ENSAYO PRELIMINAR DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE EXTRACTOS DE ALLIUM SATIVUM, CORIANDRUM SATIVUM, EUGENIA CARYOPHYLLATA, ORIGANUM VULGARE, ROSMARINUS OFFICINALIS Y THYMUS VULGARIS FRENTE A CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

PRELIMINARY TEST OF THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF THE ALLIUM SATIVUM, CORIANDRUM SATIVUM, EUGENIA CARYOPHYLLATA, ORIGANUM VULGARE, ROSMARINUS OFFICINALIS AND THYMUS VULGARIS EXTRACTS AGAINST CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Martha I. Ardila Q.¹, Andrés F. Vargas A.¹, Jorge E. Pérez C.² y Luis F. Mejía G.³

1 Estudiantes Programa Ingeniería de Alimentos, Facultad de Ingeniería, Universidad de Caldas. Manizales, Caldas (Colombia).
2 Profesor del Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas. Manizales, Caldas (Colombia).
3 Profesor del Departamento de Ingeniería, Facultad de Ingenierías, Universidad de Caldas. Manizales, Caldas (Colombia).

Recibido: septiembre 01 de 2009 - Aceptado: noviembre 03 de 2009

Se evaluó la actividad antibacteriana frente a Clostridium perfringens (cepa ATCC: 13124) por el método de Kirby Bauer en agar SPS de los aceites esenciales o extractos vegetales obtenidos con solventes orgánicos de diferente polaridad a partir de Allium sativum (ajo), Coriandrum sativum (cilantro), Eugenia Caryophyllata (clavo de olor), Origanum vulgare (orégano), Rosmarinus officinalis (romero) y Thymus vulgaris (tomillo), utilizando la vancomicina como control. Los extractos obtenidos por el método de lixiviación de O. vulgare y T. vulgaris no presentaron inhibición para este microorganismo; los demás extractos vegetales sí la presentaron, obteniéndose concentraciones bacteriostáticas mínimas que oscilaron entre 16 y 63 µl/ml. El extracto etanólico y el aceite esencial de E. caryophyllata fueron los que presentaron una menor concentración inhibitoria mínima (250 µl/ml). Se observan variaciones importantes en la capacidad de inhibición de dichos extractos con respecto a estudios realizados por otros grupos de investigación en el mundo, pocos de ellos utilizaron a Clostridium perfringens.

PALABRAS CLAVE: actividad antibacterial, Clostridium perfringens, Allium sativum, Coriandrum sativum, Eugenia Caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis y Thymus vulgaris.

ABSTRACT

The antibacterial activity against Clostridium perfringens (ATCC: 13124) of essential oils and extracts obtained from Allium sativum (garlic), Coriandrum sativum (coriander), Eugenia Caryophyllata (clove), Origanum vulgare (oregano), Rosmarinus officinalis (rosemary) and Thymus vulgaris (thyme) tested by means of the Kirby Bauer method in SPS agar, using vancomicine as the control. The extracts obtained by the lixiviation method from Origanum vulgare and Thymus vulgaris do not show inhibition, whereas the other extracts had minimal bacteriostatical concentrations between 16 to 63 µl/ml. The E. caryophyllata ethanolic extract and essential oil presented a lower minimal inhibitory concentration (250 µl/ml). Important variations in the inhibitory capacity of the extracts and essential oils were observed, regarding studies carried out by other research groups in the world, few worked with Clostridium perfringes.

KEY WORDS: antibacterial activity, Clostridium perfringens, Allium sativum, Coriandrum sativum, Eugenia Caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis and Thymus vulgaris, essential oils.

INTRODUCCIÓN

Según la organización Mundial de la Salud más del 30% de las personas en países industrializados sufren de enfermedades asociadas con los alimentos; por otro lado, esta misma organización está impulsando una política del no uso de sal como conservante de alimentos para tratar de disminuir los casos de enfermedad cardiovascular en el mundo; además, en el mundo occidental se observa una tendencia hacia el consumo de alimentos hechos con compuestos naturales y no sintéticos (26, 29).

