Figura 1. Características macroscópicas y microscópicas presentadas por Fusarium solani en la prueba de patogenicidad. A. Micelio del hongo en la raíz de la plántula. B. Conidióforos y clamidosporas terminales.
EVALUATION OF THE BIOCONTROL CAPACITY OF TRICHODERMA HARZIANUM RIFAI AGAINST FUSARIUM SOLANI (MART.) SACC. ASSOCIATED TO THE COMPLEX “DRYER” IN PASSION FRUIT UNDER GREENHOUSE CONDITIONS
Juan Guillermo Cubillos Hinojosa1; Alberto Páez Redondo2 y Lauris Mejía Doria3
1 Microbiólogo Agroindustrial. Instructor SENA Distrito Capital. Centro Nacional de Hotelería Turismo y Alimentos. Carrera 30 No. 14- 53, Complejo Paloquemao, Bogotá. Colombia. <jcubillosh@misena.edu.co>
2 Profesor Tiempo Completo. Universidad del Magdalena. Programa Ingeniería Agronómica. Carrera 32 No.22-08. “Sector San Pedro Alejandrino”. Magdalena, Colombia. <albertopaezredondo@gmail.com>.
3 Microbióloga Agroindustrial. Universidad Popular del César, Balneario Hurtado vía a Patillal. Cesar, Colombia. <laurismejiad@hotmail.com>.
Recibido: Septiembre 17 de 2009; aceptado: Junio 03 de 2011.
Palabras clave: Control biológico, Passiflora edulis var. flavicarpa, antagonismo, frutas tropicales.
Abstract. In the banana zone of Magdalena in Colombia has been reported a 30% decrease in crop production of passion fruit (Passiflora edulis var. Flavicarpa) due to the death of plants caused by the Dryer or vascular wilt disease, which is associated with the fungus Fusarium solani. In order to help manage of the disease was evaluated under greenhouse conditions the effect of the biocontrol strain native TCN-014 and CCL-005 commercial strain of Trichoderma harzianum against F. solani. For the evaluation were used plants with two months of age, set in the greenhouse; were tested two times of application of the antagonist: (1) inoculating the antagonist five days after of pathogen agent, and (2) inoculating the antagonist five days before the pathogen. The experiment was established under an experimental design of randomized blocks with 2x3 factorial arrangement, and data were submitted to analysis of variance (ANOVA) and comparison of averages using the multiple range test of Duncan. Results indicated that to inoculate the antagonist before the pathogen is obtained a better biocontrol effect of F. solani using concentrations of 106 and 108 conidia/ mL of both native and commercial strains. The results suggest an effective action of T. harzianum as a biocontrol of F. solani, showing that it can perform field studies in order to develop a byproduct for ecological management of wilt in cultivation of passion fruit.
Key words: Biological control, Passiflora edulis var. flavicarpa, antagonist, tropical fruits.
El maracuyá es un cultivo promisorio para Colombia, ocupando el segundo lugar en producción a nivel mundial, los frutos presentan un sabor particular intenso y una alta acidez, es buena fuente de proteínas, minerales, carbohidratos, grasas, vitamina A y niacina, constituyéndose en una base importante para la elaboración de bebidas industrializadas (Carvajal, 2007). Este cultivo presenta buena adaptación a los suelos y condiciones climáticas de la zona bananera del Magdalena, Colombia (Gómez, 2005); sin embargo, desde el año 2006 la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA) ha registrado una disminución del 30% de la producción anual en esta zona por problemas fitosanitarios, provocados por patógenos como Fusarium sp., causante de la enfermedad conocida como pudrición seca, marchitez, fusariosis o secadera; la cual ocasiona una muerte prematura de la planta por marchitamiento, al que también se asocia la obstrucción de haces vasculares, clorosis foliar leve, posterior defoliación y pudrición a nivel radical (González et al., 2002). La enfermedad se encuentra presente en todo el mundo y en los últimos años los investigadores señalan a Phytophthora sp. y Rhizoctonia spp. como patógenos asociados con el síndrome, debido a que ambos ocasionan daños a las raíces en diferentes cultivos (Duran et al., 2001; Espinoza y Mendoza 2001; Rico et al., 2001; Guerrero et al., 2001; López et al., 2002). En Colombia se están presentando daños por Fusarium sp. en el Valle del Cauca, Meta y zona bananera del Magdalena (Mendivelso, 2003; ICA, 2000; Cubillos et al., 2008). Así mismo, Cifuentes (2001), ha reportado a F. solani como agente causal de la fusariosis en tomate.
