Alteraciones cromosómicas estructurales inducidas por bioflavonoides de la dieta en linfocitos de anemia de Fanconi
Structural Chromosomal Alterations Induced by Dietary Bioflavonoids in Fanconi Anemia Lymphocytes
Liliana Galeano*, Gonzalo Guevara*
*Instituto Nacional de Cancerología ESE. Grupo de Genética y Oncología Molecular. Correo electrónico: bumorchis@yahoo.es
Recibido: abril 25 de 2007 Aprobado: junio 1 de 2007
Resumen
Introducción. La anemia de Fanconi es una enfermedad genética con herencia autosómica recesiva caracterizada por aplasia medular, predisposición a leucemia mieloide aguda, tumores sólidos y aumento en la inestabilidad cromosómica. Este síndrome puede considerarse como modelo biológico para analizar sustancias naturales con posible efecto genotóxico, difíciles de evaluar en células normales. Los objetivos de este estudio son describir y cuantificar las alteraciones cromosómicas estructurales inducidas por cinco flavonas, dos isoflavonas y una droga quimioterapéutica inhibidora de la topoisomerasa II, en cultivos de linfocitos de anemia de Fanconi a fin de determinar si existe un incremento en el número y tipo de daño cromosómico respecto al control.
Materiales y métodos. Se analizaron los cromosomas de linfocitos estimulados con fitohemaglutinina M de una paciente con anemia de Fanconi. Se evaluaron 100 metafases de cada uno de los cultivos expuestos a las sustancias y control basal. Las alteraciones cromosómicas fueron documentadas con fotografías convencionales y digitales mediante analizador de imágenes. Se utilizó la prueba de c2 para determinar diferencias significativas entre el daño cromosómico entre cultivos expuestos y no expuestos con un valor de P <0,05.
Resultados. Se encontraron 431 alteraciones cromosómicas en 1000 metafases analizadas; la genisteína tuvo el mayor efecto genotóxico, seguida de la genistina, fisetina, kaenferol, quercetina, baicaleína y miricetina. Las anomalías más frecuentes fueron las rupturas cromatídicas, rupturas cromosómicas, brechas (gaps) cromatídicas y cromosómicas, intercambios cuadri-radiales, cromosomas dicéntricos y rearreglos complejos.
]]> Conclusión. Los bioflavonoides genisteína, genistina y fisetina, presentes comúnmente en la dieta, aumentaron el número de alteraciones cromosómicas de manera significativa respecto al control en linfocitos de anemia de Fanconi.Palabras clave: anemia de Fanconi, alteraciones cromosómicas, bioflavonoides, topoisomerasa II.
Summary
Introduction. Fanconi anemia is an autosomal recessive disease characterized by a variety of congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, increased chromosomal instability and higher risk to acute myeloid leukemia, solid tumors. This entity can be considered an appropriate biological model to analyze natural substances with possible genotoxic effect. The aims of this study were to describe and quantify structural chromosomal aberrations induced by 5 flavones,2 isoflavones and a topoisomerase II chemotherapeutic inhibitor in Fanconi anemia lymphocytes in order to determine chromosomal numbers changes and/ or type of chromosomal damage.
Materials and methods. Chromosomes stimulated by phytohaemagglutinin M, from Fanconi anemia lymphocytes, were analysed by conventional cytogenetic culture. For each chemical substance and controls, one hundred metaphases were evaluated. Chromosomal alterations were documented by photography and imaging analyzer. To statistical analysis was used chi square test to identify significant differences between frequencies of chromosomal damage of basal and exposed cell cultured a P value less than 0.05.
Results. There were 431 chromosomal alterations in 1000 metaphases analysed; genistein was the more genotoxic bioflavonoid, followed in descendent order by genistin, fisetin, kaempferol, quercetin, baicalein and miricetin. Chromosomal aberrations observed were: chromatid breaks, chromosomal breaks, cromatid and chromosomal gaps, quadriratials exchanges, dicentrics chromosome and complex rearrangements.
Conclusion. Bioflavonoids as genistein, genistin and fisetin, which are commonly present in the human diet, showed statistical significance in the number of chromosomal aberrations in Fanconi anemia lymphocytes, regarding the basal damage.
Key words: Fanconi Anemia, Chromosomal Alterations, Bioflavonoids, Topoisomerase II.
INTRODUCCIÓN
La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad genética con herencia autosómica recesiva (1) o ligada al sexo (2). Las principales características fenotípicas son aplasia medular progresiva, aumento en la inestabilidad cromosómica y predisposición a leucemia mieloide aguda y tumores sólidos (1-8).
