CULTIVO DE TEJIDO CARTILAGINOSO ARTICULAR: ACERCAMIENTO CONCEPTUAL
Natalia María Zapata*, Natalia Janet Zuluaga*, Silvia Natalia Betancur*, Luis Ernesto López**
* Ingeniera Biomédica EIA-CES, Investigadora del Grupo de Investigación en Ingeniería Biomédica EIA-CES (Gibec), Escuela de Ingeniería de Antioquia (EIA) y Universidad CES. nzapata@eia.edu.co; nzuluaga@gebarco.com.co; nbetancur@gebarco.com.co
** Biólogo, Universidad de Antioquia; Magíster en Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia. Jefe del Programa de Biología CES-EIA, director del Grupo de Investigación en Ingeniería Biomédica EIA-CES (Gibec) y docente de Ingeniería Biomédica EIA-CES. lelopez@ces.edu.co
Artículo recibido 9-III-2007. Aprobado 19-XI-2007
Discusión abierta hasta junio de 2008
RESUMEN
Con los métodos disponibles en el momento para la reconstrucción de tejidos, la reparación de defectos del tejido cartilaginoso no ha sido alcanzada completamente. Por esta razón, se ha recurrido a la ingeniería de tejidos, que busca el desarrollo de estrategias para obtener sustitutos funcionales de tejido cartilaginoso, con el fin de ofrecer soluciones terapéuticas a pacientes con pérdida o falla de este tipo de tejido. En el presente estudio se hace una breve revisión de la anatomía, histología, fisiología y patología del tejido cartilaginoso y de las terapias usuales para su reparación, además de dar a conocer el papel cumplido por la ingeniería de tejidos y los biomateriales en el desarrollo de soluciones terapéuticas en este campo.
PALABRAS CLAVE: cartílago; lesiones; terapias; ingeniería de tejidos; biomateriales.
The currently available methods for tissue repair have not been able to restore completely functional cartilage tissue. For this reason, tissue engineering has developed strategies for fabricating cartilage substitutes in order to offer therapeutic solutions to patients that could suffer from any kind of cartilage disease. The purpose of this article was to review the anatomy, histology, physiology, pathology of cartilage, and the therapies commonly used for repairing this tissue. This article also shows the role established by tissue engineering and biomaterials in this field.
KEY WORDS: cartilage; injuries; therapies; tissue engineering; biomaterials.
1. INTRODUCCIÓN
Se ha encontrado que las lesiones aisladas y no tratadas del cartílago hialino articular pueden llevar a un daño grande del tejido y concluir fácilmente en el desarrollo de enfermedades degenerativas del tejido cartilaginoso, como es la osteoartritis temprana (Grunder et al., 2004). Por esta razón, es importante generar estrategias que permitan la reparación de las lesiones del cartílago y se evite también el progreso de estas afecciones (Martin et al., 2005).
Los métodos utilizados hasta ahora proponen diversas estrategias para la reparación de defectos del tejido cartilaginoso, entre las que cabe resaltar el uso de trasplantes de tejido autólogo (tejido del mismo paciente), heterólogo (tejido de un donante de la misma especie) o xenotrasplantes (tejido de un organismo de una especie diferente a la del receptor). Sin embargo, no es fácil encontrar donantes compatibles ni obtener un fragmento de tamaño y forma adecuados, lo que dificulta el uso generalizado de estas técnicas. Además, tanto el paciente como el donante se exponen a un alto riesgo de morbilidad e infección posteriores a la intervención quirúrgica, lo cual puede causar daño en la articulación afectada (Bryant y Anseth, 2001; Martin et al., 2005).
Otro método usado es el implante de cartílago obtenido mediante el cultivo in vitro bidimensional, el cual produce una dediferenciación celular, caracterizada por la pérdida de la morfología y el patrón de expresión génica propio del tejido cartilaginoso (Masuda et al., 2003; De la Fuente et al., 2004; Gaissmaier et al., 2005). Los resultados de varios estudios han sugerido que la encapsulación de condrocitos en diferentes biomateriales mantiene el fenotipo cartilaginoso in vitro por períodos de tiempo largos. Éstos permiten la generación de una matriz extracelular compuesta por colágeno tipo II y agrecán, lo que hace de este tejido un sustituto más funcional de cartílago, con ciertas similitudes al encontrado in vivo (Almqvist et al., 2001; Masuda et al., 2003; Saas et al., 2004; Grunder et al., 2004).
