El adipocito en el laboratorio: historia, perspectivas y reporte de experiencia
The adipocyte in the laboratory: history, perspectives and report of experience
JULIO CÉSAR SÁNCHEZ1, CÉSAR RAMÓN ROMERO2, CRISTHIAN DAVID ARROYAVE2, DIANA MARCELA DÍAZ2, ANDRÉS FELIPE QUIROZ2, JUAN FELIPE QUINTERO2
1 Facultad Ciencias de la Salud, Director Grupo de Fisiología Celular y Aplicada. Universidad Tecnológica de Pereira. Pereira, Colombia, jcsanchez@utp.edu.co
2 Facultad Ciencias de la Salud, Grupo de Fisiología celular y aplicada. Universidad Tecnológica de Pereira Semillero de Fisiología Aplicada y Neurociencias (SEFAN). Pereira, Colombia,
Forma de citar: Sánchez JC, Romero CR, Arroyave CD, Díaz DM, Quiroz AF, Quintero JF. El adipocito en el laboratorio: historia, perspectivas y reporte de experiencia. Rev CES Med 2015;29(2): 271-282
Recibido en: febrero 4 de 2015. Revisado en: septiembre 3 de 2015. Aceptado en: septiembre 9 de 2015
RESUMEN
Introducción: el tejido adiposo humano está compuesto por diferentes tipos celulares, y ha sido objeto de múltiples estudios en los últimos años debido a su acción en diversas funciones.
]]> Métodos: se realizó una búsqueda bilbiográfica en PubMed, Scielo, Science Direct and Google Scholars y se reporta la experiencia de los autores.Resultados: los primeros modelos de estudio fueron con tejido de roedores, y permitieron la comprensión del metabolismo de carbohidratos y ácidos grasos y facilitaron el estudio de la biología del adipocito, junto a estudios histológicos y el aislamiento de adipocitos maduros. Posteriormente se realizaron estudios con células precursoras (preadipocitos) que propiciaron el aislamiento de la línea celular 3T3-1L murina. En Latinoamérica, se han realizado diversos estudios con líneas celulares y con células madre mesenquimales precursoras de adipocitos para estudiar el efecto de hormonas y otras sustancias y para genotipificación. En Colombia se han realizado estudios con adipocitos 3T3-L1 para determinar los efectos de medicamentos y sustancias en estas células.
En el laboratorio de Fisiología Celular de la Universidad Tecnológica de Pereira el proceso de obtención de muestras ha evidenciado dificultades por tratarse de tejido humano, pero el protocolo de aislamiento y cultivo pudo ser estandarizado a lo largo de seis años de experimentación; se aislaron preadipocitos y adipocitos maduros que permitieron estudiar los efectos de hormonas, realizar caracterización electrofisiológica y estudiar la fisiología del calcio.
Conclusiones: este es un campo de investigación muy relevante debido a la implicación de este tipo celular en funciones metabólicas sistémicas y su relación con patologías de alta prevalencia como la obesidad y el síndrome metabólico.
PALABRAS CLAVE: Tejido adiposo, Adipocito, Preadipocito, Técnicas de cultivo celular, Cultivos celulares primarios.
ABSTRACT
Introduction: The human adipose tissue is composed of different cell types. It has been subject of several studies in the past years due to its role on diverse functions.
Methods: A search in the PubMed, Scielo, Science direct and Google Scholars databases was performed and the authors experience was reported.
Results: The first model used was rodent fat, which allowed a better comprehension on carbohydrate and fatty acid metabolism and enhanced research in adipocyte cell biology in addition with histological studies and mature adipocyte isolation. Afterwards, learning about precursor cell (pre-adipocytes) promoted the isolation of murine 3T3-L1 cell line.
In Latin America research has been conducted using cell lines and adipocyte precursor mesenchymal stem cells to describe effects of hormones and perform DNA sequencing. In Colombia, studies in 3T3-L1 cell line aimed to stablish the effects of different compounds on these cells. In the Cell Physiology Laboratory of the Universidad Tecnológica de Pereira, sample collection process has shown difficulties because the source was human tissue; nevertheless isolation and cell culture protocols were standardized throughout the last six years of experimentation. Pre-adipocytes and mature adipocytes were isolated to study the effects of hormones, perform electrophysiological characterization and study calcium physiology.
]]> Conclusions: This is a relevant research field since these cells have important systemic metabolic functions and they have a clear relationship with high-prevalence pathologies such as obesity and the metabolic syndrome.KEY WORDS: Adipose tissue, Adipocyte, Preadipocyte, Cell culture techniques, Primary cell cultures.