]]> La AF se presenta con baja frecuencia entre la población; se asocia con baja estatura, anomalías esqueléticas en antebrazos, dedos, cadera y rodillas, malformaciones renales y coardíacas, manchas cutáneas “café con leche”, microcefalia, retraso mental e hipogonadismo en varones (3-6).Según los estudios de Kutler y col. (4), el promedio de vida de estos pacientes es de veinticuatro años, la probabilidad de desarrollar tumores sólidos a los cuarenta años es del 28% y la prevalencia de la aplasia medular es del 80%. Entre los tumores desarrollados, el 60% son hematológicos y entre los no hematológicos el más frecuente es el carcinoma de células escamosas. Hay que destacar que la expresividad es variable y que los síntomas no se presentan en todos los casos, por lo que el diagnóstico basado solo en la clínica no es completamente fiable; sin embargo, la inestabilidad cromosómica es constante, motivo por el cual se utiliza como método diagnóstico el ensayo citogenético de aberraciones cromosómicas en linfocitos de sangre periférica tras la exposición a mitomicina C (MMC) o diepoxibutano (DEB), a cuyos efectos son hipersensibles (2-5).
La AF es una enfermedad con heterogeneidad clínica y genética con al menos once genes diferentes involucrados que dan nombre a los grupos de complementación (tabla 1). No todos han sido clonados y caracterizados, y poco se sabe de sus funciones (9). Ninguno de ellos muestra homología con otras especies o con otros del genoma humano, excepto FANG, idéntico al XRCC9 en el hámster, comprometido con la hipersensibilidad a los agentes inductores de enlaces cruzados (lesiones en el ADN) (10).
Aunque se desconoce el modo preciso en que las proteínas AF actúan, las evidencias muestran que el fenotipo de la AF es consecuencia de los defectos en la reparación del ADN (11-13). El gen más afectado es FANCA (tabla 1) debido a mutaciones que en su mayoría son grandes deleciones, favorecidas por recombinaciones sobre secuencias Alu (14, 15).
Uno de los hallazgos más importantes en los últimos años ha sido el descubrimiento que FANCD1 es idéntico a BRCA2 (16, 17), reforzando el concepto de que el defecto en la reparación de las dobles rupturas de ADN es crítico en la inestabilidad genómica y tumorogénesis presentes en la AF (18, 19).
La topoisomerasa II es una enzima nuclear que interviene en procesos de segregación cromosómica, recombinación, condensación y disyunción de cromátides hermanas; adicionalmente, relaja el estado topológico del ADN mediante cortes y religamientos de la doble cadena. Los inhibidores de topoisomerasa II actúan formando un complejo covalente intermediario entre la enzima y el ADN, inhibiendo su función y, en consecuencia, induciendo daño citotóxico (20-22). La droga más reconocida de este grupo es el etopósido, que se usa como agente terapéutico en tumores malignos (23-26).
Estudios recientes han considerado los bioflavonoides como inhibidores naturales de la topoisomerasa II (27). Estas sustancias se encuentran de forma ubicua en las flores y frutos de plantas, donde se han identificado más de 4000 variedades de los siguientes grupos: flavonas, flavanonas, isoflavonas, flavonoles y flavanoles (27-30).
Dado que en la anemia de Fanconi se presenta un aumento en la inestabilidad cromosómica, secundario a las deficiencias en la maquinaria de reparación de las rupturas del ADN, esta enfermedad podría ser utilizada como modelo biológico para analizar sustancias con posible potencial genotóxico y difíciles de evaluar en células normales.
Este artículo pretende describir y cuantificar, mediante análisis citogenético convencional, las aberraciones cromosómicas estructurales (figura 1) inducidas en linfocitos, provenientes de un paciente con AF, por siete inhibidores naturales de topoisomerasa II: cinco flavonas (baicaleína, miricetina, quercetina, fisetina, kaenferol) y dos isoflavonas (genisteína y genistina), con el objetivo de determinar si estas sustancias aumentan el número y tipo de daño cromosómico con respecto al control.
Tabla 1. Genes involucrados en AF, localización, tamaño y prevalencia de cada uno de ellos
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Figura 1. Alteraciones cromosómicas estructurales
a) Ruptura cromatídica con fragmento acéntrico alineado. b) ruptura cromosómica con fragmento acéntrico alineado. c) Ruptura cromatídica con fragmento acéntrico desplazado. d) Ruptura cromosómica con fragmentos acéntricos desplazados. e) Lesión acromática o gap cromatídico. f) Lesión acromática o
gap cromosómico. g) Cromosoma dicéntrico. h) Intercambio cuadri-radial. i) Rearreglo complejo (31-32).
METODOLOGÍA
Se analizó una paciente con diagnóstico clínico de anemia de Fanconi y prueba de sensibilidad citogenética a mitomicina C. Se extrajeron 20 mL de sangre venosa periférica en tubos con heparina y se utilizaron 2 mL por cada exposición a 200 mM de los bioflavonoides, dimetilsulfóxido (DMSO, diluyente) (32) y a 0,017 mM de etopósido como control positivo (induce aproximadamente 10% de aberraciones cromosómicas en células normales) (31, 32) durante dos horas.
A continuación se hicieron cultivos adicionando 3,5 mL de medio de cultivo RPMI 1640 (enriquecido con L-glutamina), 1,5 mL de suero bovino fetal y 0,2 mL de fitohemaglutinina M. Después de 72 horas de incubación a 37 °C, se hizo la extracción de metafases agregando 0,1 mL de colcemid por cada mL de cultivo y resuspensión de las células en una solución hipotónica de cloruro de sodio (0,075 M). Una vez lavado el material cromosómico con una solución fijadora (metanol/ácido acético), se extendió sobre láminas de vidrio para la coloración con una solución de quinacrina al 0,5% (bandas Q).
