ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

Antagonismo de Purpureocillium sp. (cepa UdeA0106) con hongos aislados de cultivos de flores

Antagonism of Purpureocillium sp. (UdeA0106 strain) with fungi of flowers cultures

Diego A. Salazar-Moncada^1,3, Claudia Jaramillo-Mazo^1,4, Juliana Vásquez-Restrepo^1,5, Camilo Ramírez^1,2,6, Nadya L. Cardona-Bustos^1,2,7

2 Docente, Instituto de Biología, Universidad de Antioquia. Medellín (Antioquia), Colombia.

Correos electrónicos: 3 diego2628@gmail.com; 4 clayujama01@gmail.com; 5 juliana.vasquez11@gmail.com; 6 camilorz@une.net.co; 7 nadyaloren@gmail.com.

Recibido: mayo 2013; aceptado: noviembre 2013.

Resumen

Estudios desarrollados en el grupo BIOMA de la Universidad de Antioquia, mostraron como el hongo Purpureocillium sp. (cepa UdeA0106) puede biocontrolar una plaga conocida como sínfilos (subfilo Myriapoda: clase Symphyla). Este trabajo buscó identificar géneros de hongos anamórficos, aislados de diferentes sustratos (sínfilos y suelos) para determinar la capacidad antagónica de estos, así como de cepas de una colección de hongos biocontroladores sobre Purpureocillium sp. (cepa UdeA0106). A partir de sínfilos se registraron 9 cepas distribuidas en 3 géneros, y en suelo, 17 cepas correspondientes a 10 géneros. Las pruebas de antagonismo consistieron en una prueba in vitro empleando la técnica de cultivo dual en cajas de Petri con agar sabouraud dextrosa (SDA) utilizando 16 cepas: 12 provenientes de los aislamientos y 4 del cepario del grupo BIOMA. Las variables evaluadas fueron el radio de crecimiento en los enfrentamientos y el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) a los 7 y 14 días. El análisis se realizó con un modelo mixto lineal generalizado mediante Proc GLIMMIX SAS® de manera independiente. El hongo Purpureocillium sp. (cepa UdeA0106) fue inhibido por Volutella sp. (Vo.UdeA0109), Paecilomyces sp. aislado 2 (Pa.UdeA0109) y Peyronella sp. (Pe.UdeA0108) (p < 0,001), mientras que el resultado no fue estadísticamente significativo con las cepas Beauveria sp. (Be.UdeA0109), Dendrodochium sp. (De.UdeA0109), Myrothecium sp. (Mi.UdeA0109), Paecilomyces sp. aislado 1 (Pa.UdeA0309), Paecilomyces sp., aislado 3 (Pa.UdeA0209), Lecanicillium sp. (Le.UdeA0109) y Purpureocillium sp. (Hy.UdeA0109). El análisis muestra que pueden presentarse interacciones entre cepas de hongos con resultados no deseados a la hora de realizar actividades de control.

Palabras clave: Aislamiento, antagonismo, biocontrol, Purpureocillium sp., sínfilos.

Abstract

Studies developed in the BIOMA research group of the Universidad de Antioquia showed how the fungus Purpureocillium sp. (strain UdeA0106) may biocontrol a plague known as symphylans (subphylum Myriapoda: class Symphyla). The goal of this study was to identify fungal genera isolated from different substrates (symphylans and soils) and determine their antagonistic capacity, as well a collection of biocontrol strains, over Purpureocillium sp. (strain UdeA0106). Nine fungal strains were isolated from symphylans samples, belonging to 3 genera, and 17 strains were isolated from soil samples, belonging to 10 genera. The antagonism tests consisted of an in vitro test using the dual culture technique in Petri dishes using a sabouraud dextrosa agar (SDA) culture médium, which was conducted on 16 strains: 12 obtained from the isolates and 4 from the collection of the BIOMA research group. The variables evaluated were the growth radius in the confrontations and the percentage of radial growth inhibition (PICR) at 7 and 14 days. Data were analyzed using a generalized linear mixed model using the SAS® Proc GLIMMIX procedure in an independent manner. The fungus Purpureocillium sp. (strain UdeA0106) was inhibited by Volutella sp. (Vo.UdeA0109), Paecilomyces sp. Isolate 2 (Pa.UdeA0109) and Peyronella sp. (Pe.UdeA0108) (p <0,001), while the results of the strains Beauveria sp. (Be.UdeA0109) Dendrodochium sp. (De.UdeA0109), Myrothecium sp. (Mi.UdeA0109), Paecilomyces sp. isolated 1 (Pa.UdeA0309), Paecilomyces sp. isolated 3 (Pa.UdeA0209), Lecanicillium sp. (Le.UdeA0109), and Purpureocillium sp. (Hy.UdeA0109) were not significant. The analyses showed that interactions with undesirable results may occur between fungal strains when conducting control activities.

