Importancia de la terapia génica en la enfermedad granulomatosa crónica

Gene therapy in chronic granulomatous disease

Luz Astrid Velásquez Marulanda^1*; Julián Camilo Arango Rincón^2*; Andrés Augusto Arias Sierra^3*; Pablo Javier Patiño Grajales^4*

* Grupo de Inmunodeficiencias Primarias, Corporación Biogénesis, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
1. Bacterióloga
2. Estudiante de Microbiología y Bioanálisis
3. Bacteriólogo, M.SC
4. MD, M.SC, D.SC*

RESUMEN

EL SISTEMA NADPH OXIDASA DE LAS CÉLULAS FAGOCÍTICAS es un complejo enzimático encargado de producir anión superóxido durante la respuesta contra los microorganismos. Mutaciones en los genes que codifican para las proteínas de este sistema son responsables de la Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC) que es una inmunodeficiencia primaria caracterizada por la presencia de infecciones recurrentes debidas a un grupo específico de microorganismos, principalmente oportunistas. Actualmente el tratamiento para la mayoría de los pacientes con EGC está dirigido a la prevención o al control de los procesos infecciosos, pero no a la curación de la enfermedad. El tratamiento curativo consiste en el trasplante alogénico de médula ósea (TMO); sin embargo, este método enfrenta dificultades como la incompatibilidad de HLA, la inmunosupresión debida a las condiciones mieloablativas necesarias para el trasplante y el riesgo de desarrollar la enfermedad injerto contra hospedero. Como una alternativa al TMO, ha surgido la terapia génica ex vivo en células progenitoras hematopoyéticas. Las características genéticas de la EGC le han permitido convertirse en un modelo para el estudio de la terapia génica ex vivo. En este artículo se describen y analizan los resultados que hasta la fecha se han obtenido en el campo de la terapia génica aplicada a la EGC.

PALABRAS CLAVE: enfermedad granulomatosa crónica, NADPH oxidasa, terapia génica, vectores retrovirales

SUMMARY

Reactive oxygen species (ROS) production by phagocytes is an important mechanism to kill invading microorganisms. Neutrophils from individuals with chronic granulomatous disease (CGD) do not produce ROS, thereby rendering these individuals more susceptible to infection. CGD results from mutations in the genes encoding essential subunits of respiratory burst NADPH oxidase, the enzyme complex necessary for the production of these reactive molecules. The absence of phagocyte ROS results in recurrent fungal and bacterial infections and inflammatory granulomas, associated with significant morbidity and mortality. Currently, the curative treatment is the allogenic bone marrow transplant (BMT); nevertheless, this therapy has some disadvantages including the HLA incompatibility, the immunosupression due to the myeloablative conditions necessary for the transplant and the high risk to develop graft vs. host disease. As an alternative to BMT the ex vivo gene therapy in hematopoietic stem cells has been intensely studied. Although this option could be the most appropriate treatment, it can give rise to other kinds of adverse effects. The genetic features of CGD have made it a very attractive candidate to be cured with gene therapy. This review summarizes and discusses the current advances about gene therapy and its application to CGD.

KEY WORDS: chonic granulomatous disease, gene therapy, nadph oxidase, retroviral vectors

EL SISTEMA NADPH OXIDASA

Las células especializadas en la fagocitosis tienen la capacidad de ingerir microorganismos en el interior de una vacuola fagocítica y destruirlos mediante varios mecanismos microbicidas, entre ellos los dependientes del oxígeno. Estos se relacionan con la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS, por su sigla en inglés), derivadas del anión superóxido (O2^–), generadas por la actividad catalítica del sistema dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato (NADPH) oxidasa.

Las ROS causan gran toxicidad a un amplio espectro de microorganismos lo cual les permite ejercer un papel sinérgico con el contenido de los gránulos para eliminar los microorganismos fagocitados. El sistema NADPH oxidasa está conformado por cinco proteínas; dos de estas, gp91^phox y p22^phox, se encuentran en la membrana celular o en la membrana de la vacuola fagocítica, formando un heterodímero llamado flavocitocromo b558, el cual posee dos grupos hemo y un grupo dinucleótido de flavina y adenina (FAD), necesarios para la transferencia de electrones durante la activación del sistema. Las tres proteínas restantes: p47^phox, p67^phox y p40^phox, se encuentran localizadas en el citosol acompañadas de una GTPasa de bajo peso molecular conocida como Rac2. La actividad catalítica del sistema NADPH oxidasa, estimula la transferencia de electrones desde el NADPH disuelto en el medio citosólico, hacia el oxígeno molecular que se encuentra en el interior de la vacuola fagocítica dando lugar al anión superóxido (O2^–). A partir de este radical se generan otros compuestos como el peróxido de hidrógeno (H2O2), el radical hidroxilo (OH^–), el ácido hipocloroso (HClO) y halógenos, que participan en la destrucción de los microorganismos que fueron fagocitados (Figura Nº 1).^1,2