Cuando las células vegetativas de Clostridium perfringens llegan al intestino y esporulan, producen la enterotoxina que es la responsable del cuadro clínico, una toxico infección caracterizada por náuseas, diarrea, dolor y gases abdominales, 6 a 12 horas después de haber ingerido los alimentos contaminados (2-4).

En las décadas precedentes las plantas medicinales han ganado importancia; la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales o extractos naturales de estas, y los productos naturales han mostrado el potencial de las plantas como fuente de agentes antimicrobianos (5, 6, 25, 26).

El ajo (Allium sativum), del cual se realiza la extracción del disulfuro de alilo (C₆H₁₀S₂), trisulfuro de alilo y tetrasulfuro de alilo, tiene un efecto bactericida, acción que se ha atribuido a los componentes sulfurosos y fenólicos.

Un patrón con el que se compara el efecto antimicrobiano de los aceites esenciales o cualquier otro agente bactericida es el fenol. El coeficiente fenólico de los aceites esenciales indica el grado de actividad de las distintas sustancias, con referencia al fenol (7).

El aceite esencial del cilantro (Coriandrum sativum) contiene diferentes moléculas como el cineol, el borneol, el canfeno, el citronelol, el coriandrol y el geraniol ,entre otros, que son importantes porque se ha demostrado sus efectos antimicrobianos, antioxidantes, antinflamatorios, anticancerígenos y antiespasmódicos (8).

Los aceites esenciales obtenidos de especias y hierbas aromáticas tienen propiedades antimicrobianas y pueden contribuir a garantizar la inocuidad de los alimentos. El clavo de olor (Eugenia Caryophyllata), del cual se realiza la extracción del eugenol, en altas concentraciones tiene un efecto bactericida, acción que se ha atribuido a los fenoles por degeneración de las proteínas lo que resulta en daño a la membrana celular, a diferencia de las bajas concentraciones de eugenol que tienden a estabilizar las membranas celulares (9, 10).

El agente activo del tomillo (Thymus vulgaris) es el timol que se caracteriza por su poder desinfectante y fungicida. Por su sabor agradable está presente en la formulación de diversos enjuagues bucales, pastas de dientes, etc. Una disolución de 5% de timol en etanol se utiliza para la desinfección dermal y contra infecciones con hongos (11).

Resultados recientes revelan el poder desinfectante de los aceites esenciales purificados a partir de hierbas de uso tradicional. El timol y el carvacrol, aceites esenciales presentes en el orégano y el tomillo, se emplean en la industria alimenticia como antibacterianos; estos aceites han mostrado un efecto frente a bacterias Gram negativas y Gram positivas (12), con resultados similares a los dados por los antibióticos (13); y al compararlos con el efecto del ácido láctico sobre L. monocytogenes, se ha encontrado una inhibición superior al 50% por parte de ambos aceites (14).

En el romero (Rosmarinus officinalis) la mayor parte de la evidencia de los usos medicinales provienen de la experiencia clínica más que de estudios científicos. Sin embargo, recientes estudios de laboratorio han mostrado que el romero disminuye el crecimiento de algunas bacterias tales como Escherichia coli y Staphylococcus aureus que están relacionadas con el proceso de descomposición de los alimentos, y puede en realidad comportarse mejor que algunos de los conservantes de alimentos comercializados en la actualidad. Los principales agentes activos contenidos en el aceite esencial del Rosmarinus officinalis son: pineno, canfeno, 1,8 cineol, limoneno, alcanfor, linalol, D-linalol, borneol y su acetato, terpeno y cariofileno. El aceite es extraído de flores, tallos, y hojas (15, 16).