Hasta hoy el control de la enfermedad se ha fundamentado en prácticas de manejo convencional que resultan dispendiosas para los agricultores, teniendo que recurrir a la aplicación de fungicidas que a veces, resultan ineficientes, incrementan los costos de producción, contribuyen a la contaminación ambiental y deterioran la biota del suelo. Frente a esta situación, es conveniente el desarrollo de insumos para el control biológico de los fitopatógenos, contribuyendo además con la producción de carácter ecológico (Cubillos et al., 2008).
El género Trichoderma posee buenas cualidades para el control de enfermedades en plantas causadas por Fusarium sp y otros patógenos, por lo que es utilizado como base de productos comerciales (González et al., 2002), gracias a su acción micoparasítica (Chet et al., 1997, Sid-Ahmed et al., 2003), competencia directa por espacio y nutrientes (Chet e Inbar, 1994; Belanger et al., 1995), y otros efectos antagónicos generados por la producción de metabolitos antibióticos. Además presenta características favorables para su utilización como su abundancia, facilidad de aislamiento y cultivo, crecimiento rápido en un gran número de sustratos; lo anterior sumado al hecho de no atacar a las plantas superiores y en algunos casos presentar efecto biofertilizante y estimulador del crecimiento vegetal (Howell, 2003; Godes, 2007; Valencia et al., 2007; Valero, 2007; Vera et al., 2002; Zambrano, 1989; Börkman et al., 1998; Dandurand y Knudsen, 1993).
En la Estación Experimental Caribia de CORPOICA se han realizado ensayos de antagonismo in vitro para el control de F. solani, utilizando cepas comerciales del hongo Trichoderma harzianum donadas por el Centro de Investigación el Roble S.A. (TCC-001, TCC-005, TCC-006) y cepas nativas aisladas de suelos de cultivo de palma africana (Elaeis guineensis) en la zona bananera del Magdalena (TCN-009, TCN-010, TCN-014), de las cuales la cepa TCN-014 presentó una alta capacidad inhibitoria, seguida de la cepa TCC-005 frente a F. solani (Suarez et al., 2008).
Para avanzar en el diseño de un producto biocontrolador de uso local para el cultivo de maracuyá, es necesario estudiar el antagonismo bajo condiciones de invernadero con el fin de validar en condiciones más reales su potencial controlador, y posteriormente realizar evaluaciones bajo condiciones de campo. La investigación tuvo como propósito evaluar el potencial antagónico de la cepa nativa TCN-014 y la comercial TCC05 de T. harzianum bajo condiciones de invernadero frente a F. solani causante de la marchitez del maracuyá en la zona bananera del Magdalena.
]]>MATERIALES Y MÉTODOS
El estudio se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología y Fitopatología y en el Invernadero de la Estación Experimental Caribia de CORPOICA, ubicado en la zona bananera, corregimiento de Sevilla (Departamento del Magdalena), a una altitud de 40 msnm, localizado en un ecosistema de bosque seco tropical, temperatura promedio de 29 ºC, precipitación anual media de 1.400 mm y humedad relativa del 83%. (Rodríguez, 1998; Carbonó y Cruz, 2005).
Para este experimento se seleccionó la cepa nativa TCN-014 de T. harzianum aislada del suelo de un cultivo de palma africana en la Estación Esperimental Caribia de CORPOICA, destacándose por su capacidad micoparasítica grado cuatro frente al patógeno F. solani, el cual se determinó por la escala propuesta por Ezziyyani et al. (2004). También se seleccionó la cepa comercial TCC-005; ambas cepas, presentaron competencia por nutrientes y espacio y mayor radio de crecimiento frente al patógeno (Suarez et al., 2008). La cepa patógena fue aislada a partir de plantas de maracuyá afectadas por marchitez (Suarez et al., 2008).
Desde cultivos esporulados de las cepas TCN-014 y TCC005 en Agar Avena, se dispuso de una suspensión de conidios en agua destilada estéril del orden de 104, 106 y 108 conidios/mL para cada cepa, utilizando cámara de Neubauer. F. solani se cultivó en Agar Sabouraud Merck® 4% y se llevó a una concentración de 106 conidios/mL (González et al., 2005).