INTRODUCCIÓN
El tejido adiposo humano se compone de diferentes tipos celulares, tales como macrófagos, monocitos, eritrocitos, pericitos y adipocitos; estos últimos son las células más abundantes y tienen una gran importancia en la regulación del metabolismo general. La relevancia de su estudio es notable, pues son células endocrinas que intervienen en la homeostasis general y regulan múltiples funciones. Por esta razón, desde hace más de treinta años se viene investigando a esta célula y los mensajeros químicos que produce, por medio de diversos modelos celulares obtenidos a través de cultivos de diversas características.
El presente artículo es una revisión de tema acerca de los métodos experimentales que han sido utilizados para el estudio de la biología de los adipocitos y el desarrollo de estos métodos experimentales en Latinoamérica y Colombia.
MÉTODOS
Se realizó una búsqueda en las bases de datos PubMed, Scielo, Science Direct and Google Scholars, utilizando los descriptores adipocito, tejido adiposo, cultivos celulares, Latinoamérica, Colombia y sus combinaciones, tanto en español como en inglés. También se realizó la consolidación de la información procedente de la experiencia del Laboratorio de Fisiología Celular y Aplicada de la Universidad Tecnológica de Pereira en los últimos cinco años.
RESEÑA HISTÓRICA
El interés por el tejido adiposo inició hacia la primera mitad del siglo XX, cuando se relacionó el riesgo aumentado de muerte con la obesidad en aquellas personas que tenían una masa corporal aumentada. La primera fuente de este tejido fueron los roedores empleados en los primeros estudios que describieron su actividad metabólica. Las muestras en fresco ayudaron a la comprensión de algunas funciones como la actividad metabólica de carbohidratos y ácidos grasos, las cuales fueron el punto de partida para el estudio de la biología celular del tejido adiposo (1).
Durante el periodo comprendido entre 1940 y 1960 se publicaron diversos estudios de tejido adiposo realizados in vitro, para describir la existencia de diferentes rutas metabólicas de los ácidos grasos; se emplearon marcadores bioquímicos como deuterio, ácidos grasos, carbohidratos o ésteres de colesterol, marcados con carbono radioactivo, en medios de cultivo con hormonas (insulina, ACTH) o enzimas (lipasas); con esto se logró estimar la capacidad del tejido adiposo para utilizar y producir ácidos grasos (1).
]]> En 1964 Rodbell decantó los estudios in vivo e in vitro que a la fecha se habían realizado y produjo el primer experimento en el cual se logró aislar satisfactoriamente adipocitos maduros de una forma homogénea, a través de la digestión enzimática de tejido adiposo de rata, para que las células fueran liberadas y separadas de la fracción de estroma vascular (2).De esta manera se dio inicio al estudio del rol metabólico del adipocito y su sensibilidad a la influencia hormonal, a partir de la estimulación con adrenalina, ACTH y glucagón; adicional-mente, se realizó la cuantificación de la liberación de ácidos grasos libres y de glicerol, métodos de gran utilidad para la comprensión de la homeostasis metabólica del adipocito, que pueden ser modificados de acuerdo al estudio a realizar (3).
Debido a la dificultad que planteó este método de aislamiento, paralelo a la compresión de la biología y la histología del tejido adiposo, se dio el salto a la exploración de aquellas células precursoras de adipocitos maduros, los llamados preadipocitos. Los primeros reportes de aislamiento de preadipocitos datan de 1960, cuando se logró aislar con éxito una línea monoclonal de preadipocitos murinos, 3T3 L1, la cual se obtuvo de embriones de entre 17 a 19 días de ratones 3T3 suizos (4). A partir de ese momento continuó el desarrollo de diferentes modelos celulares que permitieron ampliar las investigaciones en adipocitos.
PROTOCOLOS UTILIZADOS Y LÍNEAS CELULARES
En el cuadro 1 se resumen diversas líneas comerciales derivadas de humanos y animales. Los protocolos de mantenimiento y diferenciación suelen ser estándar, basándose principalmente en medios suplementados con insulina y corticoides, que se pueden emplear acorde a los requerimientos experimentales, pues intervienen favorablemente en la maduración del adipocito al promover su metabolismo y la formación de las vacuolas grasas, incrementando la actividad adipogénica y por ende el número de células maduras del cultivo (5).
De los subtipos de adipocitos, los más usados en experimentación han sido el blanco y el pardo, los cuales se diferencian en su localización, morfología (vacuola y organelas) y funciones; estas células se pueden caracterizar por la expresión de marcadores como la leptina, expresada primordialmente en el adipocito blanco y la UCP1 (uncoupled protein 1), expresada exclusivamente en los adipocitos pardos (18).