En el presente estudio se hace una breve revisión de la anatomía, histología, fisiología y patología del tejido cartilaginoso, además del papel de la ingeniería de tejidos y los biomateriales en el desarrollo de soluciones terapéuticas.
2. EL CARTÍLAGO
Según su histología, el cartílago se clasifica en cartílago hialino articular, cartílago hialino no articular, cartílago elástico y fibrocartílago. El cartílago hialino articular recubre la superficie articular de los huesos largos y la extremidad ventral de las costillas. Por su parte, el cartílago hialino no articular se encuentra en las fosas nasales, la tráquea y los bronquios. El cartílago elástico está presente en el pabellón de la oreja, el conducto auditivo externo, la trompa de Eustaquio y la laringe. Por último, el fibrocartílago hace parte de los discos intervertebrales y de la inserción de tendones o ligamentos en los huesos (Fankhauser, 2004).
]]> El tejido cartilaginoso está compuesto por las células condrogénicas, los condroblastos y los condrocitos, los cuales presentan diferentes características de acuerdo con el tipo de cartílago en el que se encuentren. Los condrocitos comprenden entre el 1 % y el 2 % (v/v) del cartílago hialino articular humano. En la edad adulta, los condrocitos generalmente no se dividen y su función es ayudar a mantener la integridad de la superficie articular mediante actividades sintéticas y catabólicas (Martin et al., 2005).El cartílago presenta una matriz extracelular compuesta de agua, gases, metabolitos, cationes y un conjunto de macromoléculas que incluyen colágeno tipo II y proteoglucanos. Entre estos últimos se encuentran el condroitin sulfato, el agrecán y pequeñas cantidades de decorina, biglucano y fibromodulina, otros tipos de colágenos fibrilares, no fibrilares y moléculas no colagenosas adicionales (Martin et al., 2004; Girotto et al., 2003; Häuselmann et al., 1994).
La presencia de colágeno tipo II es predominante. Esta molécula se sintetiza de dos formas, colágeno tipo IIA y IIB. El colágeno tipo IIA es sintetizado por las células mesenquimatosas y epiteliales de tejidos precartilaginosos y no cartilaginosos, mientras el tipo IIB es sintetizado sólo por los condrocitos. Por lo tanto, durante la diferenciación en tejidos en proceso de condrogénesis no se expresan los genes para el procolágeno tipo IIA, pero sí los de tipo IIB (Sandell et al., 1991; Ng et al., 1993).
Por otra parte, los proteoglucanos, debido a su carga negativa, atraen cationes de sodio (Na+) y, por ende, moléculas de agua, hidratando la matriz del cartílago hasta un 80 %.Esto le confiere la resistencia característica frente a las fuerzas de compresión. Además, las cadenas laterales de glucosaminoglucanos forman enlaces electrostáticos con el colágeno, de esta forma, la sustancia básica y las fibras de la matriz forman una estructura molecular cruzada resistente a las fuerzas de tensión. Dentro de los proteoglucanos, el agrecán es el más destacado (Hall et al., 1996).
3. LESIONES DEL CARTÍLAGO ARTICULAR
Clínicamente, las lesiones del tejido cartilaginoso se deben a defectos generalizados o a defectos focales. Los primeros afectan todo el tejido y se deben ante todo a la osteoartritis; los segundos comprometen una pequeña porción y se deben a traumas en las articulaciones (Grunder et al., 2004; Toegel et al., 2007).
La integridad del cartílago articular se mantiene mediante la liberación regulada de hormonas, factores de crecimiento y citoquinas (tabla 1) producidas por los condrocitos, que a su vez regulan la división celular, la síntesis y la degradación de la matriz extracelular condrogénica. Cuando el cartílago articular se lesiona, se pierde el equilibrio proporcionado por los factores presentes en el tejido, lo cual genera una respuesta de los condrocitos que consiste en el incremento de la proliferación celular y de la síntesis de matriz en el sitio de la lesión. Sin embargo, esta respuesta es temporal y cesa muy pronto, posiblemente debido a la falta de una provisión constante de estos factores (Martin et al., 2005; Buckwalter, 1998).