A partir de frutos maduros de maracuyá se obtuvieron semillas y se desinfectaron superficialmente por el método de la triple desinfección, que consistió en lavar con abundante agua potable, seguida de la desinfección con alcohol al 70% y enjuague con agua destilada estéril, una nueva desinfección con hipoclorito de sodio al 1% y enjuague con agua destilada estéril (French et al., 1980). Las semillas se sembraron en recipientes con 230 g de suelo abonado con lombricompuesto previamente esterilizado en autoclave a 121 °C con 15 PSI por 30 min en tres repeticiones, se llevaron a condiciones de invernadero que presentaba características de humedad relativa 70-80%, temperatura de 31-34 °C y se regaron con agua diariamente por nebulización cada 30 min por 10 s, las plántulas se mantuvieron en estas condiciones durante dos meses después de la germinación.
Para la evaluación de la patogenicidad de F. solani, se tomaron cinco plántulas sanas, de dos meses y se inocularon en el suelo con la suspensión de 1x106 conidios/mL; así mismo, se tomaron cinco plántulas sanas como testigo. Se realizaron observaciones diarias de la sintomatología durante cinco semanas seleccionándose los tallos y raíces de las plántulas que presentaron la enfermedad, los cuales se desinfectaron con alcohol al 70% e hipoclorito de sodio al 1%, se colocaron en cámara húmeda y se observó diariamente la aparición del micelio y la posterior pudrición. Se confirmó el cumplimiento de los postulados de Koch, según la metodología empleada por Carrero et al. (2003) mediante reaislamientos del patógeno en Agar Sabouraud Dextrosa y confirmación de sus características al microscopio (De Hoog et al., 2000, St-Germain y Summerbell, 1996, Sutton et al., 1998).
Pruebas de antagonismo de T. harzianum frente a F. solani. Se siguió un diseño experimental de bloques al azar en arreglo factorial con tres repeticiones por tratamiento, tomando como factores las cepas comercial TCC-005 y nativa TCN-014 de T. harzianum y tres concentraciones del inóculo, (104, 106 y 108 conidios/mL). Cada unidad experimental consistió en cinco plántulas.
Se realizaron dos bioensayos independientes para determinar el efecto T. harzianum en dos momentos de aplicación. El primer bioensayo consistió en inocular 10 mL de la suspensión 106 conidias/mL de F. solani en el suelo de cada plántula y cinco días después las plántulas se trataron con T. harzianum, inoculando al suelo 10 mL de la suspensión de esporas en concentraciones de 104, 106 y 108 conidios/mL de las cepas TCC-005 y TCN-014, en tratamientos diferentes. En el segundo bioensayo se inoculó primero T. harzianum TCC-005 y TCN-014 a concentraciones de 104, 106 y 108 conidios/mL, y cinco días después se inoculó el patógeno en concentración de 106 conidios/mL, según los procedimientos descritos anteriormente. Durante cinco semanas se tomó el registro del número de plántulas enfermas, número de plántulas sanas y número de plántulas muertas, al final del ensayo se determinó el número de plantas que presentaron pudrición en raíz. Al finalizar el experimento se tomaron muestras de suelo de donde se encontraban cada una las plántulas para determinar la presencia o ausencia del patógeno y el antagonista, mediante el reaislamiento utilizando diluciones y siembra en superficie en medio Sabouraud Dextrosa Merck® (López et al, 1999). Los datos de las variables registradas fueron procesados a través de los paquetes estadísticos Statgraphics plus versión 5.1 y SPSS versión 15. Se realizaron análisis de varianza y comparación de los promedios de tratamientos mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan (α = 0,05).
]]> RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Prueba de patogenicidad de F. solani. Las plántulas de maracuyá establecidas en el invernadero y tratadas con F. solani presentaron los primeros síntomas a los 14 d, correspondiendo al período de incubación del patógeno, en donde se observó clorosis foliar, marchitez, seguida de necrosis y fuerte defoliación; finalmente, la muerte de las plántulas ocurrió a las cinco semanas de la inoculación. Las manifestaciones de la enfermedad estuvieron asociadas a la pudrición vascular, presentando lesiones que invadieron la corteza y haces vasculares con severidad variable (Figura 1). Las regiones afectadas presentaron coloración violeta inicialmente y castaño en estado avanzado, de acuerdo con las pruebas de confirmación en el laboratorio; así mismo, se cumplieron los postulados de Koch para confirmar al agente aislado como causante de los síntomas observados (Agrios, 1995).
Figura 1. Características macroscópicas y microscópicas presentadas por Fusarium solani en la prueba de patogenicidad. A. Micelio del hongo en la raíz de la plántula. B. Conidióforos y clamidosporas terminales.