En la presente investigación se determinó el efecto inhibitorio del crecimiento de Clostridium perfringens, frente a extractos obtenidos con diferentes solventes de los bulbos de Allium sativum (ajo); de las hojas y tallos de Coriandrum sativum (cilantro), Eugenia Caryophyllata (clavo de olor), Origanum vulgare (orégano), Rosmarinus officinalis (romero) y Thymus vulgaris (tomillo), con el fin de obtener métodos alternativos, que sean orgánicos para la conservación de alimentos cárnicos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección del material vegetal

Los bulbos de Allium sativum y los botones de Eugenia caryophyllata fueron adquiridos en mercados locales de Manizales, Caldas (Colombia); tallos y hojas de Coriandrum sativum, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis y Thymus vulgaris son provenientes de los cultivos de plantas medicinales del municipio de Villamaría, Caldas (Colombia).

Preparación de los extractos

Los bulbos de Allium sativum se limpiaron retirando impurezas, pelándolos y lavándolos con abundante agua; se retiró la piel por presión y se picó. Las hojas y tallos de Coriandrum sativum, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis y Thymus vulgaris fueron lavados con suficiente agua para eliminar suciedades y contaminantes; posteriormente el Coriandrum sativum y Origanum vulgare se secaron a temperatura ambiente, se picaron y se conservaron en refrigeración y congelación respectivamente hasta su proceso de extracción. El Thymus vulgaris se sometió a un proceso de secado a 50ºC; se separaron hojas de tallos y se utilizaron las hojas en el proceso de extracción. Las hojas y tallos de Rosmarinus officinalis se secaron y se pulverizaron para ser llevadas al proceso de extracción. Los botones de Eugenia caryophyllata se adquirieron secos, se les retiraron impurezas y se llevaron a proceso de arrastre de vapor.

Los extractos de los botones de Eugenia caryophyllata y de Origanum vulgare fueron obtenidos por el método de extracción por arrastre de vapor; el resto del material vegetal y una muestra de los botones de Eugenia caryophyllata fueron sometidos a un proceso de extracción por el método soxhlet con solventes de distinta polaridad como etanol (el cual sólo se utilizó para la extracción de componentes de Eugenia caryophillata), y mezclas de acetona, cloroformo y diclorometano con hexano.

Para la extracción en soxhlet se repartió el material vegetal en tres partes iguales para cada mezcla de solvente; la extracción de Thymus vulgaris se realizó sólo con dos mezclas de solventes (acetona-hexano y cloroformo-hexano); con excepción de los extractos obtenidos de Allium sativum, Coriandrum sativum y Rosmarinus officinalis, en los cuales se trabajó con mezclas de los solventes en hexano en una proporción 50-50; en los demás extractos se utilizaron proporciones de solvente con hexano de 85-15. Los extractos obtenidos fueron sometidos a rota-evaporación para recuperar solvente y obtener el extracto limpio, este último fue secado en estufa a 40ºC. Los extractos de Coriandrum sativum y Rosmarinus officinalis fueron disueltos en aceite de canola; los extractos de Thymus vulgaris fueron disueltos en hexano, y los demás extractos se obtuvieron líquidos para su evaluación antibacteriana preliminar. Para la determinación de la concentración inhibitoria mínima (MIC), se disolvieron los extractos en aceite de canola.

Se trabajó con Clostridium perfringens cepa ATCC: 13124 (obtenido de Microbiologics®).

Evaluación de la actividad antibacterial

Para la determinación de la actividad antibacteriana de los diferentes extractos se utilizó el método de difusión en medio semisólido en agar perfringens OPSP Base (Charlau, Chemie S.A.). Brevemente, 20 ml del medio se mezclaron con 1 ml del inóculo de Clostridium perfringens ajustado a una concentración de 108 UFC/ml determinado por la escala de McFarland; se hicieron pozos de 5 mm de diámetro y 5 mm de profundidad, en los cuales se colocaron 50 µl de los extractos disueltos en hexano o aceite de canola, también se depositó en una caja independiente como control de susceptibilidad al microorganismo, la vancomicina (30 µg/ml), diferentes concentraciones de nitrito de sodio (125 µg/ml a 40 mg/ml); los solventes utilizados para la obtención de los extractos y el aceite de canola. Se incubó bajo condiciones de anaerobiosis a 37ºC por 18 a 24 horas; se observó la presencia de halos de inhibición y se midió el diámetro de los mismos, el cual se comparó con el obtenido de la vancomicina; se consideró que un determinado extracto tenía acción antibacteriana cuando produjo una inhibición igual o mayor al 50% de inhibición con respecto al antibiótico (18).

