TOXICITY EVALUATION AS A TOOL TO ASSES THE PERFORMANCE OF AN ANAEROBIC IMMOBILIZED BIOMASS REACTOR

TATIANA RODRIGUEZ CHAPARRO
Universidad Militar Nueva Granada, Bogotá-Colombia
Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de São Paul, Brasil, adela.rodriguez@unimilitar.edu.co

EDUARDO CLETO PIRES
Escola de Engenharia de São Carlos, Universidade de São Paul, Brasil, ecpires@sc.usp.br

Recibido para revisar Julio 9 de 2009, aceptado Agosto 11 de 2010, versión final Agosto 24 de 2010

RESUMEN: Los efluentes de la Industria de Papel y Celulosa son usualmente tóxicos y mutagénicos. Esa característica se deriva principalmente por la presencia de compuestos xenobióticos formados durante el proceso. Los parámetros globales para el análisis de la calidad del agua como: demanda química de oxigeno, carbón orgánico total, entre otros, no permiten identificar si el potencial toxicológico es remediado después de los tratamientos. El objetivo de este trabajo fue evaluar el desempeño de un reactor anaerobio horizontal de biomasa inmovilizada (RAHBI) tratando un efluente real de blanqueamiento de celulosa Kraft, por medio de ensayos de toxicidad (Daphnia similis - Ceriodaphnia silvestrii), mutagenicidad y citotoxicidad (Allium cepa L.). Los resultados mostraron alta sensibilidad de todos los organismos estudiados y buena capacidad del reactor anaerobio para remover compuestos que ejercen efectos tóxicos y mutagénicos. Los bioensayos estudiados representan una alternativa interesante para el análisis de la calidad del agua y para la evaluación del desempeño de tratamientos.

PALABRAS CLAVE: AOX, Celulosa, Kraft, toxicidad, mutagenicidad.

ABSTRACT: Effluents from pulp mill are usually toxic and mutagenic. This characteristic is mainly a consequence of xenobiotic compounds that are formed during the process. Global parameters such as chemical oxidation demand, total organic carbon and others, do not permit identify whether the toxic potential was remedied by the treatments or not. The objective of this research was to evaluate the performance of an horizontal-flow anaerobic immobilized biomass reactor (HAIB) treating the bleaching effluent from a Kraft pulp mill using toxicological (Daphnia similis - Ceriodaphnia silvestrii) mutagenicity and citotoxicological assays (Allium cepa L). The results showed high sensibility of the test-organisms and capability of the anaerobic reactor to remove compounds that are exerting toxic and mutagenic effects. The bioassays represented an attractive alternative to water quality analyzes and the performance evaluation of treatments.

KEY WORDS: AOX, Celulose, Kraft, toxicity, mutagenicity.

1. INTRODUCCIÓN

El papel es hecho principalmente a partir de fibras de celulosa y la madera es la principal fuente de materia prima. La madera contiene aproximadamente 50% de agua y la fracción sólida esta compuesta principalmente por 45% de celulosa, 25% de hemicelulosa, 25% de lignina y 5% de otros materiales orgánicos e inorgánicos. La fabricación de papel y celulosa se base en una serie de procesos que tienen como finalidad remover lignina y otros compuestos responsables por la coloración del producto. El proceso Kraft, que actualmente domina la producción mundial de papel y celulosa, utiliza productos como el bisulfito de sodio y el hidróxido de sodio para separar esos compuestos. Como resultado de las reacciones entre esos reactivos y los constituyentes de la madera, son formados varios subproductos, que pueden, eventualmente, estar presentes en las aguas residuales de las industrias.

La planta de blanqueamiento es considerada como la principal fuente de contaminación de la fabricación de papel y celulosa. En los efluentes generados en este proceso se encuentran compuestos clorados derivados de la lignina cuantificados como AOX (Organohalogenos absorbibles en carbono) y compuestos aromáticos. Los AOX se han relacionado con la presencia de efectos tóxicos agudos, crónicos y mutagénicos en organismos vivos [1,2,3]. Algunos autores resaltan que los compuestos de baja masa molecular, menores que 1000Da, son los que presentan los mayores riesgos toxicológicos y mutagénicos, debido principalmente a la facilidad de penetrar en la membrana celular. Sin embargo, varios de los compuestos organoclorados presentes en este tipo de efluentes son de alta masa molecular (mayores que 1000kDa) [1,4]. Esto es, aunque contribuyan con la toxicidad, pero en menor proporción, son compuestos de naturaleza recalcitrante [5].

