Aplicación de las pruebas de PCR convencional simple y múltiple para la identificación de leptospira spp en Colombia
NATALÍ MORENO-ARISTIZABAL1, PIEDAD AGUDELO-FLÓREZ1
1 Grupo de Investigación Medicina Tropical; Instituto Colombiano de Medicina Tropical-Universidad CES. Correo electrónico: nmoreno@ces.edu.co
]]> Introducción: debido a las dificultadas asociadas con la identificación serológica de aislamientos de Leptospira ssp, se genera gran interés en la pruebas moleculares por su poder discriminatorio, reproducibilidad y fácil interpretación (1).
Objetivo: aplicar y validar la prueba de PCR convencional, usando dos pares de iniciadores descritos previamente y dirigidos a los genes lipL3 (2) (PCR simple) y sec y (3) /flaB (4) (PCR múltiple), con el fin de evaluar su aplicación para identificar especies patógenas y saprófitas de Leptospira ssp.
Materiales y Métodos: Para la estandarizaron de las pruebas de PCR se usaron 22 cepas de referencia internacional y 12 aislados colombianos. Se determinó el nivel de detección de cada pareja de iniciadores, su especificidad frente a otros microorganismos causantes de enfermedades endémicas en Colombia y su capacidad de identificar especies dentro del grupo de Leptospira.
Resultados: el límite de detección de la PCR simple lipL32 fue una dilución 1: 10 000 y para la PCR múltiple secY/flaB fue una dilución 1:100 para el gen secY y 1: 1 000 para flaB. La especificidad de todos los iniciadores fue de 100 %. La PCR simple lipL32, mostró amplificado específico para todas las cepas de referencia patógenas mientras que la PCR multiple sec Y/flaB lo fue para 18 cepas. De los 12 aislados colombianos, siete fueron positivos por PCR lipL32 y seis lo fueron por PCR sec Y/flaB.
Conclusiones: Los resultados más consistentes fueron obtenidos con la PCR simple lipL32 tanto en límite de detección, especificidad y utilidad para la identificación de Leptospira spp. Estos resultados muestran las potencialidades de esta prueba para que se valide posteriormente su utilidad en el diagnóstico molecular de leptospirosis en muestras clínicas o ambientales (5-7).
REFERENCIAS
1. Ko A, Goarant C, Picardeau M. Leptospira: the dawn of the molecular genetics era for an emerging zoonotic pathogen. Nat Rev Microbiol 2009 Oct;7(10):736-47. [ Links ]
2. Levett P, Morey R, Galloway R, Turner D, Steigerwalt A, Mayer L. Detection of pathogenic leptospires by real-time quantitative PCR. J Med Microbiol 2005 Jan;54(Pt 1):45-9. [ Links ]
3. Gravekamp C, Van de Kemp H, Franzen M, Carrington D, Schoone G, Van Eys G, et al. Detection of seven species of pathogenic leptospires by PCR using two sets of primers. J Gen Microbiol 1993 Aug;139(8):1691-700. [ Links ]
4. Kawabata H, Dancel L, Villanueva S, Yanagihara Y, Koizumi N, Watanabe H. flaB-polymerase chain reaction (flaB-PCR) and its restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis are an efficient tool for detection and identification of Leptospira spp. Microbiol Immunol 2001;45(6):491-6. [ Links ]
5. Ahmed A, Engelberts M, Boer K, Ahmed N, Hartskeerl R. Development and validation of a real-time PCR for detection of pathogenic leptospira species in clinical materials. PLoS One 2009;4(9):e7093. [ Links ]
6. Victoria B, Ahmed A, Zuerner R, Ahmed N, Bulach D, Quinteiro J, et al. Conservation of the S10-spc-alpha locus within otherwise highly plastic genomes provides phylogenetic insight into the genus Leptospira. PLoS One 2008;3(7):e2752. [ Links ]
7. Zuerner R, Hartskeerl R, van de Kemp H, Bal A. Characterization of the leptospira interrogans S10-spc-alpha operon. FEMS Microbiol Lett 2000 Jan;182(2):303-8. [ Links ]