El suministro de factores de crecimiento y de diferenciación se realiza únicamente por difusión del fluido sinovial (Mankin, 1974); además, algunos de los proteoglucanos de la matriz tienen propiedades que pueden prevenir la adhesión celular, limitando así cualquier proceso de reparación. Lo anterior hace difícil la integración adecuada del tejido en reparación y el cartílago natural (Martin et al., 2004; Mankin, 1974).
Después de una lesión, el cartílago articular tiene una capacidad muy limitada de autorregeneración, ya que no es penetrado por vasos sanguíneos ni linfáticos (Martin et al., 2004; Bryant y Anseth, 2001). Este tejido puede degenerarse mucho antes de que los síntomas clínicos se hagan evidentes.
4. TERAPIAS PARA LA REPARACIÓN DEL CARTÍLAGO ARTICULAR
]]> Entre las técnicas más utilizadas para la reparación de lesiones del cartílago articular se encuentran:Las prótesis, por lo general, eliminan el dolor y restablecen en forma parcial la funcionalidad, pero su durabilidad es limitada (Risbud et al., 2001; Temenoff y Mikos, 2000). Por esto, principalmente para personas jóvenes, es importante identificar procedimientos alternativos para reparar, de forma permanente, las lesiones del cartílago o, por lo menos, para retrasar el implante de una articulación artificial.
La microfractura consiste en perforar la superficie subcondral para que las células progenitoras mesenquimatosas, provenientes de la médula, alcancen la lesión y formen la nueva matriz cartilaginosa. No obstante, el tejido regenerado carece de la estructura, composición, propiedades mecánicas y durabilidad del cartílago articular (Martin et al., 2005).
Los autoinjertos y aloinjertos consisten en aislar periostio autólogo o heterólgo respectivamente y encajarlos a presión dentro de agujeros perforados
en el lugar de la lesión para producir tejido cartilaginoso. No obstante, el principal limitante de este tipo de procedimientos es la disponibilidad y compatibilidad del tejido del donante y la morbilidad inducida en el paciente (Bryant y Anseth, 2001; Martin et al., 2004).
La técnica de implante de condrocitos autólogos consiste en aislar enzimáticamente condrocitos articulares sanos, los cuales son expandidos por medio de un cultivo en monocapa y luego reinsertados en el sitio del defecto debajo del periostio. Las principales limitantes de esta técnica son el mecanismo de fijación del injerto y la confiabilidad de los métodos utilizados para evaluar la funcionalidad de los implantes in vivo (Martin et al., 2005). Por lo anterior, la contribución de esta técnica en la reparación de defectos de cartílago está por definir (Beris et al., 2005).
Otra forma prometedora de inducir la formación de cartílago es mediante la inyección local de factores de crecimiento, proteínas funcionales y factores
de transcripción. Sin embargo, hay limitaciones en cuanto al mantenimiento de las concentraciones adecuadas en los sitios afectados durante los periodos requeridos. Igualmente, la aplicación directa de estas sustancias tiene una vida media muy corta. Entonces, es importante que los factores de reparación puedan sintetizarse localmente de una forma sostenida y controlable en el sitio del defecto. Por lo tanto, los factores producidos de manera endógena pueden ser eficientes (Martin et al., 2005; Schuler et al., 2000). En la tabla 1 se mencionan los principales factores relacionados con la condrogénesis y el mantenimiento de la integridad del tejido cartilaginoso.
5. LA INGENIERÍA DEL TEJIDO CARTILAGINOSO
El objetivo principal de la ingeniería de tejidos es buscar la aplicación de los principios de la ingeniería y de las ciencias de la vida en el desarrollo de sustitutos que restauren, mantengan o mejoren las funciones de un tejido específico (Langer y Vacanti, 1993). En particular, la ingeniería del tejido cartilaginoso
busca generar implantes in vitro que puedan ser funcional y estructuralmente competentes a partir de células autólogas (Gaissmaier et al., 2005).