Debido a la reconocida capacidad de degradar ciertos compuestos tóxicos, la biotecnología anaerobia, es actualmente una de las alternativas mas utilizadas en el tratamiento de efluentes líquidos industriales [6]. Varios estudios han sido reportados en la literatura en relación con la aplicación de procesos anaerobios tratando efluentes de la industria de papel y celulosa [3, 7, 8,9].

No obstante, los ensayos de toxicidad y mutagenicidad no sustituyen los análisis físico-químicos tradicionales. Mientras que los análisis físico-químicos identifican y cuantifican las sustancias toxicas, los ensayos de toxicidad evalúan el efecto de esas sustancias en los sistemas de tratamiento biológicos y los cuerpos receptores. De esa forma, análisis químicos y ensayos de toxicidad se complementan. En ese sentido, el desempeño de un reactor anaerobio de biomasa inmovilizada tratando un efluente real de una industria de papel y celulosa, se evalúo con base en ensayos de toxicidad, mutagenicidad y citotoxicidad.

2. MATERIAL Y METODOS

2.1 Agua residual
El agua residual se obtuvo de una fábrica de celulosa Kraft que utiliza la secuencia de blanqueamiento libre de cloro elemental (ECF), localizada en el estado de São Paulo- Brasil. Esta industria procesa aproximadamente 630.000 toneladas anuales de madera, principalmente Eucalipto. Los efluentes generados en la planta de blanqueamiento son de dos tipos, el efluente acido, que se genera después de la oxidación con dióxido de cloro y el efluente básico, generado después de la extracción alcalina. Los dos son descartados en las industrias en proporciones de 60% y 40%, respectivamente. Esas proporciones se mantuvieron en la preparación del agua residual utilizada en este trabajo.

2.2 Reactor anaerobio horizontal de biomasa inmovilizada
Se utilizó el reactor anaerobio horizontal de biomasa inmovilizada (RAHBI) desarrollado por [11]. El principio de esta tecnología se basa en la inmovilización de células en matrices de materiales que permitan la retención de biomasa, aumentado de esta forma, el volumen útil del reactor debido a la reducción del volumen destinado a la separación del gas generado y el flujo del agua próximo a flujo pistón.

El reactor RAHBI se construyo en acrílico con una longitud de 100 cm, diámetro de 5 cm, lo que resulto en un volumen total aproximado de 1964 mL. Se instaló en una cámara revestida de icopor, termo controlada por un termostato electrónico para mantener la temperatura media en 30±2 ºC. Antes de la alimentación del reactor, el agua residual (mezcla del efluente acido con el efluente alcalino) era ajustada para mantener un valor de pH en torno de 7,0±0,5. Así mismo, y conforme encontrado en la literatura [6] para mantener la relación DQO:N:P igual a 500:5:1, fue adicionada urea y fosfato monobásico de sodio.

Una masa de 25 g de lodo granulado, proveniente de un reactor de manto de lodos de flujo ascendente (UASB) que trata el efluente de una industria Avícola, se inmovilizo en cubos de espuma de poliuretano de 0,5 cm de arista, con densidad aparente de 23 kg/m³ siguiendo la metodología de inmovilización propuesta por [11]. La porosidad de la espuma (ε) fue aproximadamente 0,4, lo que resulto en un volumen del liquido de 800 mL. El reactor operó con un tiempo de retención hidráulica de 25 h y carga orgánica de 2,33 kgDQO/m³.día continuamente durante 306 días. Un esquema del reactor se observa en la Figura 1.

Figura 1. Esquema del Reactor anaeróbio horizontal de biomasa inmovilizada

2.3 Procedimientos experimentales
La medida de AOX es ampliamente reconocida para cuantificar la concentración de compuestos organoclorados presentes en los efluentes de las industrias de papel y celulosa. La determinación se realizó con base en el método W9 propuesto por la Scandinavian Pulp, Paper and Board [12] en el equipo Dextar Vertical 1600 fabricado por la Thermo Electron Corporation.

