Análisis de polimorfismos en los genes tripanotión reductasa y cruzipaína en cepas colombianas de Trypanosoma cruzi
Winston Rojas 1, Maria Antonieta Caro 1, Juan Guillermo Lopera 1, Omar Triana 2, Juan Carlos Dib 2, Gabriel Bedoya 1
1 Genética Molecular, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
2 Grupo de Chagas, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
Recibido: 20/12/05; aceptado: 07/04/06
Introducción. Los estudios genéticos en Trypanosoma cruzi han buscado establecer asociaciones de variantes genéticas del parásito con manifestaciones clínicas de la enfermedad, origen biológico y geográfico de los aislamientos; sin embargo, los resultados de asociación con los marcadores comúnmente usados en estos estudios han generado mucha controversia, principalmente en la asociación de grupos con características clínicas y epidemiológicas de la enfermedad.
Objetivo. Se planteó determinar la variabilidad de genes que codifican para las proteínas tripanotión reductasa y cruzipaína, involucradas en mecanismos de infección y supervivencia del parásito en el hospedador mamífero, y probar la asociación de variantes génicas con origen biológico y geográfico de cepas colombianas de T. cruzi.
Materiales y métodos. Se tipificaron por reacción en cadena de la polimerasa- polimorfismo de longitud del fragmento de restricción seis SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) en tripanotión reductasa y ocho SNPs en cruzipaína en 36 cepas colombianas de T. cruzi de diferentes regiones y origen biológico.
Resultados. Con las enzimas Acy I y Hae III se determinaron tres genotipos para tripanotión reductasa. Para cruzipaína se identificaron seis genotipos con las enzimas Rsa I, Ban I y Bsu 36I.
]]> Conclusiones. Para tripanotión reductasa no fue posible establecer una asociación con el origen biológico o geográfico; sin embargo los alelos producidos en las posiciones 102 y 210, permitieron discriminar los grupos tradicionales I y II. Con los genotipos obtenidos para cruzipaína se establecieron relaciones a estos grupos, origen biológico y geográfico. Los resultados sugieren la utilidad de estos genes como marcadores moleculares para determinar y diferenciar variedades genéticas en T. cruzi.Palabras clave: Trypanosoma cruzi, genes protozoarios, polimorfismo, polimorfismo de longitud del fragmento de restricción, Colombia.
Analysis of polymorphisms in the trypanothione reductase and cruzipain genes in Colombian strains of Trypanosoma cruzi
Introduction. Genetic studies of Trypanosoma cruzi have tried to establish relations between genetic variants and their biological characteristics, such as clinical manifestations, host or geographic origin. However, much controversy exists on the associations between the commonly used DNA markers with group, clinical characteristics and disease epidemiology.
Objective. In this study determined the variability of the genes that code for the proteins trypanothione reductase and cruzipain, both involved in the infection and survival of the parasite in the mammalian host, was studied and the association between genetic polymorphism and biological and geographic sources in Colombian T. cruzi strains was examined.
Materials and methods. The genotypes for each of six SNPs (single nucleotide polymorphisms) for trypanothione reductase and eight SNPs for cruzipain genes were identified by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.in 36 T. cruzi Colombian stocks from several regions and biological origins.
Results. Three genotypes were identified for trypanothione reductase with Acy I and Hae III enzymes and six genotypes for cruzipain with the Rsa I, Ban I and Bsu 36I enzymes.
Conclusions. For trypanothione reductase ,an association was not established with biological or geographical origin; however, alleles at positions 102 and 210 allowed discrimination with groups I and II. For cruzipain, specific genotypes were associated with group, biological and geographic origin. The usefulness of molecular markers on these genes was demonstrated for the determination and differentiation of genetic varieties in T. cruzi.
Key words: Trypanosoma cruzi, genes, protozoan polymorphism, restriction fragment length polymorphism; Colombia.