El implante de tejido cartilaginoso generado in vitro, comparado con los procedimientos mencionados, permite mejor fijación y recuperación más eficiente de la actividad de la articulación. Para generar in vitro tejido cartilaginoso uniforme y de tamaño definido a partir de células humanas, es necesario primero identificar una fuente apropiada de células condrogénicas, ya que extraer una biopsia de una articulación significa causar un daño adicional a la superficie del cartílago. Segundo, definir los factores bioactivos requeridos por estas células, las características de las matrices de cultivo tridimensionales en las que las células se cultivan y la estimulación física que deben tener para facilitar el desarrollo y la maduración del cartílago en un ambiente controlado (Lee et al., 2000; Martin et al., 2005).
5.1 Fuentes celulares
]]> Con el fin de solucionar los inconvenientes en cuanto a la fuente celular, se han propuesto algunas opciones, ya sea para aprovechar eficientemente una biopsia de cartílago articular o utilizar otras fuentes celulares que incluyen condrocitos de cartílago no articular o células madre mesenquimatosas (Martin et al., 2005).En el uso de condrocitos articulares humanos para este fin, se ha visto que su proliferación in vitro se limita y disminuye con la edad del paciente (Evans y Georgescu, 1983). Esta técnica requiere el aislamiento de los condrocitos de su ambiente natural y luego su cultivo en monocapa, hasta alcanzar la cantidad de células apropiada, sin embargo, en este tipo de cultivo, los condrocitos rápidamente cambian su perfil biosintético a un fenotipo similar al de los fibroblastos (Masuda et al., 2003; Schnabel et al., 2002; De la Fuente et al., 2004; Gaissmaier et al., 2005); este fenómeno se conoce como dediferenciación celular (Marijnissen et al., 2000; Furukawa et al., 1980; Takigawa et al., 1987; Livne, 1994). Una vez que los condrocitos están dediferenciados, su capacidad de rediferenciación es muy pequeña (De Haart et al., 1999). No obstante, cuando los condrocitos se transfieren a una matriz tridimensional, se ha visto que el perfil biosintético de estas células se estabiliza (Zaucke et al., 2001; Häuselmann et al., 1994; Bonaventure et al., 1994; Liu et al., 1998).
Es posible obtener condrocitos a partir de cartílago hialino no articular mediante biopsias del cartílago de la nariz o las costillas, utilizando un procedimiento menos invasivo que la extracción de cartílago de una articulación. Además, debido a que el sitio de toma de la biopsia no está sometido a fuerzas compresivas, hay un menor riesgo de daño. Recientemente, se ha demostrado que en relación con los condrocitos articulares, los condrocitos humanos provenientes del septo nasal proliferan unas cuatro veces más rápidamente y tienen una mayor capacidad para generar tejido cartilaginoso después del cultivo en monocapa (Kafienah et al., 2002). No obstante, se harían necesarios más datos de estudios in vivo para demostrar la funcionalidad de los condrocitos nasales en sitios donde normalmente se encuentra cartílago hialino articular (Martin et al., 2005).
Una alternativa al uso de condrocitos diferenciados es el uso de células madre. Éstas tienen mayor capacidad de proliferación, mejor respuesta a los factores de crecimiento y potencial de diferenciarse en diversos tipos de células especializadas, incluso en personas de edad avanzada (Chen et al., 2004; Martin et al., 2005).
Para la ingeniería de cartílago se ha incrementado el uso de células madre provenientes de diferentes fuentes que incluyen médula ósea (Pittenger et al., 1999; Awad et al., 2004; Gurevitch et al., 2003), hueso trabecular, tejido muscular, tejido adiposo (Awad et al., 2004; Gurevitch et al., 2003), membrana sinovial (De Bari et al., 2001), entre otros. No obstante, su utilidad se ha visto limitada por la dificultad para ejercer un control preciso sobre su potencial de diferenciación (Martin et al., 2005).