ENFERMEDAD GRANULOMATOSA CRÓNICA

La Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC) es una inmunodeficiencia primaria que resulta de la alteración en alguno de los componentes proteicos del sistema NADPH oxidasa (excepto p40^phox), lo que ocasiona una marcada reducción o la inhibición total en la producción del anión superóxido.^3–6 Los pacientes con EGC se caracterizan por la presencia de infecciones recurrentes de etiología bacteriana y fúngica, localizadas frecuentemente en la piel, el pulmón y el intestino. Sus manifestaciones clínicas comunes incluyen: linfadenitis, abscesos cutáneos y neumonía, así como diarrea, colitis y en ocasiones sepsis. Estas infecciones generalmente se complican con abscesos hepáticos, osteomielitis o con obstrucción en las vísceras huecas por el crecimiento de los granulomas tal como sucede en la cistitis granulomatosa y en los granulomas en el estómago y el esófago. Las bacterias y hongos involucrados comúnmente son la Salmonella sp, el Staphylococcus aureus, la Burkholderia cepacia y el Aspergillus fumigatus.^6–8

La forma más frecuente de la EGC es la ligada al cromosoma X (EGC–X), originada por una mutación en el gen CYBB que codifica para el componente gp91^phoxdel sistema NADPH oxidasa.^9,10 La segunda forma más común es la debida a mutaciones en el gen NCF–1 que codifica para la proteína p47^phox. ¹¹ Luego se encuentra la alteración en el gen NCF–2, el cual codifica para la proteína p67^phox.¹² Por último, la forma menos común es la causada por mutaciones en el gen CYA, el cual codifica para la proteína p22^phox.^6,7

El diagnóstico de la EGC se basa en la demostración de la incapacidad de respuesta de las células fagocíticas ante diferentes agentes activadores como el forbol miristato acetato (FMA).^6,7,13,14

Tratamiento de la EGC

En la actualidad el tratamiento para los pacientes con diagnóstico de EGC se basa en el control de los procesos infecciosos y en la profilaxis antimicrobiana. La administración de interferón gama (IFNγ) está indicada como mantenimiento profiláctico y como terapia inmunomoduladora con la cual se ha demostrado una disminución en la recurrencia y gravedad de las infecciones.^7,13,15

En el momento no existe un acuerdo con relación al trasplante de médula ósea alogénico como tratamiento curativo de la EGC, pues este procedimiento tiene limitaciones importantes tales como: la dificultad para encontrar un donante histocompatible, la alta probabilidad de desarrollar la enfermedad injerto contra hospedero (EIH) y la inmunosupresión generada por las condiciones mieloablativas previas al trasplante. De otro lado, la terapia génica ofrece la ventaja de ser un trasplante de carácter autólogo, lo que elimina las probabilidades de desarrollar EIH pero, aunque mejora el estado de inmunosupresión, puede dar origen a otras complicaciones como alergias, autoinmunidad y desarrollo de cáncer.^6,7,16–21

LA TERAPIA GÉNICA EN CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS

La terapia génica es una técnica que busca introducir un gen funcional dentro de una célula determinada y de esta manera corregir un defecto genético o conferirle a la célula una función adicional o diferente a la que naturalmente tiene. En la terapia génica ex vivo se obtienen células del paciente para ser modificadas en el laboratorio y posteriormente implantarlas en el organismo con el defecto genético. Este método se emplea para realizar terapia génica en la EGC y en otros trastornos hematopoyéticos, como la inmunodeficiencia combinada severa (SCID por su sigla en inglés), el síndrome de Wiskott–Aldrich, la anemia de Fanconi y la anemia falciforme, entre otros.^22,23