Trypanosoma cruzi, el flagelado que causa la enfermedad de Chagas, realiza su ciclo de vida entre reservorios mamíferos e insectos de la familia Reduviidae. Para este protozoario se ha propuesto un modo de reproducción predominante-mente clonal (1), con lo cual se esperaría encontrar una baja diversidad. Sin embargo, al evaluar marcadores fenotípicos, morfológicos y bioquímicos (2), muchos estudios muestran, por el contrario, una alta heterogeneidad. Es razonable pensar que esta diversidad pueda estar influyendo, por lo menos en parte, en el rango variable de las manifestaciones clínicas de la enfermedad (2). Con este planteamiento se han emprendido estudios que buscan asociaciones entre la heterogeneidad genética del parásito y la heterogeneidad clínica de la enfermedad (3-9).
]]> Con el uso de marcadores de ADN anónimos (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) o en los genes kADN, espaciadores intergénicos del gen mini-exón, y en el ADN ribosomal se ha logrado determinar grupos y subgrupos de T. cruzi e incluso establecer un patrón regional en relación con estas divisiones (10-15). Sin embargo, hasta la fecha existe mucha controversia sobre las reales asociaciones entre los grupos y las características clínicas y epidemiológicas de la enfermedad, puesto que ambos grupos se han encontrado en todos los estados de transmisión, en diversas fases de la enfermedad y en sus diferentes rasgos fenotípicos (16). Es también razonable pensar que, de existir una asociación, sería útil estudiar los genes involucrados en procesos como la infección de la célula hospedera, la supervivencia y la progresión del ciclo de vida del parásito, así como aquellos útiles en evadir la respuesta inmune del hospedero, podrían ser un blanco importante.El genoma de T. cruzi consta de aproximada-mente 22.570 genes, de los cuales casi el 50% conforma grupos parálogos. Entre ellos se encuentra la cruzipaína (Crp), que pertenece a una familia de cisteín peptidasas compuesta por 20 miembros por genoma haploide (17). El porcentaje restante corresponde a genes de copia única como la tripanotión reductasa (TriR) (18).
Los tripanosomátidos carecen de la enzima glutatión peroxidasa y para defenderse del estrés oxidativo utilizan el tripanotión reducido en un sistema propio de estos organismos (19). Esta reducción es catalizada por la tripanotión reductasa, una flavoproteína dependiente de NADPH, la cual además participa en el metabolismo y detoxificación de drogas y en la reducción de precursores para la síntesis de ADN (20,21). En Leishmania spp. este sistema está involucrado en la supervivencia intracelular del parásito (22). El gen que codifica para esta enzima también ha demostrado ser útil en la determinación de grupos dentro de T. cruzi, pues ha revelado la existencia de cuatro grupos principales en lugar de las dos divisiones ya conocidas (18).
La cruzipaína pertenece a la familia de las cisteín proteinasas, y es codificada por un alto número de genes organizados como grupos localizados en diferentes cromosomas (23,24). Por tener un elevado número de copias se ha encontrado una variabilidad que va desde la ausencia de diferencias entre las copias (25) hasta formas muy divergentes, como es el caso de la cruzipaína 2 (26,27). El dominio C terminal de la cruzipaína es responsable del carácter inmunodominante antigénico de esta proteína en infecciones humanas naturales (28), en las que la gran mayoría de los anticuerpos detectados en el suero de pacientes chagásicos crónicos está dirigida contra este dominio (29). La cruzipaína y su actividad como proteasa se ha implicado en funciones tan importantes como la supervivencia y la progresión en el ciclo de vida del parásito (30,31), la penetración e invasión del tripomastigote en la célula hospedadora (32-34), la protección contra la respuesta inmune del hospedero (35) y la diseminación del parásito (2).
El análisis de las secuencias disponibles en las bases de datos para estos dos genes muestra un nivel de polimorfismo que no se ha evaluado en cepas de Colombia. Dada la importancia de estos genes en el ciclo de vida del parásito se propuso examinar la variabilidad genética de tripanotión reductasa (TriR) y cruzipaína (Crp) en relación con el origen geográfico y biológico en cepas de T. cruzi de Colombia. Conociendo la variabilidad de estos genes en cepas que circulan en nuestro país, se podrá en el futuro proponer estudios de asociación entre esta variabilidad y la enfermedad.