Bioensayos

Para el ensayo de toxicidad aguda fue escogido como organismo indicador la Daphnia similis (Crustácea, Cladócero) conocida como Pulga del agua. Los resultados se evaluaron en unidades toxicologicas agudas (UTa) de acuerdo con la expresión , en la cual CE₅₀ indica el valor de la concentración efectiva del agua residual que causa mortalidad y/o inmovilidad en el 50% de los organismos. Este valor fue calculado estadísticamente por el método Trimmed Spearman -Karber conforme sugerido por [13] utilizando el Software Toxstat 3.3. El montaje de este ensayo y el mantenimiento de las culturas siguieron las recomendaciones establecidas en [14]. La realización del ensayo de la toxicidad crónica, en el cual, se escogió como organismo indicador la Ceriodaphnia silvestrii (Crustácea, Cladócero) siguió las recomendaciones establecidas por [15]. En este caso los resultados se evaluaron en unidades toxicologicas crónicas (UTc) de acuerdo con la expresión , en la cual, ICp (25) corresponde al valor de la concentración del agua residual que causa el 25% de reducción en la reproducción de los organismos. Para el cálculo de este índice, se utilizo el método estadístico de la interpolación linear propuesto por [16].

Los agentes genotóxicos son aquellos que actúan en el DNA, alterando su estructura o función. Cuando estas alteraciones se fijan con posibilidades de ser transmitidas se denominan mutaciones [17]. Se escogió como organismo indicador para evaluar los efectos mutagénicos y citotóxicos la raíz de la cebolla común (Allium cepa L). Aproximadamente 50 semillas de cebolla común se colocaron sobre un papel filtro humedecido en agua Milli-Q en una caja Petri a temperatura de 20±5Cº para germinar. Cuando las semillas presentaron un tamaño de raíz mas o menos entre 1,5 y 2,0 cm (i.e 4 o 5 días) se transfirieron a nuevas cajas Petri humedecidas tanto con el afluente y efluente del reactor RAHBI como con el control positivo (Metil Metano Sulfonato 4.10^{- 4} M - Acros-Organics, CAS- 66-27-3) y el control negativo (Agua Milli-Q) por 48 h. Luego de este periodo las raíces fueron fijadas en una solución de Carnoy (3:1 - v/v) durante 48 h. El material fijado fue después sometido a hidrólisis acida con HCl 1N a 60ºC por 8 min. En seguida las raíces se sometieron al reactivo de Schiffi en local oscuro por 2 h. Para la preparación de las laminas, la región meristematica de la raíz fue seccionada y enseguida se aplico una gota de Carmin Acético (2%), posteriormente fue cubierta con una laminula para posterior análisis. Se evalúo la frecuencia de micronúcleos e índice mitótico (IM) presentes en 5000 células siguiendo la metodología descrita por [18,19] siendo observadas 500 células en cada lámina, para un total de 10 láminas por tratamiento. Los resultados se analizaron estadísticamente utilizando el método de Kruskal-Wallis en el Software Bioestat 5. Se considero efecto mutagénico y citotóxico positivo, para niveles de confianza de p<0,05 comparando con el control negativo. Las láminas fueron analizadas en el microscopio OLYMPUS BX51 con aumento de 400 veces y cámara acoplada CoolSNAP para registro fotográfico de los mejores resultados.

3. RESULTADOS Y DISCUSION

Figura 2. Micronúcleo en células de la región meristematica de la raíz del Allium cepa
Figure 2. Micronucleic in meristematic cells of Allium cepa roots

Tabla 1. Resultados de MN y IM en la región meristemática de la raíz de Allium cepa en los tratamientos aplicados
Table 1.Results of MN and IM in Allium cepa meristematic cells after applied treatments

El reactor anaerobio horizontal de biomasa inmovilizada (RAHBI) mostró remociones significativas en todos los efectos estudiados (Ver figura 3 y Tabla 1). Se obtuvo una disminución de 90% en la toxicidad aguda y 81% en la toxicidad crónica. Indicando como sugerido por [6] que la biodegradación de sustancias con características toxicas, presentan cinéticas relativamente lentas de crecimiento microbiano, y por tanto, la inmovilización de la biomasa puede ser la clave para tener un buen desempeño en este tipo de efluentes.

