua, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lypolitica, Candida parapsilosis, Debaromyces hansenii, Cryptococcus arboriformis, Saccharomyces martiniae, Dekkera anomala, Aureobasidium pullulans and Candida pseudointermedia. The preliminary characterization of isolated yeasts, based on ethanol-tolerance and salt-tolerance tests, permitted recognition of wild yeasts for possible biotechnological uses in industry.
Key words: Yeasts, diversity, "chicha", molecular identification, biotechnology
Introducción
]]> La chicha es una bebida alcohólica tradicional producida en Colombia y otros países suramericanos como Ecuador, Perú y Bolivia (Rodríguez et al., 2005). Para la obtención de esta bebida se utilizan diferentes sustratos, tales como el maíz (Zea mays), piña (Ananas comosus), arracacha (Arracacia xanthorhriza), chontaduro (Bactris gasipaes), maní (Arachis hypogaea) y trigo (Triticum sativum) (Bristol, 1988; Cutler and Cárdenas, 1947; Hayashida, 2008). En términos generales, su preparación consta de la mezcla de la materia prima con agua, "panela" (caña de azúcar) y otros suplementos (clavos, canela, hojas de naranja), que varían de acuerdo al sustrato empleado. El proceso de fermentación puede durar de 15 a 20 días para cereales y 4 a 8 días en frutas y tubérculos, a temperatura ambiente (de 10oC a 32oC). El contenido alcohólico de la chicha varía entre 2 a 12 por ciento (v/v) (Steinkraus, 1995)A lo largo de la fermentación se presenta una dinámica y sucesión de la comunidad levaduriforme, directamente relacionada con el aumento en la concentración de alcohol y variabilidad de compuestos orgánicos. Al inicio del proceso es posible detectar la mayor diversidad de levaduras, y a medida que el proceso avanza a las fases intermedia y final aparecen levaduras que se caracterizan principalmente por su alcohol-resistencia y alto poder fermentativo como la especie Saccharomyces cerevisiae. La intervención de las diferentes especies de levaduras aportan propiedades organolépticas al producto final (Esteve-Zarzoso et al., 2001).
En Colombia se desconoce casi por completo la diversidad de levaduras asociadas a suelos, aguas, alimentos y aún a los procesos fermentativos. En este sentido, Duarte et al. (1994) evaluaron la diversidad de levaduras del género Cryptococcus presentes en árboles de Eucaliptos de Bogotá, siendo clasificadas de acuerdo a características morfológicas y bioquímicas. Vanegas et al. (2004) aislaron e identificaron levaduras nativas colombianas de los géneros Candida, Cryptococcus y Rhodotorula a partir de diferentes sustratos, usando el kit API-20C AUX. Solamente Osorio-Cadavid et al. (2008) evaluaron la diversidad de levaduras de la bebida fermentada "champús" mediante técnicas moleculares, identificando levaduras tales como S. cerevisiae, Issatchenkia orientalis, P. fermentans, Zygosaccharomyces fermentati, Torulospora delbruekii, Hanseniaspora spp., P. kluyveri var. kluyveri, y Galactomyces geotrichum.
El propósito de esta investigación fue analizar la riqueza de especies de levaduras y hongos levaduriformes asociada a la producción de tres clases de chicha. De esta forma, este trabajo representa el primer reporte sobre la caracterización por métodos moleculares de la composición de levaduras nativas, a nivel de especie, que están implicadas durante la fermentación de la chicha a partir de diferentes sustratos (piña, maíz y arracacha), en Colombia.
Materiales y métodos
Preparación de las chichas
Las chichas de maíz, piña y arracacha fueron preparadas en cinco repeticiones. La tabla 1 muestra el diagrama de flujo de la preparación de las diferentes chichas. La chicha de piña se prepara añadiendo agua y panela a cáscaras de piña, dejando fermentar espontáneamente entre 3 y 6 días. Por otro lado, para la preparación de las chichas de maíz y arracacha se debe realizar la cocción previa del sustrato antes de mezclar con otros ingredientes como la panela, clavos, entre otros, dejándose fermentar en recipientes de vidrio con tapa plástica entre 15 y 20 días para maíz y 5 a 8 días para piña y arracacha.