Materiales y métodos
Se analizaron 36 cepas colombianas de T. cruzi y 7 clones de la cepa Cas15, provenientes de diferentes hospederos, vectores y regiones de Colombia (cuadro 1). Se incluyeron las cepas de referencia Tulahuen y CL clasificadas como T. cruzi II. Todas las cepas y los clones provinieron del banco de cepas del Laboratorio de Chagas de la Universidad de Antioquia, donde son mantenidas en medio de cultivo LIT suplementado con suero bovino fetal a 27,5°C (36). El ADN del parásito se obtuvo por el método salting out (37) y su concentración se midió por densidad óptica a 260 nm (38). El ADN se disolvió en 50 µl de H2O dd y se almacenó a -20°C para su posterior genotipificación.
El diseño experimental incluyo un análisis de las secuencias disponibles en www.ncbi.nlm.nih.gov y www.tigr.org. Para TriR se usaron 41 secuencias de ADN (cuadro 2) y para Crp, 10 secuencias (nueve de Crp1 y una de Crp2, cuadro 3), las cuales fueron alineadas usando el algoritmo Clustal W (39). Para Crp2 se cuenta con mayor número de caracteres y por ello se usó como referencia para el alineamiento. La identificación de sitios polimórficos y su posible discriminación en ensayos de reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (polymerase chain reaction-restriction fragment lenght polymorphisms, PCR-RFLP) se realizó usando los programas pDRAW32 (www.acaclone.com), DAMBE (39) y DnaSP (40). Con las secuencias disponibles se diseñaron los cebadores para el fragmento de TriR (TriR directo: 5´agtgttactttcgagagcg3´; Trir inverso: 5´GTAGAAGTCGGATATTTTGG3´), los cuales amplifican una región de 564 pb, correspondiente a las posiciones 726 a 1.290 de la secuencia AF359000, pero numeradas en el cuadro 2 como posiciones 1 a 564 según el fragmento amplificado, y para el fragmento del gen Crp (Crp directo: 5´gttgagtgccagtggtttc3´; Crp reverso: 5´TGGTCAGGAGACACTGACC3´), los cuales producen un fragmento de 700 pb correspondiente a las posiciones 1.346 a 2.046 de la secuencia M90067 (cuadro 3).
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Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen de 25 µL (Tris-HCl 10mM, pH 8.0, KCl 50mM, MgCL2 2.4 mM, dNTP 0.1mM, 0.1 µM de cada cebador, 1 U Taq ADN polimerasa Promega® y 50 ng de ADN molde). El perfil térmico para ambos marcadores fue de un minuto de desnaturalización a 94°C, un minuto de alinea-miento a 54°C para Crp y 56°C para TriR y extensión del cebador por un minuto a 72°C, para un total de 35 ciclos para Crp y 30 ciclos para TriR. Las reacciones de amplificación se observaron en electroforesis en geles de agarosa al 1,5% seguida de tinción con bromuro de etidio.
Los fragmentos amplificados incluyen regiones polimórficas que pueden ser resueltas con las enzimas mostradas en las cuadros 2 y cuadro 3. Para cruzipaína, las enzimas Rsa I, Bsu 36I y Ban I permiten la diferenciación de polimorfismos en tercera posición, mientras que Dra III permite la identificación de una transición A:G en la posición 457, la cual da lugar a un cambio de alanina por serina. Ambas formas de la cruzipaína poseen los tres sitios de corte identificados para la enzima Rsa I. Sin embargo, a diferencia de la Crp1, la Crp2 carece de diana de corte en la posición 142 para la enzima Ban I (cuadro 3). Las enzimas Bsu 36I y Dra III carecen de sitios de corte en esta isoforma (cuadro 3). Las enzimas utilizadas en el análisis de RFLP de tripanotión reductasa - Acy I, Hae III y Bsm AI - sólo identifican polimorfismos en la tercera posición.
Para verificar la presencia de ambas formas de la cruzipaina se usó la enzima Apa I según el protocolo descrito por Lima et al, 1994 (26); cruzipaína 2 cuenta con un sitio de corte en la posición 298, distinguiendo el sitio variante 297 (cuadro 3) y generando fragmentos de 297 y 403 pb.
Los productos de amplificación se sometieron a digestiones simples a un volumen final de 20 µl con 1 U de enzima a 37°C por 16 horas. Una alícuota de 12 µL se analizó en geles de agarosa al 3% teñidos con bromuro de etidio. El resultado de la digestión fue registrado en un analizador de imágenes Gel Doc (BioRad, USA). Los patrones de bandas obtenidos fueron analizados con el software Imagej 1.33 (http://rsb.info.nih.gov/ij) y Quantity One (BioRad, USA). Para cada cepa y para cada gen se definieron los genotipos de acuerdo con los patrones observados en los electroferogramas.