INTRODUCCIÓN

El sector floricultor tiene gran importancia en Colombia por su impacto socio-económico. Al igual que muchos otros sectores agroindustriales, este afronta diversidad de problemas de plagas y enfermedades, frente a los cuales el uso de productos biológicos se ha considerado como alternativa a las sustancias químicas, debido a que estas causan efectos negativos sobre la salud de las personas y crean situaciones adversas como la residualidad, que afecta a los organismos en los ecosistemas acuáticos y terrestres (O'Farrill 2004).

Los sínfilos, conocidos como ciempiés de jardín, son artrópodos que hacen parte de los miriápodos (figura 1). Las especies de los géneros Scutigerella y Hanseniella son consideradas plagas en todo el mundo (Michelbacher 1938) debido a que causan daño a diversidad de cultivos de hortalizas, frutales y flores, entre otros (Domínguez 2009, Halliday 2004, Umble y Fisher 2003b). Los sínfilos tienen preferencia por las raíces más jóvenes y su consumo ocasiona en la planta un desarrollo radicular en ''forma de escoba'' y un retardo en el crecimiento (Agredo et al. 1988, Umble y Fisher 2003a).

Frente a la exigencia, por parte de entes gubernamentales, nacionales e internacionales (González et al. 2012), de una mayor responsabilidad ambiental y social en diferentes cultivos, se ha evidenciado la necesidad de buscar alternativas como el uso de los productos biológicos en lugar de las sustancias químicas. Recientemente, se ha probado la aplicación del hongo Purpureocillium sp. cepa UdeA0106 contra sínfilos en cultivos de flores (Salazar 2013) haciendo necesario evaluar su compatibilidad o antagonismo frente a otros hongos de interés para el biocontrol.

Una de las interacciones más estudiada como mecanismo de acción entre microorganismos antagonistas es la antibiosis, en la cual se ha detectado compuestos tóxicos con efectos inhibitorios (Altinok 2002, Benhamou y Brodeur 2000, Gloer 1995, Sanz et al. 2002). Algunos de los géneros más utilizados para el control de plagas han sido Beauveria, Gliocladium, Metarhizium y Trichoderma en cultivos como café, algodón, banano y flores (Arango 2002, Aristizábal et al. 2006, Carlile et al. 2001, Espinal et al. 2005, Henao y Ospina 2008) con alta eficacia en actividades de control, siendo aplicados en forma individual o conjunta (Cisternas et al. 2002, Fernández y Vega 2001, Gerding et al. 2002, Hafez et al. 1994, Thomsen y Eilenberg 2000, Trabanino et al. 2003).

El auge de la aplicación de productos biológicos y el desconocimiento sobre el efecto de la mezcla de microorganismos de interés en el control de plagas, exige el desarrollo de estudios que proporcionen elementos para orientar a los floricultores sobre cuáles organismos pueden ser aplicados en forma conjunta y cuáles deben ser utilizados en forma separada para mantener la eficacia de los productos biológicos incorporados en programas de manejo integrado de plagas y enfermedades (MIPE).

La especie Purpureocillium sp., designada en este trabajo como cepa UdeA0106, presenta una fase asexual de un hongo entomopatógeno del orden Hypocreales, familia Ophiocordycitaceae, aislado de la finca Vegas de la Clara de la Universidad de Antioquia (Gómez Plata, Antioquia). La identificación de la cepa fue realizada en el laboratorio de Biocontrol y Microbiología Aplicada (BIOMA) del Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia. Actualmente se están llevando a cabo pruebas moleculares que permitan la clasificación precisa del aislado.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sitio de muestreo. Las muestras de sínfilos fueron recolectadas en la empresa Flores Esmeralda S. A. S. C. I., localizada en el Oriente antioqueño en el municipio de La Ceja, que se encuentra ubicado a una altura de 2.180 m. s. n. m. y registra una temperatura promedio de 18 °C. El hongo Purpureocillium sp. (cepa UdeA0106) fue suministrado por el Laboratorio de Control Microbiológico del grupo de investigación BIOMA del Instituto de Biología, Universidad de Antioquia.