Aislamiento de levaduras
De cada chicha preparada se tomaron tres muestras en cada una de las fases de la fermentación: inicial (cuando todos los ingredientes estaban reunidos), tumultuosa (se presentaba burbujeo apreciable y acumulación de gas) y final (una vez finalizado el burbujeo), cada una con tres repeticiones. A partir de cada muestra, se hicieron diluciones seriadas (10-1-10-5) y de cada dilución se tomaron 100µl para la siembra por dispersión en medio de cultivo YPDA (1% extracto de levadura, 2% peptona, 2% de glucosa, 2% agar-agar) suplementado con 25mg/l de penicilina y cloramfenicol. Las placas se incubaron a 30oC durante 2 a 3 días. Un número aleatorio de cada tipo de colonia fue aislado para su posterior identificación.
]]> Caracterización fenotípicaLos aislados fueron analizados según criterios morfológicos y fisiológicos de acuerdo a las descripciones realizadas por Boekhout et al. (2004). Se evaluó la morfología celular, modo de reproducción vegetativa y caracterización fisiológica. La habilidad para fermentar (2% de fuente de carbono) y asimilar (0.5% de fuente de carbono) glucosa, maltosa, sacarosa, galactosa y xilosa fue evaluada por la acumulación de dióxido de carbono en tubos durham y turbidez en escala de Wickerham, respectivamente. Finalmente, se evaluó la halo-tolerancia (10, 15% p/v) y tolerancia a etanol (10 y 15% v/v) en medio YPDA (Boekhout et al. 2004). Todas las pruebas fisiológicas se realizaron a 30C.
Extracción y cuantificación de ADN
La extracción del ADN de levaduras se realizó utilizando la metodología descrita por Osorio-Cadavid et al. (2009). La cuantificación se realizó mediante espectrofotometría a 260nm y se determinó la pureza mediante la relación espectrofotométrica A260/A280nm.
Identificación molecular de levaduras
La identificación de los aislados fue llevado a cabo por PCR-RFLP de la región ITS1-5.8S rDNA-ITS2 como lo describe Esteve-Zarzoso et al. (1999). Para la amplificación, los primers usados fueron ITS1 (5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´) (White et al. 1990). Los productos de PCR fueron digeridos con 1U de las endonucleasas Hae III, Hinf I y Cfo I (Fermentas, USA) a 37oC por 2h.
Para la amplificación, se tomaron 7µl (aproximadamente 1ng/µl) de ADN extraído y se resuspendió en 28µl de mezcla de PCR: 0.5µM ITS1, 0.5µM ITS4, 10µM dNTPs, 1X NH4+, 1.5mM MgCl2, y 1U de Taq Polimerasa. Las reacciones fueron llevadas a cabo en un termociclador automático (M.J. Research, USA), bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94oC por 5 minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94oC por 1 min, apareamiento a 55oC por 1 min, y extensión a 72oC por 2 min, con una extensión final de 10 min a 72oC. (Esteve-Zarzoso et al., 1999). Los productos de PCR y fragmentos de restricción fueron analizados en geles de agarosa al 1.5%, en buffer TBE 1X (Tris-Borato, EDTA). Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio. Los tamaños de los fragmentos fueron estimados por comparación con un marcador de peso molecular 50-1000pb (Fermentas, USA), usando el software UVIgelStartMw v11.0©
Los patrones obtenidos fueron comparados con la base de datos de identificación rápida de levaduras Yeast-id.com del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), España. Se tomó como control positivo para análisis morfológicos, bioquímicos y moleculares la cepa comercial RH218 (ATCC) de Saccharomyces cerevisiae.
Secuenciación del Dominio D1/D2 del gen ribosomal 26S
La secuenciación del dominio D1/D2 de la subunidad grande del gen ribosomal 26S fue llevada a cabo para los grupos principales de los aislados, e identificaciones dudosas, de acuerdo a Kurtzman and Robnett (1998). Para la amplificación del dominio D1/D2 se usaron los primers NL1 (5´-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3´) y NL4 (5´-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3´). Las reacciones fueron llevados a cabo en un termociclador (Multigene-Labnet, USA) bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94oC por 5 minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94oC por 1 min, apareamiento a 55oC por 30 seg, y extensión a 72oC por 1 min, con una extensión final de 10 min a 72oC. (Osorio-Cadavid et al., 2008).
