ORIGINAL

Aislamiento de Toxoplasma gondii a partir de líquido cefalorraquídeo de dos pacientes VIH positivos

Liliana Jazmín Cortés*, Adriana Arévalo y Sofía Duque

Grupo de Parasitología, Subdirección de Investigación, Instituto Nacional de Salud, Bogotá D.C., Colombia

Recibido el 20 de octubre de 2012; aceptado el 2 de septiembre de 2013

Resumen

Introducción: El aislamiento de T. gondii a partir de líquido cefalorraquídeo permite el diagnóstico confirmatorio de toxoplasmosis cerebral, considerada la segunda infección oportunista más importante en pacientes VIH positivos.

Objetivo: Aislar Toxoplasma gondii a partir de muestras de líquido cefalorraquídeo de dos pacientes VIH positivos con toxoplasmosis cerebral.

Materiales y métodos: Se realizó la inoculación intraperitoneal del sedimento de LCR de dos pacientes VIH positivos con toxoplasmosis cerebral en ratones ICR, se llevaron a cabo 5 pases sucesivos ciegos hasta la observación de taquizoítos de T. gondii en el exudado peritoneal mediante examen directo y coloración de extendidos con Romanowsky modificado.

Conclusiones: A pesar de que las técnicas de detección directa de T. gondii en LCR tienen una baja sensibilidad (38%) el presente trabajo permitió obtener dos aislamientos de T. gondii de dos pacientes VIH positivos con toxoplasmosis cerebral.

© 2013 ACIN. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.

PALABRAS CLAVE

Toxoplasmosis; Virus de Inmunodeficiencia humano; Modelo animal; Líquido cefalorraquídeo; Aislamiento; Colombia

Isolation of Toxoplasma gondii from cerebrospinal fluid of two human immunodeficiency virus-seropositive patients

Abstract

Background: Isolation of T. gondii from cerebrospinal fluid enables confirmatory diagnosis of cerebral toxoplasmosis, considered the second most important opportunistic infection in HIV-positive patients.

Objective: To isolate Toxoplasma gondii from samples of cerebrospinal fluid from 2 HIV-positive patients with cerebral toxoplasmosis.

Materials and methods: Imprinting control region (ICR) mice were intraperitoneally inoculated with CSF sediment from 2 HIV-positive patients with cerebral toxoplasmosis. Five of the inoculations were performed blind to successive passes. T. gondii tachyzoites were observed in these 5 inoculations in the peritoneal exudate through direct examination of the modified-Romanowsky-stained smears.

Conclusions: Although direct detection techniques of T. gondii in CSF have low sensitivity

(38%), this study was able to yield 2 T. gondii isolates in 2 HIV-positive patients with cerebral toxoplasmosis.

© 2012 ACIN. Published by Elsevier España, S.L. All rights reserved.

KEYWORDS:

Toxoplasmosis; Human Immunodeficiency Virus; Animal model; Cerebrospinal fluid; Isolation; Colombia

Introducción

Según cifras de la Organización Mundial de la Salud, 34 millones de personas viven con el VIH/SIDA en el mundo; en Colombia para el 2007 se reportaron 170.000 personas entre adultos y niños viviendo con el VIH ^1,2, quienes son afectados por infecciones oportunistas, dentro de estas se encuentra la toxoplasmosis cerebral (TC), segunda infección más común que afecta el sistema nervioso central (SNC) en pacientes infectados por VIH ³. En nuestro país, estudios relacionados con TC y VIH como el de Silva et al. ⁴ describen 27 casos de encefalitis durante los primeros años de la epidemia en Bogotá registrada entre 1988 y 1993. Otro estudio como el de Corral et al. ⁵ describe 33 casos presentados entre 1988 y 1994 en Cali. Es importante resaltar que el riesgo de desarrollar TC oscila entre 30-40% en los pacientes con anticuerpos frente a Toxoplasma gondii 6 (60% de pacientes VIH positivos), por lo que en Colombia se pueden esperar entre nueve a doce mil casos de TC ³ cuyo diagnóstico es difícil sin el uso de técnicas invasivas, lo que ha llevado a la práctica de la terapéutica presuntiva basada en hallazgos clínicos y radiológicos y su confirmación en la respuesta favorable a estos ⁷ . Sin embargo, el diagnóstico parasitológico definitivo se debe realizar evidenciando la presencia del parásito, por lo que el aislamiento de T. gondii a partir de cualquier muestra biológica contribuye a confirmar la infección activa ⁸.