Por último, se analizaron por cada ensayo 100 metafases en un microscopio con lámpara de fluorescencia y la observación de dos evaluadores independientes. Todas las aberraciones se documentaron mediante fotografías convencionales y digitales.
]]> Se utilizó la prueba de c2 (statistix 7.0) para determinar diferencias significativas de las frecuencias del número y tipo de aberraciones cromosómicas entre los cultivos celulares expuestos a bioflavonoides y controles, con P< 0,05.RESULTADOS
El grupo de bioflavonoides conformado por genisteína, genistina y fisetina indujeron de manera significativa un número mayor de alteraciones respecto al grupo de quercetina, baicaleína y miricetina, que no se diferenció respecto al control basal y exposición a DMSO (figura 2 y tabla 2). En general, todos los compuestos causaron rupturas cromatídicas; fisetina fue el bioflavonoide que las indujo con mayor frecuencia. En menor frecuencia se dieron las brechas cromosómicas y cromatídicas, reordenamientos complejos, intercambios cuadri-radiales y cromosomas dicéntricos (tabla 2).
Con respecto al control basal, la frecuencia de alteraciones cromosómicas aumentó con diferencias significativas en los cultivos celulares expuestos a genisteína (62%), genistina (56%), fisetina (55%) y kaenferol (46%). No hubo diferencias significativas entre el daño cromosómico basal y el inducido por DMSO, indicando que el diluyente no influyó en el aumento de las alteraciones cromosómicas.
El etopósido no mostró diferencias significativas en la inducción de anomalías cromosómicas, comparado con las provocadas por genisteína, genistina, fisetina, baicaleína y kaenferol (tabla 2 y 3).
Las figuras 3-6 muestran ejemplos de alteraciones cromosómicas observadas con mayor frecuencia en el control basal y expuestos a bioflavonoides.
DISCUSIÓN
El mantenimiento de la estabilidad genética requiere de una serie de mecanismos complejos que involucra señalización y detención del ciclo celular hasta que la lesión sea reparada, o inducción a la apoptosis cuando este daño es irreversible. El daño en alguno de los genes involucrados en estas rutas conduce a la inestabilidad genética y a enfermedades que predisponen al cáncer.
Figura 3. Metafase del cultivo celular expuesto a genistina
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Figura 4. Metafase del cultivo celular basal
Cromosoma dicéntrico.
Figura 5. Metafase del cultivo celular expuesto abaicaleína
Intercambio cuadrirradial.
Figura 6. Metafase del cultivo celular expuesto a genisteína
Rearreglo complejo.
La escasa literatura que se refiere a la genotoxicidad de los bioflavonoides sugiere que las isoflavonas, como genisteína y genistina, son los más potentes. Esto concuerda con los resultados mostrados aquí sobre las células de anemia de Fanconi. Otra observación importante se relaciona con que la baicaleína, aunque indujo el mayor número de rearreglos complejos, perteneció al subgrupo de menor daño cromosómico. Esto podría indicar que el tipo de daño, además de la dosis, depende de la subclase de bioflavonoide. Este mismo resultado lo hemos encontrado en células normales expuestas a baicaleína.
El uso de las células de anemia de Fanconi facilita la magnificación de la acción de los genotóxicos, sin que esto indique que la intensidad y el tipo de daño ocurran de igual manera en células normales que posean una maquinaría de reparación eficiente; sin embargo, no todos los individuos en una población tienen la misma eficiencia reparativa y ante prolongadas exposiciones, como sucede en la dieta, en individuos susceptibles podrían generarse dichos rearreglos. Por el contrario, los compuestos que no induzcan incrementos en los rearreglos cromosómicos en células de anemia de Fanconi seguramente no lo harán en células normales.
Aunque las dosis empleadas en los ensayos son altas respecto al consumo diario de un individuo normal, el modelo de la anemia de Fanconi podría facilitar el análisis de dosis respuesta y posibles efectos de las concentraciones fisiológicas.
Es claro que la mayoría de bioflavonoides con acción genotóxica actúan a través de la inhibición de la topoisomerasa II, similar al etopósido. In vitro se ha demostrado que algunas flavonas e isoflavonas tienen la capacidad de romper el gen MLL en los mismos puntos donde lo hace el etopósido (27), relacionando de esta manera su posible responsabilidad en las traslocaciones que involucran este gen.
En conclusión, se requiere llevar a cabo más investigaciones en este sentido para confirmar que las células de anemia de Fanconi se pueden utilizar en la evaluación genotóxica. Además, este artículo demostró las bondades de este modelo empleando los bioflavonoides como débiles inductores de daño citogenético.
Tabla 2. Descripción del tipo y número de alteraciones cromosómicas del cultivo celular control y expuestos
Tabla 3. Comparación entre las sustancias respecto al número de alteraciones cromosómicas
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Figura 2. Porcentaje de alteraciones cromosómicas de cada cultivo celular
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