Resultados
Los productos de amplificación obtenidos en los ensayos de PCR para TrR y Crp se muestran en la figura 1. Algunos de los perfiles de las digestio-nes simples se muestran en las figuras 2 ,figuras 4,figuras 5,figuras 6 .
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Los resultados de las digestiones se representan como genotipos compuestos de las digestiones simples. De seis sitios evaluados para TriR, sólo dos mostraron polimorfismo. Sólo la combinación de los genotipos obtenidos para las enzimas Hae III y Acy I muestran patrones polimórficos, denominados TriR 1, 2 y 3 (cuadro 4). El genotipo TriR 3 puede definirse con certeza debido a que el corte sólo se presenta ante la presencia de los alelos C y G para los sitios Acy I-102 y Hae III-210, respectivamente; este genotipo, presente en 35 de 38 cepas, se encuentra en las cepas caracterizadas como T. cruzi I, en las cuales es definido por la ausencia del alelo T en ambas posiciones (cuadro 4). El genotipo TriR 1, heterocigótico para ambas posiciones, se encontró en las dos cepas de referencia, de acuerdo con lo reportado en las bases de datos (cuadro 2, identificaciones de acceso: AF358997 y AF359002 para Tulahuen y AF358999 y AF358998 para CL), mientras que el genotipo TriR 2 se encontró en la cepa AF1 proveniente de Amalfi, Antioquia (cuadro 4). Para estos dos genotipos se infiere el alelo T en ambas posiciones debido a que es el polimorfismo alternativo presente en las secuencias analizadas y a que no se reporta otro sitio polimórfico alrededor de la diana de reconocimiento de la enzima. La distribución de estos genotipos no mostró ninguna asociación con origen geográfico o biológico (datos no mostrados).
En los ensayos de digestión para Crp, la enzima Apa I permitió identificar la cruzipaína 2 diferenciada por el polimorfismo en la posición 297 (figura 3). La presencia de por lo menos dos copias resulta en patrones de digestión complejos, en los que es posible obtener más de dos alelos para cada posición; para facilitar el análisis, denominamos como genotipo "heterocigoto" a aquel que poseía más de un alelo en un locus, lo cual puede corresponder a diferencias entre copias de Crp o a una condición heterocigótica en sentido estricto.
Basados en las secuencias reportadas para Crp, los sitios 150 a 153 representan una diana de reconocimiento para la enzima Rsa I con corte en la posición 151 (cuadro 3); estos sitios se reportan monomórficos en todas las secuencias (datos no mostrados), pero en algunas cepas analizadas en este estudio dicha diana se perdió originando genotipos heterocigotos; sus alelos se representan como 1/0 debido a que no se puede comprobar cuál es el sitio polimórfico dentro de la diana de reconocimiento de la enzima (cuadro 5). Los alelos Ban I-C y Rsa I-C en las posiciones 231 y 432, respectivamente, se definen con certeza porque la enzima sólo corta cuando éstos están presentes. Los alelos Ban I-T, Bsu 36I-G y Rsa I-T en las posiciones 231, 258 y 432 se infieren debido a que es el polimorfismo alternativo reportado en las secuencias analizadas y a que no se reporta otro polimorfismo alrededor de la diana de reconocimiento para cada enzima. Los sitios evaluados con la enzima Dra III fueron monomórficos y por esto no se consideran en los genotipos compuestos.
A diferencia de TriR, y probablemente por la presencia de más de una copia, para Crp se obtuvieron seis genotipos compuestos represen-tados como Crp 1 a Crp 6 (cuadro 5). El genotipo Crp 5, homocigótico para todos los loci, agrupa 26 cepas clasificadas como T. cruzi I (cuadro 5). El genotipo Crp 1 se encontró en las cepas del grupo T. cruzi II y es diferenciado por la presencia del alelo T en la posición 258 (cuadro 5). Éste y el genotipo Crp 3 son los más polimórficos; los genotipos Crp 2, Crp 4 y Crp 6 mostraron polimorfismo en la diana alrededor del sitio 151; adicionalmente, Crp 2 varió en la posición 432, y Crp 4 y Crp 6 variaron en la posición 231 (cuadro 5).