Para el aislamiento de T. gondii a partir de tejidos o fluidos corporales, la inoculación en ratones ha sido considerada como el método más sensible, en comparación con el cultivo celular e inoculación en embriones de pollo ⁹. El objetivo de esta comunicación breve es documentar el aislamiento de dos cepas de T. gondii a partir de pacientes con VIH y diagnosticados por hallazgos clínicos y paraclínicos con TC, ya que en Colombia se han reportado muy pocos aislamientos de T. gondii a partir de muestras biológicas ¹⁰.

Materiales y métodos

Se obtuvo líquido cefalorraquídeo (LCR) de dos pacientes VIH positivos con toxoplasmosis cerebral (previo consentimiento informado de los pacientes y autorización de uso de muestras biológicas en estudios posteriores) y cuyas pruebas serológicas (inmunofluorescencia indirecta, IFI) fueron positivas con títulos de anticuerpos IgG frente a T. gondii de 1/2.048 y 1/4.096, respectivamente (el resultado se considera positivo a partir de 1/16).

Obtención del aislamiento clínico "in vivo"

Se centrifugó el LCR de cada paciente a 1.000 rpm durante 15-20 minutos con el fin de concentrar los parásitos, en caso de que se encontraran presentes en la muestra. Se eliminó el sobrenadante y a partir del sedimento se realizó observación directa en microscopio de luz (400x), elaboración de frotis a partir del sedimento y coloración del mismo con Romanowsky modificado e inoculación del sedimento en ratones cepa ICR-CD1.

Animales

Se utilizaron ratones machos ICR-CD1, colonia no consanguínea, nombre científico: Mus musculus, s tatus sanitario: convencional, origen: Centre Anticancereux Romand. Dr. De Coulon. Lausanne-Suiza, procedencia: Charles River Laboratories. EE. UU., Crl: CD-1(ICR) BR, color: blanco (albino), de 20 días de edad suministrados por el Bioterio del Instituto Nacional de Salud.

Inoculación en ratón

Se siguieron las normas para el cuidado y uso de animales ^11,12 para el aislamiento de T. gondii y se tuvieron en cuenta todas las normas de bioseguridad para el manejo de muestras biológicas, lo que incluye el empleo de los elementos de protección personal, la aplicación de los esquemas de vacunación fundamentales y la adecuada eliminación de material contaminado. Se inocularon los ratones ICR vía intraperitoneal (fig. 1) con 0,4 ml del sedimento obtenido luego de centrifugar el LCR (2 ratones por cada muestra y 1 ratón control sin inocular). Se observaron los ratones inoculados durante 2 semanas, tiempo en el cual no se presentó ninguna sintomatología compatible con infección. Al cabo de este tiempo los 6 ratones fueron sacrificados en cámara de CO ₂, se hizo extracción de exudado peritoneal con 2 ml de solución salina estéril (fig. 2) y este se concentró por centrifugación a 1.000 rpm por 15-20 minutos para su observación directa, elaboración y coloración de frotis con Romanowsky modificado e inoculación haciendo pase en ciego a otros 6 ratones. A partir de este material se realizaron 5 pases sucesivos (6 ratones por pase), hasta la positivización (presencia de taquizoítos de T. gondii ) .

Preservación de los aislamientos de Toxoplasma gondii

Se realizó el mantenimiento de los aislamientos parasitarios a través de pases sucesivos en ratones de la cepa ICR durante 6 meses después de los cuales se crioconservaron en nitrógeno líquido a ?196 ºC. La viabilidad poscongelamiento de los aislamientos se confirmó realizando pases sucesivos en ratón a los 10, 40 y 270 días siguientes a la crioconservación ¹³.

Resultados

Observación del sedimento de líquido cefalorraquídeo

Al realizar la observación directa en microscopio de luz (400x) del sedimento de LCR de cada paciente no se observó ninguna forma parasitaria compatible con T. gondii , igual hallazgo se encontró al examinar en microscopio de luz (1.000x) los frotis coloreados con Romanowsky modificado.