Aislamiento de hongos a partir de sínfilos. Aproximadamente 100 sínfilos fueron recolectados dentro de la empresa en un jardín ornamental apartado del cultivo de producción, con el fin de evitar que las muestras fueran expuestas a cualquier método de control. Los sínfilos fueron transportados del sitio de recolección al laboratorio en cajas de Petri plásticas con muestras de suelo. Se tomaron 12 sínfilos en cajas de Petri vacías y fueron llevados a 4 °C por treinta minutos para inmovilizarlos, luego se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto y fueron lavados con agua destilada estéril. Posteriormente, los sínfilos fueron colocados en una cámara húmeda (elaborada en el interior de una caja de Petri con papel filtro humedecido con agua) para su incubación a temperatura ambiente bajo condiciones de laboratorio.

Transcurridos siete días de incubación se inspeccionaron las muestras y aquellos hongos que presentaron crecimiento visible fueron repicados en medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) acidificado por diez días. Posteriormente, se realizaron montajes en placas con azul de algodón con lactofenol para su identificación en el microscopio óptico de luz empleando las claves taxonómicas de Barnett y Hunter (1998), Carmichael et al. (1980) y Domsch et al. (1980). Las muestras que no fue posible identificar, debido a que solo presentaron micelio o esporas, fueron repicadas en microcultivo para promover la formación de las estructuras reproductivas (Morales 2009).

Identificación microscópica con microcultivos. El microcultivo se realizó empleando un soporte de madera en una caja de Petri que contenía papel filtro humedecido con portaobjeto con 1 cm² de medio de cultivo SDA acidificado. Las lecturas se realizaron transcurridos 4 y 6 días (Morales 2009). La descripción de los aislados se realizó a partir de características morfológicas de acuerdo con Barnett y Hunter (1998), Carmichael et al. (1980) y Domsch et al. (1980). Los hongos determinados fueron tabulados con sus respectivas frecuencias de aislamiento.

Aislamiento de hongos a partir de muestras de suelo. Se tomaron cinco muestras de suelo de 500 g que fueron llevados al laboratorio en bolsas plásticas. Las muestras fueron homogenizadas. De cada muestra se extrajo 10 g que fueron depositados en frascos con 90 ml de agua destilada estéril y sometidos a una agitación de 150 r/m durante diez minutos. Posteriormente, se realizaron diluciones seriadas hasta 1x10^-6 para cada una de las muestras. Se tomaron 100 μl de las diluciones 1x10^-4, 1x10^-5 y 1x10^-6 y fueron sembrados en superficie sobre medio de cultivo PDA por duplicado. El tiempo de incubación fue de siete días a temperatura ambiente y para la evaluación fue llevado a cabo el mismo procedimiento descrito anteriormente. Para cada muestra procesada se realizó siembra por duplicado (Morales 2009).

Pruebas de antagonismo in vitro. Para llevar a cabo esta prueba se utilizaron doce cepas de hongos aislados a partir de muestras de sínfilos y de suelo, y cuatro muestras tomadas del cepario del Laboratorio de Control Microbiológico del grupo BIOMA (Myrothecium sp., Dendrodochium sp., Peyronellae sp., Volutella sp.). Cada uno de estos hongos fue repicado en medio SDA acidificado para posteriormente hacer el montaje de la prueba antagónica por medio de la técnica de enfrentamiento dual (Gallego y Cardona 2012).

La prueba fue realizada en cajas de Petri con SDA en las que fueron colocados discos de hongo con un diámetro de 5 mm, guardando una distancia de 3 cm entre ellos. Se llevaron a cabo cuatro ensayos y tres controles para cada especie de hongo. Las unidades experimentales fueron sometidas a temperatura ambiente con periodos de luz-oscuridad. Se realizaron lecturas de los diámetros en los días 7 y 14 empleando la fórmula de Worasatit et al. (1994):

Donde:

D1 = diámetro de la colonia de la cepa UdeA0106 creciendo en cajas de Petri con SDA libre de inhibidores.