Figura 3. Toxicidad aguda, crónica y compuestos organoclorados en el reactor anaerobio horizontal de biomasa inmovilizada ]]> Figure 3. Acute, chronic toxicity and organochlorides compounds in the horizontal anaerobic immobilized biomass reactor

El análisis de la frecuencia del micronúcleo es considerada por varios autores, como una de las técnicas prometedoras en la evaluación de los efectos mutagénicos inducidos por sustancias tóxicas [21,22,23]. El micronúcleo es una estructura morfológicamente parecida al núcleo de la célula, pero de tamaño reducido (el diámetro debe estar entre 1/16 y 1/3 del núcleo principal) y generalmente presenta la misma intensidad de coloración del núcleo. Se observó en este caso, que al igual que en la toxicidad, el reactor RAHBI, mostró una buena capacidad en la reducción del efecto mutagénico, se obtuvo 73% de disminución en la frecuencia de aparición de micronúcleos. En la figura 2 se observan células de la raíz del Allium cepa L expuestas al efluente de blanqueamiento de celulosa con presencia de micronúcleos.

Autores como [20] sugieren que los niveles de citotoxicidad pueden ser determinados con base en el aumento o disminución del valor del índice mitótico, el cual además, puede ser usado como parámetro de biomonitoreo ambiental. Así, valores del IM más bajos que los del control negativo indican que el crecimiento y desarrollo de los organismos expuestos ha sido afectado por los compuestos evaluados. Por otro lado, valores del IM mayores que los del control positivo serian el resultado de aumento en la división celular, permitiendo una proliferación incontrolada del crecimiento de las células y posiblemente formación de tumores. En particular, fue observado remoción total del efecto citotóxico en el reactor RAHBI.

No obstante, es importante resaltar que, tanto las características físicas como químicas de los compuestos y grupos de compuestos que causan la toxicidad o la mutagenicidad en este tipo de efluentes aún no son totalmente conocidas y varios estudios necesitan ser realizados. Por ejemplo, los compuestos organoclorados, que son potencialmente bioacumulables y persistentes, representan apenas el 0,1% del total de los AOX que están presentes en estos efluentes.

Como se observa en la Figura 3, el RAHBI removió compuestos organoclorados medidos como AOX con un valor medio durante el periodo de operación de 46±6%, resultado próximo de los valores encontrados en la literatura (entre 45% y 60% - [1]). Sin embargo, vale la pena destacar que la mayoría de estos estudios fueron realizados con culturas metanogénicas puras y otras configuraciones de reactores. Se considero que la remoción de AOX que se presento en el RAHBI puede haber sido consecuencia del fenómeno de la descloración reductiva, una vez que fue verificado aumento en la concentración de los cloruros (datos no presentados) durante el periodo de operación. Ese fenómeno ya fue citado en la literatura por varios autores [7,24].

Otras explicaciones se pueden considerar, por ejemplo, que una fracción de los AOX, principalmente la fracción de alta masa molecular, no hidrolisable, sea retenida en el medio de soporte, y como consecuencia se tendría menor concentración en la fase liquida. Ese mecanismo ya fue reportado por [25]. No obstante, es importante resaltar que los fenómenos que influyen en la degradación anaerobia de los AOX y su relación con la presencia de efectos tóxicos y mutagénicos, aún es poco entendida.

4. CONCLUSIONES

Diferentes organismos indicadores de toxicidad, mutagenicidad y citotoxicidad fueron estudiados para evaluar el desempeño de un proceso anaerobio de biomasa inmovilizada. Los resultados mostraron que hubo remociones significativas en todos los efectos estudiados, indicando por tanto, buena capacidad del reactor anaerobio horizontal de biomasa inmovilizada para degradar sustancias con potencial toxicológico. Sin embargo, y con la finalidad de continuar removiendo la materia orgánica residual, principalmente de naturaleza recalcitrante, es necesario integrar el tratamiento anaerobio con procesos químicos y/o biológicos aerobios, de esa forma cumplir los valores de los limites permisibles de vertimiento de efluentes exigidos por la normatividad ambiental vigente. Adicionalmente, los ensayos de toxicidad y mutagenicidad ofrecen respuestas relevantes que permiten entender el comportamiento de los tratamientos aplicados desde otro punto de vista, aunque, deben ser considerados como análisis complementarios a los análisis físico-químicos tradicionales.

Los autores expresan su gratitud a la Fundação de Amparo e Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, por el apoyo financiero para el desarrollo de esta investigación y al Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNpQ por la beca de Productividad Científica para el Dr. Eduardo Cleto Pires. Especial agradecimiento a la Universidad Militar Nueva Granada (Bogotá-Colombia).

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