5.2 Los biomateriales
Las propiedades funcionales de un sustituto de cartílago obtenido por medio de la ingeniería de tejidos dependen en gran parte de la selección del biomaterial apropiado para la construcción de una matriz tridimensional. Los biomateriales utilizados en el diseño de matrices tridimensionales para la ingeniería de tejidos deben cumplir varios criterios, con el fin de maximizar las posibilidades de reparación exitosa. Entre estos criterios podemos encontrar la biodegradabilidad y biocompatibilidad del biomaterial, la capacidad de difusión para el transporte de nutrientes y metabolitos, la habilidad para regular la morfología celular que afecta la diferenciación y la presencia de ligandos bioactivos que proporcionen sitios de fijación para las células (Freed et al., 1993; Awad et al., 2004).
Uno de los obstáculos para la ingeniería del tejido cartilaginoso ha sido el desarrollo de una matriz de cultivo tridimensional que tenga las propiedades mecánicas que se requieren, tales como la capacidad para enfrentar los grandes esfuerzos de contacto y las tensiones de una articulación. Además, debe permitir el crecimiento de tejido funcional y las interacciones apropiadas entre las células y la matriz para estimular el crecimiento del tejido (Guilak et al., 2001; Butler et al., 2000). Es importante que estas matrices también permitan la obtención de tejidos de diferente grosor de acuerdo con el requerimiento in vivo, ya que el cartílago articular humano varía en grosor según su ubicación (Bryant y Anseth, 2001).
En la construcción de matrices para la regeneración de cartílago se han utilizado materiales como hidrogeles de alginato y agarosa, polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, polímeros de gelificación termorreversible, compuestos de la matriz extracelular y algunos materiales naturales y sintéticos utilizados como portadores. Diferentes hidrogeles a base de alginato (Cao et al., 1998; Paige et al., 1995), fibrina (Sims et al., 1998; Silverman et al., 1999), agarosa (Rowley et al., 1999) y óxido de polietileno (Elisseeff et al., 1999) se han utilizado para la encapsulación de condrocitos y su posterior implantación in vivo. Sin embargo, estos materiales presentan algunas limitantes en cuanto a sus propiedades mecánicas (Awad et al., 2004; Bryant y Anseth, 2001). Las células de cartílago cultivadas en esferas de alginato se han estudiado en modelos animales de conejo mediante su implantación en articulaciones que presentan daño estructural del cartílago y se ha logrando una reparación completa del defecto después de 6 meses de tratamiento (Fragonas et al., 2000). En la tabla 2 se describen algunos de los materiales usados en la construcción de matrices tridimensionales para el cultivo de tejido cartilaginoso.
En algunos casos, el implante in vivo de sustitutos de cartílago construidos a partir de ingeniería de tejidos se puede facilitar con el uso de un material portador. Éste puede proporcionar fuerza a los biomateriales débiles, además de mantener las células dentro del sustituto. Un portador ideal debe ofrecer la posibilidad de ser moldeable en casi cualquier forma y su biodegradación no debe tener ningún efecto adverso sobre la viabilidad o el metabolismo celular (Freed et al., 1994a; Marijnissen et al., 2000). En la tabla 3 se encuentran materiales usados como portadores, uno natural y otro sintético, además de sus ventajas y desventajas.
]]> 6. CONCLUSIÓNLa comunidad científica mundial sigue en la búsqueda de tratamientos de las lesiones del cartílago articular, lo que se evidencia en la diversidad de estrategias desarrolladas en los últimos años en este campo.
De los tratamientos usados en la actualidad el propuesto por la ingeniería de tejidos constituye la mejor opción por cinco razones básicas: (1) cuenta con diversidad de fuentes celulares y de biomateriales disponibles para experimentación, (2) la elección de la fuente celular y del biomaterial adecuados puede evitar la morbilidad y el rechazo del implante por parte del paciente, (3) las propiedades del tejido in vitro pueden llegar a ser muy similares a las del tejido in vivo, (4) el implante generado permite una mejor fijación y una recuperación más eficiente de la actividad de la articulación, (5) la técnica puede ser reproducible. Finalmente, es necesario realizar investigaciones locales que permitan apropiarse de estos avances en el campo de la ingeniería de tejidos cartilaginosos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos al programa de Jóvenes Investigadores e Innovadores de Colciencias (convenio 111-2005), a la Escuela de Ingeniería de Antioquia –EIA–, a la Universidad CES, al doctor Francisco Valencia y sus colaboradores de la planta de faenado de la Central Ganadera de Medellín S.A. en Medellín, Colombia.
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