D2 = diámetro de la colonia de la cepa UdeA0106 creciendo en cajas de Petri junto a los diferentes hongos empleados en el estudio.

Análisis estadístico. Los datos fueron analizados ajustando un modelo mixto linear generalizado mediante Proc GLIMMIX SAS® (SAS Institute, North Carolina, U. S. A.) y de manera separada para el diámetro de la colonia a los 7 y a los 14 días. Los datos provenientes de los dos ensayos conducidos fueron analizados de manera conjunta, incluyendo el ensayo como una variable aleatoria dentro del modelo y cada cepa como un factor fijo. Los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas fueron evaluados gráficamente mediante la opción ''student panel'' de Proc GLIMMIX. Debido a que ninguno de estos supuestos fue cumplido, los datos fueron ajustados a una distribución lognormal y las varianzas de los residuales fueron tratadas de manera separada para cada ensayo mediante la opción ''group''.

Para la evaluación del efecto de la cepa UdeA0106 sobre el desarrollo de los demás hongos, el análisis se realizó por separado para cada uno de los aislados fungosos, comparando el crecimiento del aislado en presencia y en ausencia de la cepa. Por el contrario, el análisis del efecto de cada uno de los aislados fungosos sobre el crecimiento de la cepa se hizo de manera conjunta, unificando la totalidad de los datos y comparando el diámetro de la colonia de UdeA0106 en presencia de cada aislado con su diámetro cuando es cultivado solo (prueba de Dunnett). En todos los casos, los datos se encuentran expresados como la transformación reversa del logaritmo natural (potencia del número e) de los medios mínimos cuadrados predichos por el modelo.

RESULTADOS

Aislamiento de hongos a partir de muestras de sínfilos y suelo. Los aislamientos de hongos a partir de muestras de sínfilos estuvieron representados por tres géneros (tabla 1). El hongo Penicillium sp. fue el de mayor frecuencia con siete cepas, para un porcentaje de 77,7%, seguido de Lecanicillium sp. (Le.UdeA0109) y Metarhizium sp. (Me.UdeA0109) con un 11,1% para cada uno.

En las muestras de suelo fueron identificados diez géneros (tabla 2), los más abundantes fueron Paecilomyces y Penicillium, con porcentajes de frecuencia de 29,4 y 23,5%, respectivamente. Los demás géneros identificados están representados por un aislado que corresponde a un 5,9%.

Pruebas de antagonismo. Al evaluar el efecto de la presencia de la cepa del hongo UdeA0106 sobre el crecimiento de los diferentes hongos aislados y los del cepario, se encontró que que Volutella sp. (Vo.UdeA0109), Peyronella sp. (Pe.UdeA0108) y Metarhizium sp. (Me.UdeA0109) se inhibieron en mayor proporción con un valor p < 0,001. Otros hongos también inhibidos por la cepa UdeA0106 fueron Botrytissp. (Bo. UdeA 0108), Cladosporium sp. (Cl.UdeA0109), Fusarium sp. (Fu.UdeA0109), Paecilomyces sp. aislado 2 (Pa.UdeA0109) y Pochonia sp. (Po.UdeA0107) (tablas 3 y 4).

DISCUSIÓN

Del total de hongos aislados, el 46,1% fue evaluado en las pruebas de antagonismo. Este representa un valor alto teniendo en cuenta que solo se consideraron cepas con actividad biocontroladora y fitopatógenas.

En los aislamientos realizados se registraron organismos comunes del suelo como son Aspergillus sp., Penicillium sp. y Paecilomyces sp., los cuales han sido anotados anteriormente por otros investigadores (Arias 2008, Morales 2009). Muchos de estos aislados presentaron bajos porcentajes de incidencia (tablas 1 y 2), debido posiblemente a la competencia intra e inter específica que tiene lugar en ambientes naturales (Chávez 2007) y a las fluctuaciones de variables ambientales claves para los hongos como son la temperatura y la humedad. Sin embargo, se registraron especies con altos valores de incidencia como Penicillium spp. con 77,7% y Paecilomyces spp. con 29,4%. Esto puede estar relacionado con el crecimiento invasivo que presentan dichas especies.