Antagonismo de T. harzianum frente a F. solani. En la Figura 2 se muestra el porcentaje semanal de plántulas enfermas tras inocular primero el patógeno y posteriormente el antagonista y en la Figura 3 se presenta el porcentaje semanal de plántulas enfermas tras inocular primero el antagonista y posteriormente el patógeno.
Figura 2. Expresión de la pudrición seca en maracuyá en respuesta a la prueba de antagonismo en donde se inoculó primero Fusarium solani y posteriormente Trichoderma harzianum.
Figura 3. Expresión de la pudrición seca en maracuyá en respuesta a la prueba de antagonismo donde se inoculó primero Trichoderma harzianum y posteriormente Fusarium solani.
Se observó que al inocular primero el patógeno y posteriormente el antagonista las plántulas comenzaron a presentar la sintomatología en la segunda semana después de la inoculación para todos los tratamientos. El mayor número de plántulas enfermas en todos los tratamientos se presentó en la tercera semana, cuando el patógeno se muestra más agresivo de acuerdo a la sintomatología de la enfermedad; sin embargo, en la quinta semana en todos los tratamientos el porcentaje de plántulas enfermas se reduce a cero, debido a que posiblemente el antagonista logra actuar eficientemente, neutralizando a partir de sus enzimas y toxinas la acción del patógeno y por ello las plántulas con síntomas iniciales de la enfermedad mostraron recuperación aparente.
]]> Al inocular primero el antagonista y posteriormente el patógeno se observó que los primeros síntomas de la enfermedad en las plántulas se presentan en la tercera semana y hasta la cuarta semana para los tratamientos TCN014-4+FS y TCC005-4+FS, logrando el antagonista detener la acción del patógeno y recuperar al vegetal de la afección. Los tratamientos TCN014-6+FS, TCN014-8+FS, TCC005-6+FS y TCC005-8+FS no presentaron plántulas enfermas durante el experimento. Estos resultados se atribuyen a la acción antagónica de T. harzianum frente a F. solani, el cual consigue neutralizar la acción del fitopatógeno desde el momento de la inoculación con el mismo, en el tratamiento control se presenta un alto porcentaje de plántulas enfermas (80%) en la segunda semana y llega al 100% de muerte de plántulas en la quinta semana.En la Tabla 1 se indican los resultados obtenidos inoculando las plántulas con el patógeno F. solani y posteriormente con las dos cepas del antagonista T. harzianum. El análisis de varianza para la variable pudrición en raíz, arrojó diferencias significativas (P<0,05) entre los tratamientos y la prueba de rangos múltiples de Duncan muestra que todos los tratamientos FS+TCC005-4, FS+TCN014-4, FS+TCN014-8, FS+TCC005-6, FS+TCC005-8 y FS+TCN014-6 con un porcentaje de pudrición de 86,6%, 80%, 20%, 20%, 20% y 13,3%, respectivamente. Se registraron diferencias significativas con respecto al testigo que obtuvo un porcentaje de 100% de pudrición en raíz. De acuerdo a este resultado, las cepas TCN014 y TCC005 en concentraciones 104, 106 y 108 cel/ml tienen efectos positivos sobre el control de F. solani. Sin embargo, se observó que a mayor concentración de ambas cepas mejor será el efecto biocontrolador. Situación similar, es mencionada por Cifuentes (2001) donde plántulas de tomate infectadas en el suelo con F. solani 108 cel/ml y posteriormente tratadas con una cepa nativa y comercial (Trichodex) de T. harzianum 109 cel/mL, presentaron pudrición en un 30% cuando se usó la cepa la nativa y un 60% para cuando se usó la comercial. El mayor número de plántulas muertas se tuvo con los tratamientos FS+TCC005-4 y FS+TCN014-4 con un 86,6% y 80% respectivamente, semejante al control que logró un 100% de plantas muertas. El mayor porcentaje de plántulas sanas se obtuvo con los tratamientos FS+TCN014-6, FS+TCN014-8, FS+TCC005-8 y FS+TCC005-6 que presentaron un 80%.
Tabla 1. Efecto de la inoculación con Fusarium solani y 5 días después con Trichoderma harzianum TCC-005 y TCN-014 a concentraciones de 104, 106 y 108 conidios/mL, en la pudrición seca del maracuyá.
En la Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos en el bioensayo donde plántulas de maracuyá se inocularon primero con T. harzianum y posteriormente F. solani. Para la variable pudrición en corona el análisis de varianza encontró diferencias significativas (P<0,05) entre los tratamientos y la prueba de rangos múltiples de Duncan revela que todos los tratamientos presentaron diferencias significativas con respecto al testigo.