]]> Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados por la empresa MACROGEN (USA) bajo las condiciones estandarizadas por ellos. Posteriormente, las secuencias fueron ensambladas mediante el software Chromas Pro v. 1.42 ® y comparadas con las secuencias reportadas en el GenBank usando el algoritmo "Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)".Resultados
A partir de 196 cepas aisladas de levaduras y hongos levaduriformes, fueron obtenidos 22 perfiles de restricción diferentes. La tabla 2 contiene las longitudes de los amplificados por PCR y de los fragmentos obtenidos después de la digestión con las tres enzimas de restricción. Nueve de los 22 grupos fueron identificados después de comparar los pesos moleculares de los productos de restricción con la base de datos Yeast-id.com (Esteve-Zarzoso et al., 1999; Guillamón et al., 1998). Las especies asignadas para estos grupos fueron Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Pichia guilliermondii, C. parapsilosis, K. martiniae, C. maltosa, Rhodotorula glutinis, Dekkera anomala, C. pseudointermedia. Para la identificación de los demás grupos y confirmación de los anteriores, fue necesaria la secuenciación del dominio D1/D2 de la subunidad grande 26S rDNA. En total, se analizaron 50 aislados mediante esta técnica y se asignaron a nivel taxonómico de especie con homologías entre 98 y 100% usando el algoritmo BLAST de la base de datos GenBank. La identificación de los grupos II, V, VII, X, XIV y XXII fue confirmada comparando las secuencias con el GenBank. Por otro lado, los aislamientos de los otros grupos sólo pudieron ser identificados mediante secuenciación, ya que el método PCR-RFLP no lo permitió hacer. De esta forma, fueron identificadas hasta nivel de especie el 95% de las cepas estudiadas.
La riqueza y abundancia de levaduras encontradas en cada uno de los diferentes tipos de chicha de acuerdo a su fase de fermentación se muestran en la tabla 2. Las especies que presentaron mayor abundancia en las tres chichas fueron Saccharomyces cerevisiae (15%), Pichia guilliermondii (18%) y Candida tropicalis (18%). En la chicha de piña no se encontró ninguna especie que estuviera presente en las tres fases de fermentación, a diferencia de lo encontrado en las chichas de maíz (C. tropicalis) y de arracacha (H. uvarum y P. kluyveri). La especie P. kluyveri estuvo presente en la fase inicial de las tres chichas, mientras que S. cerevisiae se presentó en las fases tumultuosa y final. Especies como H. guilliermondii y P. guilliermondii fueron compartidas en la chicha de maíz y piña, y C. tropicalis en maíz y arracacha. Las demás especies (tabla 3) fueron aislados únicos para cada tipo de chicha.
En la tabla 4 se muestran las principales características de los grupos obtenidos a partir de las chichas. Entre los aislados, 96 de los 196 crecieron en una concentración de etanol del 15% (v/v), 65 presentaron filamentación, 90 fermentaron glucosa en un lapso de tiempo no mayor a 7 días, 6 toleraron concentraciones del 15% (p/v) de NaCl, y sólo 3 pudieron degradar el almidón. Por otro lado, se realizaron pruebas de asimilación de xilosa y galactosa y de fermentación de galactosa encontrando que 35 aislados fueron positivos para la asimilación de estos azúcares, y 3 lograron fermentar galactosa en menos de 7 días.
Discusión
Las bebidas fermentadas tradicionales, preparadas con variedades de sustrato (cereales, frutas y tubérculos) son de gran valor cultural en distintos lugares del mundo. Aunque la microbiota de estos productos es compleja y desconocida, se han reportado levaduras que están involucradas en diferentes tipos de alimentos y bebidas fermentadas artesanales (Zulu et al., 1997; Torner et al., 1992; Gadaga et al., 2001)
]]> En las chichas de piña y arracacha se presentó un patrón de riqueza aparentemente similar a lo reportado en otros estudios (Suarez et al., 2007; Bovo et al., 2009), que se caracteriza por la presencia de gran cantidad de especies diferentes de levaduras con pocos aislados representativos, y la dominancia casi completa por parte de S. cerevisiae al final de la fermentación. Contrario a esto, la chicha de maíz mostró una menor riqueza de especies en la fase inicial de la fermentación debido a la cocción prolongada del sustrato durante la preparación de la bebida. En la fase tumultuosa, la riqueza de especies fue similar a las otras chichas, no obstante, en la fase final no se presentó dominancia de S. cerevisiae.El análisis de los aislados mostró que, en la chicha de maíz, las especies dominantes fueron C. tropicalis, P. guilliermondii y P. fermentans. Para la chicha de piña las especies más representativas fueron P. guilliermondii y S. cerevisiae. Finalmente, en la chicha de arracacha dominaron las especies H. uvarum, P. kluyveri y S. cerevisiae. La participación de estas especies ha sido reportada en otros estudios de bebidas fermentadas (Osorio-Cadavid et al., 2008; Sefa-Dedeh et al., 1999; Jeyaram et al., 2008).