]]> Para Crp fue posible establecer algunas asociacio-nes entre los genotipos y el origen geográfico y biológico de las cepas (cuadro 6). Cuando se consideró el origen geográfico, la región del oriente (departamento de Casanare) mostró ser más diversa, con cuatro de los seis genotipos; dos de ellos, Crp 3 y Crp 6, son específicos de esta región y son diferenciados por el alelo T en el sitio 231. El genotipo Crp 2 se encuentra en el noroccidente (Sucre, Magdalena, Sierra Nevada) y oriente de Colombia (Casanare); este genotipo también se encontró en aislamientos de Rhodnius prolixus, Pastrongylus geniculatus y Eratyrus cuspidatus; entre los hospedadores mamíferos este genotipo sólo se encontró en Didelphis marsupialis (cuadro 6). El genotipo Crp 4 tiene una distribución similar al genotipo Crp 2, pero está ausente en la Sierra Nevada de Santa Marta; este genotipo está asociado a R. prolixus y Triatoma dimidiata, principales vectores domiciliados.
El genotipo Crp 5 fue el más frecuente; se presentó en todas las regiones del occidente de la cordillera oriental, en la totalidad de los hospederos mamíferos y en la mayoría de los insectos vectores, a excepción de E. cuspidatus; es el único genotipo encontrado en los 10 aislamientos de Rhodnius pallescens. En R. prolixus se encontró el mayor número de genotipos (Crp 2, Crp 4, Crp 5 y Crp 6).
Discusión
La evaluación de TriR con las enzimas Acy I y Hae III permitió distinguir cepas de los grupos previamente descritos con otros marcadores moleculares. Las cepas del grupo T. cruzi I evaluadas en este estudio mostraron en las posiciones 102 y 211 ausencia del alelo T (cuadro 4). Al considerar las secuencias reportadas, el alelo T en la posición 102 está ausente de todas las cepas del grupo I, como también en algunas del grupo II; el alelo T en la posición 211 fue consistente con las cepas del grupo T. cruzi II en nuestros ensayos; sin embargo, los datos de secuencias muestran que este alelo también puede estar presente en cepas de T. cruzi I (cuadro 2), por lo que no puede considerársele un alelo específico de grupo.
El gen TriR es codificado por un locus único en el genoma de T. cruzi (18) y la condición heterocigótica observada en el genotipo compuesto TriR 1 (C/T y G/T) podría reflejar cualquiera de varias situaciones: una combinación de clones en la cepa (41-43), o una heterocigosis "real" causada por mutación o intercambio genético dentro del grupo T. cruzi II (18,44-47). Si se considera la naturaleza heterogénea de los aislamientos originales de cepas de T. cruzi (42), ello podría argumentarse a favor de la primera situación. Sin embargo, no es posible descartar que los genotipos heterocigotos encontrados representen eventos antiguos de intercambio génico (18,44-47), en particular en el sitio 210, el cual puede ser producto de intercambio entre genotipos homocigotos.
La evaluación del gen TriR en cepas de Colombia mostró en nuestro análisis una baja diversidad de genotipos. El cálculo del polimorfismo (q) y diversidad nucleotídica (p) a partir de las secuencias reportadas para este gen fue de 0,0083+/-0,00186 y 0,011+/-0,00062, respectiva-mente. Una relación de menor polimorfismo con una mayor diversidad permite suponer que se trata de un gen sujeto a selección, o que efectivamente existe una estructura clonal en las cepas de Colombia; sin embargo, esta afirmación requeriría de confirmación, dado que los rangos de estos valores se superponen. Esta afirmación puede contradecirse si se considera que el polimorfismo en dichas secuencias se localiza en terceras posiciones del codón, dando lugar a cambios neutros. La tripanotión reductasa cumple una función en la detoxificación de productos endógenos y exógenos en el ciclo de vida del parásito y nuestros resultados no muestran una asociación con origen biológico; ello sugiere que, de estar sujeta a selección, su fuerza no ha operado diferencialmente entre los distintos orígenes biológicos y geográficos de donde proceden las cepas. Por este bajo polimorfismo, esta proteína podría constituirse en un blanco adecuado para diseños terapéuticos (48,49).