Las células diana para corregir el defecto genético en estas enfermedades son las células pluripotenciales hematopoyéticas. Estas células son escasas, representan el 0.01% de toda la población celular hematopoyética, y se caracterizan por encontrarse en la fase G0 del ciclo celular. Las células progenitoras hematopoyéticas humanas utilizadas en el campo de la terapia génica son seleccionadas por la expresión del antígeno CD34 y se puede inducir su proliferación mediante la administración de factores de crecimiento, de forma que se aumente considerablemente su número en la sangre periférica. La habilidad de estas células para repoblar la médula ósea de individuos receptores que han sido expuestos a condiciones mieloablativas, así como su capacidad para alcanzar la diferenciación en un linaje específico de poblaciones celulares en la sangre periférica, las convierte en un blanco importante para la intervención genética.²² Esto explica por qué las células madre ofrecen oportunidades terapéuticas importantes, a pesar de que es necesario profundizar en el conocimiento acerca de la biología y de los factores microambientales que influencian su desarrollo y proliferación in vivo e in vitro.²⁴

Vectores utilizados en la terapia génica

Para evitar que estos vectores virales tengan los efectos patógenos del virus original, su genoma ha sido modificado para convertirlos en herramientas de transferencia genética anulando su capacidad replicativa competente. Para lograr este propósito, se remueven las secuencias genómicas virales que les confieren características patógenas, disminuyendo así la probabilidad de replicación viral. El genoma de un retrovirus típico (figura Nº 2), contiene repeticiones terminales largas (LTR, por su sigla en inglés), secuencias para señales de encapsidación (Ψ) y secuencias como gag, pol y env, las cuales codifican para la transcriptasa reversa, la integrasa y proteínas de la envoltura viral.

Cuando se remueven las secuencias gag, pol y env se genera un espacio que servirá para insertar el gen de interés, en forma de ADN complementario (cADN), el cual estará acompañado de las LTR y de la señal de encapsidación, pero al mismo tiempo el virus habrá perdido su capacidad replicativa. Las secuencias removidas se introducen en plásmidos como unidades transcripcionales independientes, para luego ser transfectadas en una línea celular que se denomina línea celular de empaquetamiento. Las células que contienen las proteínas necesarias para que se lleve a cabo la encapsidación del genoma viral, se transducen con el vector que contiene el gen terapéutico, lo que permitirá establecer una línea celular productora. Luego, entre estas secuencias ocurren reacciones de complementación (en trans) que permiten la formación de partículas virales recombinantes completas, que contienen en su interior el cADN del gen terapéutico.^27,28 Otra modificación que se puede realizar en el vector consiste en la generación de virus quiméricos, es decir, virus que tienen la capacidad de empaquetar su genoma con las proteínas de envoltura de otros virus, con lo que aumentan su rango de células hospederas.^29,30

Riesgos de los vectores retrovirales

Existen dos riesgos al utilizar vectores retrovirales: la posibilidad de producir mutagénesis insercional y la generación de virus silvestres. La mutagénesis insercional es un evento aleatorio que ocurre cuando el vector retroviral se inserta en un sitio de un gen celular en el que podría originar el desarrollo de procesos proliferativos anormales, por medio de la inactivación de genes supresores de tumor o por la activación de protooncogenes. Un ejemplo de esto se presentó en dos pacientes con inmunodeficiencia combinada grave, que luego de aproximadamente tres años de terapia sufrieron una expansión clonal desordenada de linfocitos T CD4 maduros.^27,31–33 Con respecto a la generación de virus silvestres, este es un fenómeno que puede ser controlado con la eliminación de la homología entre los genes de empaquetamiento en el vector, así como con la separación de estos genes en dos o más unidades transcripcionales independientes, como ya se ha mencionado. Hasta el momento la ocurrencia de efectos adversos después de un tratamiento con terapia génica, solo puede controlarse con el seguimiento de la evolución clínica de los pacientes.^34,35