Desde 1974 se ha usado la técnica de tinción con rojo de aceite para la identificación y visualización de adipocitos maduros en cultivo. Éste es un método cuantitativo de caracterización morfológica que consiste en teñir las vacuolas de grasas de estas células y posteriormente cuantificar la cantidad de colorante tomado después del lavado, a través de la medición de absorbancia por métodos convencionales. El método es fácil de implementar y es una herramienta útil en la caracterización del adipocito maduro en cultivo (4).
Otras líneas que se han establecido como ob17 u ob1771 tienen un comportamiento similar a las células en el contexto de la obesidad, pues provienen de ratones modificados genéticamente para desarrollar esta enfermedad (8).
Entre las ventajas que ofrece la línea celular frente a la utilización de cultivos primarios están las mayores tasas de sobrevida y las facilidades de manejo en el laboratorio, convirtiéndose en una nueva alternativa para estudiar las características del adipocito (19).
]]> En décadas pasadas diferentes métodos de aislamiento y manipulación génica, permitieron emplear líneas celulares surgidas a partir de células totipotenciales, lo cual, además, permitió el desarrollo de linajes celulares con características particulares que han ampliado este campo de estudio. En Europa, en la década de los ochenta, se encontró actividad de canales iónicos selectivos y no selectivos en adipocitos (20), abriendo las puertas a la comprensión del papel de estas proteínas en la regulación metabólica e iniciando un amplio campo de trabajo: la electrofisiología celular del adipocito.La caracterización de transportadores de membrana en el adipocito permite avanzar en el entendimiento del desarrollo de diversas enfermedades, entre ellas el cáncer, dado que el tejido adiposo genera un microambiente óptimo para su desarrollo, por ser un reservorio de energía generador de ácidos grasos libres y productor de citocinas pro-inflamatorias, adipocinas y factores pro-angiogénicos, lo cual facilita el desarrollo de las neoplasias y sus metástasis (21).
El principal problema de la obesidad radica en su asociación con enfermedades metabólicas, entre ellas la diabetes, caracterizada por resistencia a la insulina y asociada a niveles altos de leptina y resistina en sangre (22); los cultivos celulares permiten manipular, de forma aislada, los efectos que diferentes hormonas, la hipoxia y los cambios de temperatura tienen sobre el adipocito y ayudan a individualizar sus efectos (23).
Otras áreas biológicas han partido de la utilización de células madre derivadas del tejido adiposo (CMM-AD), para diferenciarlas a varios linajes celulares, entre ellos miocitos, condrocitos, hepatocitos, neuronas, células endoteliales, entre otros. Estas células también han sido utilizadas para reconstrucción de tejidos (24).
EXPERIENCIA EN LATINOAMÉRICA Y COLOMBIA
En Latinoamérica es de resaltar el trabajo realizado en Brasil, donde se han cultivado adipocitos 3T3-L1 para determinar su actividad metabólica (25) y CMM-AD para diferenciarlas a adipocitos, osteoblastos y condrocitos (26).
En Chile también se ha realizado aislamiento de CMM-AD para estudiar la capacidad de diferenciación del mismo hacia otros linajes mesodérmicos (27). En México se ha utilizado el cultivo de adipocitos 3T3-L1 para determinar los efectos de la dopamina sobre la liberación de leptina y también se han usado cultivos primarios tanto humanos como bovinos para estudios de genotipificación (28). En Cuba se han realizado cultivos de CMM-AD para su caracterización fenotípica (29); en el caso de Costa Rica se han comparado protocolos de cultivos de CMM-AD equinos para ser utilizados en regeneración tisular (30).
A pesar de toda esta experiencia, la mayoría de la literatura científica sobre tejido adiposo procedente de Latinoamérica se reduce a artículos de revisión, lo cual evidencia la necesidad de continuar investigando respecto a este tema en nuestro medio.
En Colombia, la investigación en adipocitos ha sido limitada, pero algunos grupos han realizado diversos estudios sobre el tejido adiposo, principalmente por medio del uso de la línea 3T3-L1, para la evaluación de efectos de medicamentos y otras sustancias en estas células (31). En Bogotá se han estudiado las acciones lipolíticas del resveratrol y el efecto de varios agentes sobre la diferenciación del adipocito, con el propósito de evaluar posibles estrategias terapéuticas para enfermedades de alta prevalencia como la obesidad relacionada con diabetes mellitus tipo II e hipertensión arterial en el síndrome metabólico (32).