La presencia de por lo menos dos formas de Crp hace más complejo el análisis tanto de los genotipos como de su asociación con orígenes geográficos y biológicos. El mayor polimorfismo de este gen (cuatro sitios polimórficos de ocho sitios evaluados, excluido el sitio Apa I) dio lugar a seis genotipos, en contraste con tres genotipos para TriR, lo cual concuerda con la presencia de más de una copia del gen. Desde este punto de vista, muchas cepas (genotipo Crp 5) podrían representar eventos de concertación génica (50-52) en los que los loci de ambas copias son homocigóticos; pero esto requiere asumir hipótesis ad hoc de mutación para los mismos loci en otras cepas (genotipos Crp 1 a 4).
Algunos estudios previos con cepas de Colombia han podido establecer relaciones entre genotipos de T. cruzi con ciclos de transmisión (53,54). En este estudio no fue posible establecer relaciones entre genotipos TriR y Crp y ciclos de transmisión, debido a que no se evaluaron cepas aisladas de vectores domiciliados; las cepas SN se obtuvieron de R. prolixus al interior de las viviendas, pero su ubicación dentro de un nicho selvático en la Sierra Nevada de Santa Marta podría introducir errores en dichas comparaciones. Sin embargo, se pudo evaluar la relación entre genotipos y el origen geográfico y biológico de las cepas, en particular con las especies de vectores.
]]> En cuanto a Crp, se puede concluir que el departamento del Casanare es la región con más diversidad de genotipos (cuadro 6). De acuerdo con esto, en estudios previos (53,55) se determinó que la región de los Llanos Orientales exhibió un alto número de fenotipos isoenzimáticos. Dada la alta prevalencia de la enfermedad en esta región (IV Reunión de la Comisión Intergubernamental de la Iniciativa Andina de Control de la Transmisión Vectorial y Transfusional de Chagas. Guayaquil, 2003;56,57), valdría la pena formular hipótesis sobre la diversidad de T. cruzi en relación con la eficacia biológica (58) y con la epidemiología de la enfermedad.En cuanto a las asociaciones con los vectores, también se puede concluir que en R. pallescens, el vector/hospedero de donde proviene el mayor número de cepas en este estudio, se encontró exclusivamente el genotipo compuesto Crp 5; vale la pena evaluar también una hipótesis de especificad parásito-vector ampliando los marcadores en aislamientos de este vector. En contraste, en las demás especies de vectores se encontró más de un genotipo; en R. prolixus, principal vector de la enfermedad de Chagas en el país, se encontró el mayor número de genotipos; éste es un insecto ampliamente distribuido en regiones distantes de Colombia; la importancia de este aspecto también puede evaluarse en relación con sus implicaciones por sus hábitos antropofílicos y su domiciliación. Las cepas provenientes de P. geniculatus, aunque con una distribución más restringida, también mostraron tres de seis genotipos; esta diferencia en la diversidad genotípica entre especies podría reflejar el efecto de filtros biológicos selectivamente diferentes (59,60).
Usando marcadores de isoenzimas, RAPDs y ADNr, se ha podido demostrar la mayor prevalencia del grupo T. cruzi I en el país (53-55,61). Con dos sistemas diferentes en genes codificadores de proteínas también fue posible en este estudio reproducir esta observación, agrupándose la mayoría de cepas del grupo I dentro de los genotipos TriR 3 y Crp 5; esta consistencia de agrupación con diferentes sistemas refuerza así la estructura clonal de las poblaciones de T. cruzi.
Los resultados de este estudio sugieren que estos genes son útiles como posibles marcadores moleculares para determinar y diferenciar variedades genéticas en T. cruzi, y permiten plantear la futura evaluación de la hipótesis sobre la interacción parásito-hospedero.
Conflicto de intereses
Los autores declaramos que no existe ningún conflicto de intereses.
Financiación
El estudio fue desarrollado como parte del proyecto 1115-04-14387 financiado por Conciencias.
Correspondencia:
Winston Rojas, Calle 62 # 52-59, Sede de Investigación Universitaria (SIU), 4 piso- 430, Medellín, Colombia. Tel. (4) 2106464, fax: (4) 210 64 69. ]]>
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