Tabla 2. Efecto de la inoculación con Trichoderma harzianun TCC-005 y TCN-014 a concentraciones de 104, 106 y 108 conidios/mL y 5 días después con Fusarium solani, en la pudrición seca del maracuyá.
Los tratamientos TCN014-6+FS, TCN014-8+FS, TCC005-6+FS y TCC005-8+FS mostraron 0% de pudrición en raíz y los tratamientos TCC005-4+FS y TCN014-4+FS presentaron 13,3% y 6,6% respectivamente y el testigo un 100% de pudrición. De estos resultados se infiere que las cepas nativas y comerciales de T. harzianum controlan a F. solani y entre mayor sea la concentración del antagonista mejor es su efecto biocontrolador.
El porcentaje de plántulas muertas no fue significativo y el mayor porcentaje de plántulas muertas se presentó únicamente en los tratamientos donde la concentración del antagonista fue menor TCN014-4+FS y TCC005-4+FS con 6,6% y 13,3% respectivamente; sin embargo, el efecto biocontrolador fue significativo con respecto al testigo donde el 100% de las plántulas murieron. Los tratamientos TCN014-6+FS, TCN014-8+FS, TCC005-6+FS y TCC005-8+FS no presentaron plántulas enfermas durante el experimento; estos resultados se atribuyen a la acción antagónica de T. harzianum frente a F. solani.
Recuperación del patógeno y el antagonista. En los tratamientos donde se inoculó primero T. harzianum y posteriormente F. solani la recuperación del antagonista fue mayor que cuando se inoculó primero el patógeno y cinco días después el antagonista (Figura 4). Este comportamiento se atribuye a que T. harzianum tiene crecimiento acelerado y su micelio coloniza rápidamente el sustrato, por tanto, excluye patógenos como Fusarium sp. (Sutton y Peng, 1993).
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La prueba de rangos múltiples de Duncan para el bioensayo donde se inoculó primero al patógeno y después el antagonista, arrojó diferencias significativas entre los tratamientos para la recuperación del antagonista y del patógeno. Se encontró mayor recuperación del antagonista en los tratamientos donde fue aplicada la cepa de T. harzianum nativa, sobresaliendo los tratamientos FS+TCN014-6 y FS+TCN014-8 con un 93,3%. La mayor recuperación del patógeno se presentó en los tratamientos FS+TCC005-4 con un 93%, y FS+TCN014-4 con un 86,7%.
Para el bioensayo donde se inoculó primero el antagonista y después el patógeno, según la prueba de Duncan no hubo diferencias significativas (Figura 3). Para los tratamientos TCN014-6+FS, TCN014-8+FS, TCC005-8+FS se obtuvo 100% de recuperación del antagonista y en cuanto a la recuperación del patógeno en el tratamiento TCN014-8+FS no se tuvo una reacción efectiva.
Los resultados anteriores revelan una correlación positiva entre el efecto antagónico de T. harzianum como biocontrolador y la recuperación del patógeno en el suelo al final del experimento, indicando la validez del procedimiento experimental y confirmando que la baja incidencia de síntomas de la enfermedad, efectivamente corresponde a la acción biocontroladora directa de T. harzianum sobre F. solani, más que a otro tipo de factores.
CONCLUSIONES
La cepa nativa TCN-014 y la comercial TCC-005 de T. harzianum presentan efecto biocontrolador sobre F. solani, causante de la marchitez del maracuyá, disminuyendo significativamente los síntomas, el número de plántulas enfermas, plantas con pudrición en corona y plántulas muertas, en condiciones de invernadero.
Los mejores resultados se obtienen utilizando inóculos de 106 y 108 cel/mL de T. harzianum para las dos cepas evaluadas; se consiguió mejor control de F. solani cuando se inocula primero T. harzianum, en comparación con su inoculación después de haber preinfectado las plántulas con el patógeno, esto permite pensar en el uso de T. harzianum para el control de la enfermedad como medida preventiva más que curativa, aun cuando su aplicación posterior a la presencia del fitopatógeno también logra disminuir el efecto del mismo.
Se aprecia la tendencia a una mayor efectividad de la cepa nativa frente a la comercial, este hecho demuestra su competitividad y está a favor de una estrategia de aprovechamiento de los recursos microbianos locales para el desarrollo de bioinsumos con base en cepas adaptadas a las condiciones ecológicas del medio donde se pretenden usar.
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