La terapia génica en la EGC

Se ha llevado a cabo una gran variedad de estudios de transferencia génica en líneas celulares modelo de EGC, en ratones Knockout para proteínas del sistema NADPH oxidasa, en ratones modelo de SCID y en pacientes con EGC.^18,19,36 Las células B transformadas con el virus de Epstein–Barr han sido utilizadas por muchos grupos de investigación como modelos in vitro para evaluar la corrección genética en EGC. Esta línea celular expresa cantidades pequeñas de los componentes proteicos del sistema NADPH oxidasa y puede producir bajos niveles de anión superóxido; sin embargo, hasta el momento se desconoce la importancia fisiológica de la generación del anión superóxido por parte de los linfocitos B.^37,38 La capacidad de producir anión superóxido en estas líneas celulares derivadas de pacientes con cualquiera de las formas de EGC, se ha restaurado usando vectores retrovirales que contienen el cADN correspondiente al gen defectuoso.^39–41 Otros estudios han utilizado líneas celulares mieloides llamadas PLB–985 como modelo in vitro de X–EGC, las cuales requieren la expresión de gp91^phox para generar el anión superóxido. Una observación importante derivada de estos trabajos es que la expresión de pequeñas cantidades de gp91^phox recombinante es suficiente para obtener una alta producción de anión superóxido, lo que sugiere que la proteína silvestre se encuentra naturalmente en exceso.⁴² Otro modelo celular utilizado en este campo de investigación es el de las células progenitoras de la médula ósea obtenidas de pacientes con EGC que luego son transducidas con diferentes tipos de vectores para después evaluar las células diferenciadas in vitro (granulocitos y monocitos), por medio de ensayos funcionales que permiten determinar la reconstitución del sistema NADPH oxidasa.^{17–19,43,44}

Los estudios de transferencia genética retroviral utilizando células progenitoras mieloides obtenidas de la sangre periférica de pacientes con EGC han arrojado resultados satisfactorios. Por ejemplo, en un estudio preclínico se usó un vector bicistrónico retroviral derivado del virus de células madre murinas (MSCV, por su sigla en inglés), que brinda la posibilidad de evaluar clínicamente las células transducidas, ya que coexpresa el gen terapéutico de gp91^phox y un gen marcador. Los resultados de este estudio mostraron hasta un 80% de transducción en las células progenitoras de la médula ósea CD34⁺ y entre los fagocitos diferenciados se alcanzó un 70% de los niveles normales de producción de anión superóxido.⁴⁵

El estudio de la terapia génica en ratones Knockout que presentan EGC–X, ha permitido demostrar la eficiencia de los vectores basados en MSCV en la reconstitución de la actividad oxidasa. En este caso las células progenitoras hematopoyéticas provenientes de los ratones Knockout son transducidas con el gen CYBB, ubicado en el vector MSVC y luego estas células son trasplantadas a ratones singénicos tratados previamente con dosis mieloablativas de irradiación. La actividad NADPH oxidasa en neutrófilos y macrófagos, evaluada después del trasplante, muestra un aumento en la intensidad de expresión y en el porcentaje de células que expresan la gp91^phox .⁴⁶ Se han hecho estudios similares en modelos murinos con deficiencia de p47^phox, utilizando células transducidas con vectores de tipo MFG–S que contienen el cADN que codifica la p47^phox. Estos estudios han arrojado resultados similares a los anteriores ya que la evaluación postrasplante de la producción de anión superóxido en células progenitoras hematopoyéticas transducidas, muestra un aumento en la actividad NADPH oxidasa. Además, la respuesta a microorganismos patógenos de ratones Knockout tratados con terapia génica en comparación con ratones sin dicho tratamiento y bajo las mismas condiciones, permitió concluir que los niveles de bacteremia de los ratones con la corrección del defecto genético fueron significativamente más bajos que los de los controles.⁴⁷

Ensayos clínicos de la capacidad correctora

La capacidad correctora de la transferencia génica mediada por retrovirus también se ha evaluado en ensayos clínicos de fase uno de investigación. Para tal efecto se han utilizado como blanco de la terapia células CD34+ movilizadas hacia la sangre periférica. Uno de estos estudios se hizo en cinco pacientes con deficiencia de p47^phox, de quienes se obtuvieron células CD34+ movilizadas a la sangre periférica, a las cuales se les introdujo un vector retroviral que contenía el cADN de p47^phox, para luego reinfundirlas a los pacientes. En este ensayo se restauró la actividad oxidasa entre 6 y 29% en células diferenciadas in vitro a granulocitos, que fueron obtenidas a partir de las células CD34+ transducidas; sin embargo, se presentó un bajo porcentaje de neutrófilos corregidos en la sangre periférica, entre 0.004 y 0.05%, después de la transfusión de dichas células en los pacientes.⁴⁹