Cada extracto fue sometido como mínimo a dos ensayos; se reportan promedios de las mediciones hechas.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC)

Este procedimiento se realizó por el método de Kirby Bauer utilizando la misma metodología descrita anteriormente (12, 19); se hicieron diluciones de los diferentes extractos y se colocaron en pozos hechos en el medio SPS; se utilizó también como control positivo la vancomicina a una concentración de 30 µg/ ml; se hizo la lectura al cabo de 24 horas de incubación a 37ºC; la inhibición se corroboró mediante repiques de la zona de inhibición en medio SPS en tubo, con incubación por 24 horas más; la ausencia de turbidez, de gas y de un color oscuro en el medio se consideró como ausencia de crecimiento, confirmándose de esta manera la inhibición obtenida en aquellas diluciones que así la presentaron en el ensayo inicial.

RESULTADOS

En la Tabla 1 se reportan los resultados de los ensayos preliminares de la actividad antibacterial de los aceites esenciales y extractos obtenidos. Se utilizaron 16 muestras de diferente polaridad. Se observa cómo los extractos obtenidos con la mezcla hexano-acetona de Coriandrum sativum, Tymus vulgaris, Origanum vulgare y los obtenidos con la mezcla hexano-cloroformo de O. vulgare y T. vulgaris, no presentan actividad frente a la cepa bacteriana utilizada.

Al determinar la actividad antibacteriana del aceite de canola, del hexano, del diclorometano y del etanol no se observó inhibición de la cepa utilizada, mientras que la acetona, el cloroformo y el tween 20 presentaron inhibición del microorganismo (datos no mostrados). Allium sativum y Coriandrum sativum, presentaron actividad inhibitoria en los extractos obtenidos de la mezla hexano-diclorometano, así como también Rosmarinus officinalis, presentó inhibición con los extractos hexano-acetona. Todos los extractos que presentaron inhibición tuvieron unos diámetros que comparados con la vancomicina, oscilaron entre un 72 y 133% de inhibición.

Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) y las concentraciones bacteriostáticas mínimas (MBC) de las diferentes diluciones de los extractos vegetales que presentaron inhibición mayor del 50% en los estudios preliminares se reportan en la Tabla 2. Ocho de los 16 extractos obtenidos presentaron inhibición; dicha inhibición osciló entre 16 µl/ml y 63 µ/ml; sin embargo, al comprobar el efecto bactericida por repiques del cultivo, se observó crecimiento bacteriano en la mayoría de las concentraciones probadas de cada uno de los extractos, en concentraciones superiores o iguales a 250 µl/ml de extracto. A partir de los resultados obtenidos se puede afirmar entonces que la menor concentración inhibitoria mínima (MIC) se obtuvo con el aceite esencial de Eugenia caryophillata y el extracto etanólico del mismo a una concentración de 250 µl/ml, y que la menor concentración bacteriostática mínima (MBC) se obtuvo también con estos mismos extractos a una concentración de 16 µl/ml.

DISCUSIÓN

Muchos estudios en el mundo se han realizado con los aceites esenciales obtenidos de diferentes plantas clasificadas como medicinales o como especias; la intención de estos estudios ha sido diferente en el sentido de buscar compuestos que inhiban el crecimiento ya sea de bacterias, hongos, virus y parásitos en alimentos, en aguas residuales o también para ser utilizados como medicamentos. En aquellos aceites esenciales que han presentado mayor capacidad inhibitoria se han encontrado como mayores componentes del mismo, compuestos tales como el timol, el carvacrol, el linalool, el aldehído cinámico, la alicina y el eugenol (27, 32, 34); dichos aceites en las bacterias, por su acción lipofílica tienen la capacidad de pasar las membranas celulares, romper polisacáridos, ácidos grasos y lípidos, permeabilizando la membrana celular; esta permeabilización, conduce a la pérdida de iones, al colapso de la bomba de protones y a la disminución del ATP lo cual inevitablemente conduce a la muerte celular; también se ha encontrado que a nivel citoplasmático puede actuar sobre lípidos y proteínas coagulando dichas moléculas (28). Otros estudios han concluido además, que son más sensibles las bacterias Gram positivas que las Gram negativas, y este efecto está asociado con aceites esenciales que contengan carvacrol y timol los cuales tienen mayor rendimiento antibacterial (23, 24).