En las pruebas antagónicas se encontró que la cepa UdeA0106 tuvo el efecto inhibidor más significativo sobre el crecimiento de Metarhizium sp. (Me.UdeA0109), Peyronella sp. (Pe.UdeA0108) y Volutella sp. (Vo.UdeA0109) con valores de p < 0,001 para el día 14. De estas especies solo Volutella sp. (Vo.UdeA0109) presentó un p = 0,001 para el día 7. En este mismo sentido, inhibiciones muy significativas también fueron registradas en Fusarium sp. (Fu.UdeA0109), Paecilomyces sp. aislado 2 (Pa.UdeA0109) y Botrytis sp. (Bo.UdeA0108) en el día 7, con valores de p de 0,001; 0,002 y 0,01, respectivamente. Los análisis en esta misma prueba muestran inhibiciones de crecimiento en el día 14 para Fusarium sp. (Fu.UdeA0109), Cladosporium sp. (Cl.UdeA0109), Paecilomyces sp. aislado 2 (Pa.UdeA0109) y Pochonia sp. (Po.UdeA0107) con valores de p de 0,004; 0,012; 0,02 y 0,021, respectivamente. Una posible explicación para este resultado es la presencia de metabolitos secundarios que han sido informados para la cepa UdeA0106, como las glicosil hidrolasas, que degradan proteínas asociadas a carbohidratos como la manosa, componente de la pared celular de algunos hongos. Así mismo, se encontró una hidroxilasa de ácidos grasos, que posiblemente esté involucrada en la degradación de lípidos fúngicos miceliales (Cardona et al. 2008). Adicionalmente, como ha sido registrado por Villa (2006), la presencia de quitinasas producidas in vitro podrían de igual forma inhibir la formación de micelio de los hongos susceptibles.

Existen pocos estudios sobre los mecanismos de acción que pudieron presentar las especies de hongos objeto de este estudio. De igual manera, es probable que en estas pruebas los hongos hayan presentado diferentes mecanismos de acción, debido a la incompatibilidad que se presentó entre hongos en tiempos diferentes (Whipps 2001).

De acuerdo con los resultados obtenidos, se evidencia que las sugerencias a floricultores respecto a las mezclas de hongos con acción en diferentes blancos, deben estar soportados por pruebas de campo. Sin embargo, las tendencias que exhiben estos resultados son muy positivas a la hora de diseñar estrategias para la aplicación de hongos bicontroladores en cultivos, como lo mostró por ejemplo, el efecto antagónico de la cepa UdeA0106 sobre hongos con alta actividad fitopatógena como Fusarium sp. (Fu.UdeA0109) y Botrytis sp. (Bo.UdeA0108), los cuales cumplen parte de su ciclo de vida en el suelo (Agrios 2005, Singh et al. 2002), y Volutella sp. (Vo.UdeA0109) (Šafránková 2007); evidenciando la posibilidad de su consideración como una opción alterna al uso de químicos.

Otro aporte importante de este estudio hace referencia al cuidado que se debe tener cuando se aplican hongos biocontroladores de manera simultánea, con diferencias cortas de tiempo o en una mezcla; ya que se observó la existencia de incompatibilidad de la cepa con hongos como Metarhizium sp. (Me.UdeA0109) y una especie de Paecilomyces sp. aislado 2 (Pa.UdeA0109) (Pérez et al. 2009), los cuales son ampliamente usados en actividades de control de plagas en cultivos. Por último, los análisis muestran la compatibilidad de la cepa UdeA0106 con hongos como Beauveria sp. (Be.UdeA0109), Dendrodochium sp. (De.UdeA0109), Lecanicillium sp. (Le.UdeA0109), Myrothecium sp. (My.UdeA0108), Paecilomyces sp. aislado 1 (Pa.UdeA0309), Paecilomyces sp. aislado 3 (Pa.UdeA0209) e Hyphomycete (Hy.UdeA0109) lo que sugiere, si futuros estudios de campo muestran el mismo comportamiento, que podrían aplicarse mezclas de estos hongos de acuerdo a la necesidades de control.

Se demostró en pruebas in vitro el antagonismo de Purpureocillium sp. con otros hongos usados también en el control de plagas, así como la posibilidad de ser aplicado en forma conjunta con otros. Por lo tanto se recomienda la realización a futuro de pruebas in vivo que permitan determinar la interacción existente entre estos hongos, corroborar los resultados obtenidos en las pruebas in vitro, y estudiar el comportamiento de estos microorganismos en aplicaciones bajo condiciones de invernadero dentro de los programas de manejo integrado.

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