Candida tropicalis estuvo presente en las tres fases de la fermentación de la chicha de maíz y en la fase tumultuosa de la chicha de arracacha. Sefa-Dedeh et al. (1999) encontraron esta especie en "pito", una bebida fermentada tradicional de Ghana (África), que se realiza a base de cereales como el maíz y el sorgo. Su presencia en este tipo de bebidas puede estar relacionada con su capacidad de degradar carbohidratos complejos (Rodríguez et al., 2006). Por otro lado, Pichia guilliermondii fue registrado en la fase inicial y tumultuosa de las chichas de maíz y piña. Esta especie fue aislada por Morrissey et al. (2004), durante la fermentación de la cidra, Jeyaram et al. (2008) en el "hamei", un vino de arroz tradicional de la India, Zott et al. (2008), evaluando la dinámica y diversidad de levaduras no-Saccharomyces durante las etapas tempranas de la elaboración del vino. Algunas investigaciones relacionadas con la contaminación de vinos, han reportado a Pichia guilliermondii como responsable de la pérdida de varias características organolépticas importantes en vinos almacenados (Dias et al., 2003). Pichia fermentans fue aislada únicamente en las fases tumultuosa y final de la chicha de maíz. Esta especie ha sido encontrada en otros tipos de bebidas fermentadas, como el "champús" donde fue reportada como una de las levaduras fermentativas dominantes (Osorio-Cadavid et al., 2008). Clemente-Jiménez et al. (2004) identificaron esta especie durante la fermentación espontánea de 6 variedades de mosto de uvas.
Quizá la especie más reconocida, tanto en bebidas fermentadas espontáneas como inoculadas, es S. cerevisiae (Jespersen, 2003), siendo una de las de mayor interés a nivel comercial, ya que produce y tolera altas concentraciones de etanol y sintetiza compuestos volátiles que le brindan el sabor y aroma al producto final. En las bebidas estudiadas, fue registrada en las fases tumultuosa y final con alta dominancia en piña y arracacha. Omemu et al. (2007) aislaron estas cepas de "ogy", una bebida que se produce de la fermentación del maíz, sorgo o millo en los países del oeste de África. Además, Osorio-Cadavid et al. (2008), reportaron esta especie en el "champús". H. uvarum fue registrada solamente para la chicha de arracacha en las tres fases fermentativas. Mingorance-Cazorla et al. (2003) la reportan como una levadura poco resistente a altas concentraciones de alcohol, que sugiere, dependiendo de la dinámica de comunidades microbianas, una alta variabilidad de contenido alcohólico en el producto final, además, participa en la producción de ésteres (Clemente-Jimenez et al., 2004). Pichia kluyveri fue registrada en las tres chichas y en la literatura ha sido utilizada como una especie co-fermentativa en procesos de producción de bebidas fermentadas, uno de estos involucró la producción de tioles volátiles que añaden aroma y sabor al "Sauvignon Blanc" de Nueva Zelanda. Osorio-Cadavid et al. (2008) también mostraron la importancia de esta especie en la producción de compuestos volátiles, detectando la producción de caprilato de butilo en la bebida tradicional colombiana "champús". Además, Ferreira et al. (2008) resaltan la importancia de Pichia kluyveri por su alta actividad pectinolítica a lo largo de la fermentación de la pulpa y el mucílago de café.
Las propiedades de las bebidas fermentadas tradicionales son el resultado combinado de la actividad metabólica sinérgica de grupos microbianos o cepas únicas, junto con las características del proceso de producción. En los procesos de fermentación, las levaduras brindan una contribución útil para el mejoramiento del sabor y aceptabilidad del producto (Banigo et al., 1974; Odunfa and Adeyele, 1985). Nuestros resultados mostraron que las especies de levaduras y cepas aisladas de estos tres tipos de chicha colombiana, poseen una gran diversidad metabólica, que representa una fuente importante de nuevos biotipos de levaduras con potencial aplicación en la industria.
Conclusiones
Este estudio brinda información importante sobre la diversidad de la microbiota en bebidas fermentadas artesanales colombianas. Especies como Y. lipolytica y K. exigua no han sido reportadas en otras bebidas fermentadas. Los datos obtenidos en este estudio pueden ser útiles para la selección de levaduras con características deseables para la industria. Finalmente, es importante la evaluación del potencial biotecnológico de estos aislados, en futuras investigaciones.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por la Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad del Valle (CI: 7752). Se agradece al Consejo Superior de Investigaciones Científicas CSIC de la Universidad de Valencia (España) por el acceso a la base de datos Yeast-id.com. Finalmente, agradecemos a la profesora Neyla Benitez por la revisión y sugerencias de este manuscrito.
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