Otros grupos han realizado cultivos celulares en los cuales se estimula la adipogénesis, a partir de la diferenciación de preadipocitos a adipocitos maduros, evidenciando la producción de triacilglicéridos a través de tinciones especiales y biofotometría, después de ser colocados en medios de diferenciación suplementados con rosiglitazona e insulina (33); también se ha experimentado con CMM-AD extraídas a partir de la grasa infrapatelar de Hoffa, para evaluar su potencial de diferenciación a otros linajes celulares, como alternativa en la medicina regenerativa (34).
]]> En Medellín, usando cultivos primarios de adipocitos, se ha buscado la diferenciación a células madre a partir de la exposición a factores osteogénicos como dexametasona, ácido ascórbico y β-glicerol fosfato para su utilización en enfermedades osteogénicas (35).En Cali, el cultivo de adipocitos ha sido utilizado en cirugía plástica con el objetivo de optimizar y estandarizar técnicas de lipoescultura con láser, observando los efectos de la luz en la morfología y funcionalidad de las células (36).
En el Laboratorio de Fisiología Celular de la Universidad Tecnológica de Pereira se ha desarrollado una línea de investigación en adipocitos humanos cultivados a partir de muestras de tejido adiposo subcutáneo. En la experiencia a lo largo de los últimos seis años se ha obtenido tejido adiposo de pacientes obesos y no obesos sometidos a diferentes procedimientos quirúrgicos, quienes han firmado un consentimiento informado para la utilización del tejido con fines de investigación. Estos pacientes no presentaban diabetes mellitus, infecciones activas ni cáncer.
Las muestras fueron obtenidas por los cirujanos correspondientes al inicio del procedimiento quirúrgico; se obtuvieron entre 10 y 20 gr de tejido celular subcutáneo no infiltrado con vasoconstrictores ni sometido a electrobisturí; la muestra de tejido fue inmediatamente sumergida en solución salina normal (0,9 %) a temperaturas entre 2 y 4 º C y transportada al laboratorio para su procesamiento en las siguientes seis horas.
Con estas muestras se ha experimentado con protocolos exitosos en otros laboratorios reportados en la literatura (37-39), adaptándolos a las condiciones de nuestro laboratorio hasta obtener, según nuestra experiencia, el más útil para el aislamiento de adipocitos maduros y la obtención de preadipocitos y su posterior cultivo. También se ha experimentado con el aislamiento de adipocitos maduros en fresco utilizando la técnica del ceiling (40) (figura 1). Los medios utilizados y su composición están resumidos en el cuadro 2.
Se ha logrado la obtención de cultivos que han permitido el estudio de efectos de hormonas como leptina, insulina y factor de necrosis tu-moral. También se han realizado estudios de caracterización electrofisiológica de estas células y de proteínas involucradas en la regulación del calcio (41, 42).
Las principales dificultades han tenido que ver con la disponibilidad de las muestras que ha venido disminuyendo en los últimos años, ya que los abordajes quirúrgicos han cambiado a ser, en su mayoría, de tipo laparoscópico, y en éstos la obtención de grasa presenta dificultades técnicas que no permiten la extracción de la cantidad necesaria de tejido. También es significativo el rechazo de algunos pacientes a la extracción del tejido por temores o creencias infundados.
Es necesario resaltar que este proceso depende de la colaboración de los cirujanos y el personal auxiliar de quirófanos, condición que no siempre se cumple, pues existen múltiples situaciones propias del quehacer quirúrgico que en ocasiones impiden invertir tiempo adicional obteniendo las muestras necesarias. Estas situaciones son imposibles de prever y por tanto, no pueden ser controladas. A pesar de que se ha experimentado con la posibilidad de cultivar células obtenidas de tejido graso extraído por liposucción, el cual es de más fácil acceso. La experiencia con este tipo de muestras no ha sido exitosa en nuestro laboratorio, aunque otros han reportado lo contrario (35).
]]> CONCLUSIONESLos cultivos de adipocitos de fuentes primarias continúan siendo un desafío de gran interés para la investigación biomédica, por ser una herramienta para el estudio del tejido adiposo. Este tejido tiene un papel fundamental en el metabolismo y la regulación hormonal del organismo en condiciones fisiológicas o patológicas como obesidad, diabetes mellitus e hipertensión arterial; además, la optimización de los procesos de cultivo de adipocitos puede ayudar significativa-mente en la búsqueda de posibles blancos terapéuticos para dichas enfermedades, que actúen sobre las diversas acciones alteradas de estas células. A pesar de las dificultades inherentes a los cultivos de adipocitos es necesario continuar en la búsqueda de métodos de optimización de las técnicas de laboratorio que permitan mejorar el proceso de obtención de cultivos.
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