La mayoría de los estudios realizados utilizan aceites esenciales y microorganismos diferentes al utilizado en este estudio. La importancia en la inhibición de Clostridium perfringens radica en la capacidad toxigénica que tiene y en su capacidad de formación de esporas que lo pueden hacer bastante resistente a los efectos adversos que sobre el microorganismo puedan ejercer conservantes de origen natural como los obtenidos de plantas aromáticas y especias. En este aspecto algunos estudios realizados bajo anaerobiosis han demostrado la mayor capacidad de los compuestos obtenidos de plantas aromáticas para ejercer un efecto inhibitorio en estas condiciones que bajo condiciones de aerobiosis, ya que la baja concentración de oxígeno da lugar a pocos cambios oxidativos y aumenta la susceptibilidad de los microorganismos probados; de esta manera se ha determinado que esta actividad es mayor en los aceites obtenidos del orégano, tomillo, clavo y cilantro (29).

Bajo nuestras condiciones experimentales se observa cómo los extractos hexano-cloroformo y hexano-acetona de Origanum vulgare y Thymus vulgaris, no produjeron un efecto inhibitorio sobre C. perfringens; estudios realizados han demostrado cómo el aceite esencial de estas especias, ha tenido efecto sobre bacterias entéricas tales como Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, C. perfringens y C. botulinum (22, 27, 33), produciendo halos de inhibición que oscilan entre 7 a 24 mm; se han utilizado dichos aceites en el proceso de desinfección de aguas grises encontrándose efectos antimicrobianos a concentraciones de hasta 94 mg/L por 30 minutos, concentración a la cual se observó una inactivación total de coliformes totales (27); en otros estudios se ha demostrado su actividad en concentraciones de 0,2 µl/L frente a L. monocytogenes y E. coli, asociando este efecto al carvacrol y el timol (29). A partir de estos hallazgos se podría sugerir que los componentes activos de estas plantas se obtienen en mayor concentración por medio de arrastre de vapor que por extracción con los solventes utilizados; también se ha demostrado en algunos casos que los solventes orgánicos y detergentes tienen la capacidad de disminuir la concentración inhibitoria mínima de los aceites esenciales obtenidos de clavo y orégano (29), mientras que en otros se ha postulado que los solventes orgánicos tienen mayor capacidad de extracción de los componentes activos de las plantas en general (23, 24), tal como fue demostrado por Packiyasothy et al. (35), quienes encontraron mayor actividad antimicrobiana en los extractos obtenidos con hexano; este estudio muestra cómo los extractos hexano-cloroformo y hexano-acetona no generaron ningún efecto sobre Clostridium perfringens en particular, lo cual podría deberse a diferentes factores como la concentración de compuestos activos, la composición de dichos extractos o su capacidad reducida en afectar el metabolismo y la capacidad de esporulación de este microoarganismo; es necesario entonces realizar nuevos estudios que puedan demostrar la validez de dicha hipótesis.