Inoculación en ratón

Los ratones inoculados con el sedimento de LCR de los pacientes no presentaron ninguna sintomatología compatible con infección toxoplásmica como piloerección, ataxia del tren posterior, hepato-esplenomegalia, letargia ni diarrea (fig. 3), durante las dos primeras semanas que fueron observados, al igual que los ratones control. Luego de los 5 pases ciegos sucesivos, a los 43 días los 2 ratones control continuaron sin presentar ninguna sintomatología, pero los 4 ratones de trabajo presentaron piloerección, hepatoesplenomegalia, letargia y en el exudado peritoneal se observaron taquizoítos de T. gondii sin que se observaran en el exudado de los ratones control, hallazgo que fue confirmado al examinar los extendidos coloreados con Romanowsky modificado (fig. 4).

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Preservación de los aislamientos de Toxoplasma gondii

Los ratones ICR inoculados con los aislamientos parasitarios obtenidos presentaron sintomatología clínica compatible con toxoplasmosis a los 3-5 días luego de inoculación intraperitoneal, el exudado peritoneal obtenido fue observado en directo en microscopio de luz (400x) evidenciándose la presencia de taquizoítos de T. gondii . Los ratones ICR inoculados para la confirmación de la viabilidad poscongelamiento presentaron síntomas compatibles con toxoplasmosis como hepato-esplenomegalia, piloerección y letargia luego de 8-10 días de inoculación, el exudado peritoneal obtenido a partir de estos ratones fue observado en directo en microscopio de luz (400x) evidenciándose la presencia de taquizoítos de T. gondii .

Discusión

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que infecta a vertebrados de sangre caliente y se estima que una tercera parte de la población humana global esta crónicamente infectada. La infección inicial ocurre oralmente tras la ingestión de ooquistes o quistes tisulares que se transforman en taquizoítos, los cuales se diseminan ampliamente en el organismo, tras el establecimiento de la respuesta inmune del huésped ocurre la diferenciación de taquizoíto a bradizoíto en sistemas y órganos específicos como el sistema nervioso central, resultando una infección asintomática crónica; en individuos con inmunodeficiencias como SIDA o con tratamientos inmunosupresivos prolongados como en el caso de trasplantes, la reactivación de la infección puede llevar a una encefalitis toxoplásmica letal ¹⁴.

Por lo general la afección del Sistema Nervioso Central (SNC) por T. gondii se considera una reactivación de una infección crónica latente que se presenta con frecuencia en pacientes con diagnóstico de SIDA pero en algunos casos es la primera manifestación de este síndrome ^15-17. Los protocolos de diagnóstico de la toxoplasmosis cerebral en pacientes con SIDA varían dependiendo de las características clínicas del paciente y de las herramientas tecnológicas con las que se cuente ¹⁸; sin embargo, esta infección es generalmente letal si el paciente no recibe el tratamiento en forma adecuada y oportuna, por lo que es fundamental un diagnóstico oportuno y confiable basado en hallazgos clínicos y radiológicos ¹⁹, teniendo en cuenta que para obtener un diagnóstico de certeza se necesitan pruebas que permitan demostrar en forma directa la presencia del parásito en cerebro (biopsia), o en muestras biológicas (LCR, sangre) a través de cultivos celulares que permiten obtener taquizoítos viables y con la pureza deseable, los cuales son una fuente de parásitos con máximo rendimiento y mínima contaminación de las células del huésped ²⁰, de inoculación en animales, técnica más sensible que el cultivo celular 9 o con la técnica de Reacción de Cadena de Polimerasa (PCR) en la cual se amplifica el ADN del parásito lográndose una alta sensibilidad (50-65%) y especificidad (95-100%); lamentablemente la falta de laboratorios preparados para realizar estas técnicas y sus altos costos pueden ser limitantes para el diagnóstico ²¹.

A pesar de que las técnicas de detección directa del parásito en sangre o LCR tales como el cultivo en células de fibroblastos o la inoculación en ratones de laboratorio consumen mucho tiempo y tienen una baja sensibilidad ^21-23 (38%) el presente trabajo permitió obtener dos aislamientos de Toxoplasma gondii de dos casos humanos de toxoplasmosis cerebral que crecen bien en ratón y que pueden ser utilizados por investigadores a nivel nacional e internacional.

Financiación

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

* Autor para correspondencia.

Correo electrónico: jcortes@ins.gov.co (L.J. Cortes).

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