Este resultado refleja una baja eficiencia de la transferencia génica mediada por retrovirus en células progenitoras hematopoyéticas humanas. Es interesante observar que en estudios realizados con modelos animales bajo las mismas condiciones y con el mismo protocolo, se obtuvo un 5% de células de la sangre periférica que contenían el provirus después del trasplante, lo que indica que la falla radica en la optimización de los procedimientos de terapia génica aplicados en células humanas.^18,47,49 En otro ensayo clínico, células CD34+ fueron transducidas con retrovirus que transportaban el gen CYBB mediante el método de infección con fragmentos de fibronectina (CH–296) y en presencia de una combinación de citoquinas como el ligando 3 de la tirosina–quinasa fetal (FLT–3L, por su sigla en inglés), el factor de células madre (SCF, por su sigla en inglés) la trombopoyetina y el factor estimulante de colonias de granulocitos (Ì–CSF, por su sigla en inglés). Cuatro días después de la transducción, las células fueron reinfundidas al paciente y se encontraron neutrófilos con la corrección del defecto de la actividad oxidasa cuatro semanas después de cada ciclo de infusión, pero el número de estas células disminuyó con el paso del tiempo.^26,28,50

Desventajas y correctivos

Una desventaja, tanto de la terapia génica como del trasplante alogénico de médula ósea, es la aplicación de condiciones mieloablativas a los individuos receptores antes del trasplante, con el fin de mejorar la implantación de las células que serán reinfundidas. Al respecto, en algunos estudios se han evaluado los procedimientos de transferencia génica en ensayos clínicos, en los cuales se reducen las dosis de radiación, a las que se exponen los pacientes que se van a trasplantar. Además, se ha utilizado el 5–fluorouracilo (5–FU), que bloquea de novo la síntesis de ADN y de ARN sin causar daños celulares irreversibles como sí lo hacen la radiación o los agentes utilizados en quimioterapia.^22,51 Estos trabajos indican también que la infusión de niveles altos de células del donante, asociada con bajas dosis de radiación o con un régimen previo al trasplante basado en la administración de 5–FU, confiere niveles bajos pero estables de neutrófilos corregidos genéticamente in vivo.⁵² Además estos estudios preliminares también muestran una reducción parcial de la inflamación y de la formación de granulomas cuando los ratones en estudio fueron expuestos a hifas esterilizadas de Aspergillus fumigatus.^{18, 22, 51, 52}

Vectores lentivirales

A pesar de que los vectores retrovirales han sido los más estudiados durante la década del desarrollo de la terapia génica, la alternativa actual son los vectores lentivirales. Los estudios reportados que utilizan lentivirus modificados para transportar insertos genéticos se basan en ensayos in vitro con líneas celulares como modelo de EGC, que se realizan bajo condiciones óptimas de transducción y aplicando técnicas que ofrecen vectores con muchas características de seguridad.^27,53 También se han reportado estudios en modelos murinos NOD/SCID que reciben el trasplante de células CD34+ humanas transducidas, los cuales presentan corrección del defecto EGC–X. Los resultados que arrojan estos estudios indican que los vectores lentivirales muestran una mayor eficiencia de transducción en ensayos in vivo comparados con la eficiencia de transducción de los vectores retrovirales, los cuales resultan más eficientes que los lentivirales en ensayos ex vivo.⁵⁴ Sin embargo, la intensidad de expresión por célula de la proteína de interés fue mejor en las células transducidas con retrovirus, que en las que contenían el vector lentiviral; este inconveniente puede superarse modificando el promotor en el constructo del vector lentiviral para lograr el aumento de la expresión génica. Además fue interesante observar que en los ensayos in vitro, las células transducidas con el vector lentiviral mostraron porcentajes de producción de anión superóxido y de expresión génica, muy similares a los resultados arrojados por las células de individuos normales, aunque mucho menores que los porcentajes que mostraron las células transducidas con el vector retroviral.^27,53–55

CONCLUSIONES

Las células hematopoyéticas modificadas genéticamente podrían ser expandidas por medio de la selección positiva in vivo, lo que se refiere a la inclusión de un gen que confiera resistencia a un tratamiento mielotóxico en el constructo del vector y que permita la proliferación de las células que contengan dicho vector en un medio selectivo. Por último, la reducción de los requerimientos mieloablativos que preceden al trasplante, asociada con la infusión de un número mayor de células transducidas, puede redundar en una disminución del daño al estado inmunológico de los pacientes sin afectar la adherencia de las células trasplantadas.

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Aceptado: 29 de agosto de 2005