El aceite esencial de Coriandrum sativum ha sido utilizado para tratar algunas dolencias no relacionadas con las enfermedades infecciosas; sin embargo, se ha demostrado que dicho aceite esencial tiene actividad antimicrobiana frente a diferentes géneros de bacterias Gram positivas (Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus) y Gram negativas; el efecto de esta planta se ha buscado tanto en las hojas como en las semillas y en los tallos de los mismos (30-32). Un estudio reciente encontró concentraciones inhibitorias mínimas del aceite esencial de esta planta en valores que oscilaron entre 108 a 217 mg/L, con porcentajes de inhibición con respecto al cloramfenicol que variaron del 25 al 51% (30); en este estudio los extractos de hexano-cloroformo y hexano diclorometano produjeron inhibición del crecimiento de Clostridium perfringens a diluciones de 63 µl/ml (correspondiente a un porcentaje de inhibición del 71% frente a la vancomicina); sin embargo, la concentración inhibitoria mínima se obtuvo solamente con el extracto puro obtenido con la mezcla hexanocloroformo; este resultado indica que los extractos probados son capaces de inhibir el crecimiento vegetativo del microorganismo, mas no su capacidad de esporulación, ni tampoco afecta la capacidad de dichas esporas para germinar cuando se colocan en un medio libre del extracto. El efecto antimicrobiano de esta planta se ha asociado con el linalool, el cual tiene la capacidad de inhibir incluso la esporulación (30); la mayor concentración del linalool se ha obtenido a partir del aceite esencial de los frutos de la planta (31, 32); a partir de los hallazgos obtenidos se podría suponer entonces que de las hojas de esta planta (el cilantro) se obtiene mayor concentración de linalool cuando se hace la extracción con la mezcla hexano-cloroformo, hallazgo que requeriría ser corroborado con el uso de métodos cromatográficos que permitan identificar y cuantificar las moléculas obtenidas en dichos extractos.

Eugenia caryophyllata y Allium sativum, presentaron MICs que oscilaron entre 250 a 500 µl/ml, siendo el aceite esencial y el extracto etanólico de E. caryiophyllata los que presentan la menor concentración inhibitoria mínima de todos los extractos probados. Savitri en 1986 (21), encuentra que los extractos de Allium sativum y Eugenia Caryophyllata, producen la inhibición en la formación de gas por parte de C. perfringens a concentraciones inferiores al 1% (10 µl/ml); esta inhibición en la producción de gas y en el cambio de color del medio de cultivo fue observada en esta investigación no sólo en las diluciones que presentaron una concentración bactericida mínima, sino también en aquellas en que se obtuvo una concentración bacteriostática mínima, siendo los extractos de E. caryiophyllata los que presentaron una menor MBC; por lo tanto, los resultados obtenidos por nosotros con los compuestos obtenidos de ambas plantas en cuanto a la concentración bacteriostática mínima, son similares a los reportados por Savitri. Es posible entonces suponer que por la capacidad de generación de esporas de resistencia, este microorganismo puede escapar al efecto bactericida de dichos extractos, permitiendo su germinación cuando las condiciones de cultivo cambian.

Se ha observado cómo hay variación en la concentración y composición de los aceites esenciales obtenidos de una misma planta; estas variaciones se pueden deber a diferentes factores como las condiciones agronómicas del suelo, las malezas presentes que compiten por nutrientes con la planta, el momento en el que se cosechan los componentes de la misma, las partes usadas para la extracción y el tipo de fertilización utilizada (29, 31, 32); la capacidad inhibitoria de los aceites y extractos utilizados en este estudio varía con respecto a lo observado en otras investigaciones, es posible que estas variaciones se deban a los factores antes mencionados, razón por la cual es necesario hacer estudios que así lo demuestren.

Son promisorios los efectos observados en los extractos y aceites esenciales obtenidos de Allium sativum, Coriandrum sativum, Rosmarinus officinalis y Eugenia caryophyllata en este estudio, su utilización en productos alimenticios va a depender de su capacidad de inhibición del crecimiento y de la esporulación de Clostridium perfringens en los alimentos, los cuales pueden tener factores que pueden interferir en la acción antimicrobiana de estos extractos (27), razón por la cual es necesario hacer estudios que demuestren la efectividad, inocuidad y poca capacidad de modificación de las condiciones organolépticas de los alimentos para poder establecer estos extractos como alternativas viables de conservación.

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