Estudio preliminar de la expresión
proteómica cerebral de la región
hipocampal de ratas expuestas
a diferentes niveles de estrés
inducido por el nado forzado

Nasser Guerrero^1,2,Rodrigo Torres Saez¹,Carlos Conde Cotes²

1. Escuela de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Industrial de Santander.
2. Departamento de Ciencias Básicas. Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología Facultad de Salud. Universidad Industrial de Santander.
Correspondencia: Nasser Guerrero Bermúdez (Biólogo, Magister en Ciencias Básicas Biomédicas), Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología, Universidad Industrial de Santander, Campus Universitario Cra 27 calle 9. Pbx: (57) (7) 634400, Ext 1529 Bucaramanga, Colombia; Email: nguerrer@uis.edu.co, nguerrer04@hotmail.com ]]> Recibido: 23 de Febrero de 2012 Aceptado: 2 de abril de 2012

RESUMEN

Introducción: en general, los estímulos estresores pueden inducir respuestas adaptativas o mal adaptativas dependiendo, entre otras cosas, de su intensidad y la duración. Sin embargo, no se han llevado a cabo estudios que relacionen cuantitativa y cualitativamente la intensidad de estrés al que es expuesto un animal y la expresión de proteínas del hipocampo. Objetivo: evaluar la expresión diferencial de proteínas hipocampales en ratas Wistar-UIS, expuestas a diferentes niveles de estrés inducido por el nado forzado. Materiales y métodos: se utilizaron 30 ratas Wistar-UIS machos distribuidas aleatoriamente en 3 grupos según el tiempo de exposición al nado forzado como estímulo estresor (0, 5 y 15 minutos). Después de 24 horas se extrajeron los hipocampos dorsales y se realizó electroforesis bidimensional de las proteínas extraídas. A continuación, se llevó a cabo el procesamiento de las imágenes de los geles obtenidos utilizando el software PDQUEST 2D. Aquellas proteínas en las se detectaron intensidades asociadas a los tiempos de exposición al estímulo, se identificaron de manera presuntiva utilizando la base de datos bioinformática Export Protein Analysis System (EXPASY). Resultados: de acuerdo con el análisis proteómico y bioinformático se identificaron 60 proteínas, de las cuales, 38 eran comunes al hipocampo derecho e izquierdo; 13 del hipocampo derecho y 9 del izquierdo. Conclusión: se encontraron diferencias en la expresión de proteínas entre el hipocampo derecho e izquierdo del tipo dosis dependientes decrecientes después de haber sometido a los animales a diferentes niveles de estrés inducido por la prueba de nado forzado. Salud UIS 2012; 44 (1): 17-27

Palabras Clave: Estrés, hipocampo, proteómica, nado forzado

Preliminary study of cerebral proteomics expression
of hippocampal region from rats exposed to different
stress levels induced by forced swimming

ABSTRACT

Introduction: in general stressful stimuli can induce adaptive maladaptive responses, depending among other things, of their intensity and duration. However, no studies were found in the literature that link quantitatively and qualitatively the intensity of stress to which an animal is exposed, and hippocampal protein expression. Objective: to evaluate the differential hippocampal protein expression in Wistar-UIS rats, exposed to dissimilar levels of stress induced by forced swimming. Materials and methods: we used 30 rats randomly assigned to 3 groups according to duration of exposure to forced swimming as stressor stimulus (0, 5 and 15 minutes). 24 hours after the dorsal hippocampi were removed and two-dimensional electrophoresis was performed to the extracted proteins. Then, image processing of the gels obtained was performed using the PDQuest 2D software. Those proteins in which intensities were detected associated with the stimulus-exposure times were presumptively identified using Export Protein Analysis System (EXPASY) a bioinformatics database. Results: according to the bioinformatic and proteomic analyses we identified 60 proteins, 38 of which were common to both left and right hippocampi, 13 were found only in the right hippocampi and 9 in the left. Conclusion: dose-dependent decreasing rate differences in protein expression between the left and right hippocampus were found after animals were subjected to different levels of stress induced by forced swimming test. Salud UIS 2012; 44 (1): 17-27

Keywords: Stress, hippocampus, proteomic, forced swimming

El uso del término estrés se ha popularizado sin que la mayoría de las personas tengan claro en qué consiste. Al revisar la extensa literatura sobre el tema, se encuentran multitud de definiciones, algunas de las cuales lo abordan indistintamente desde la perspectiva del estrés como estímulo, respuesta o consecuencia.

Hans Selye, considerado el padre del concepto de estrés, lo definió como el síndrome o conjunto de reacciones fisiológicas no especificas del organismo a diferentes agentes nocivos del ambiente, de naturaleza física o química, provocando un aumento de la tasa metabólica¹. En ese sentido, todos los seres vivos en su vida cotidiana están expuestos a diferentes niveles de estrés. Sin embargo, existen niveles de estrés que inducen respuestas adaptativas, biológicas y comportamentales que son favorables para el individuo y la especie, mientras que niveles altos y/o sostenidos de estrés inducen respuestas mal adaptativas. En esta línea de pensamiento hoy se acepta que muchas de las patologías humanas se asocian a altos niveles de estrés, dentro de las cuales se pueden mencionar depresión, ataques de pánico, fobias, trastornos obsesivo-compulsivos, estrés postraumático, trastornos de memoria, atención, etc¹.

Las neurociencias han asociado al estrés con muchas estructuras del sistema nervioso central, entre ellas el hipocampo y la amígdala, estructuras particularmente susceptibles a los efectos del estrés no controlado, provocando cambios a través de la plasticidad neuronal principalmente en el hipocampo, estructura que juega un papel crucial en el aprendizaje, la memoria y las emociones². Por otro lado, la proteómica aplicada a la identificación y cuantificación de proteínas cerebrales, está siendo utilizada ampliamente en las neurociencias con el fin de buscar marcadores diagnósticos y nuevos sitios de acción de medicamentos^3,4,5. En este sentido, se recurre con frecuencia al uso de modelos animales que ilustren mecanismos psicopatológicos para estudiar el comportamiento de los seres humanos, siendo las ratas uno de los modelos más empleados para estos estudios^1,6,7. En modelos animales, el estrés severo crónico produce atrofia del hipocampo y la corteza prefrontal, e hipertrofia de la amígdala lateral¹. Estas alteraciones morfológicas se acompañan de deterioro en la memoria, el aprendizaje y el procesamiento emocional de los estímulos sensoriales y pueden constituirse en modelos de depresión inducidos por la persistencia del estrés.

Dentro de los modelos para el estudio de estrés y depresión se destaca la prueba de nado forzado, descrita por primera por Porsolt⁸. Es actualmente una de las pruebas más utilizadas para evaluar distintos tipos de tratamiento antidepresivos en modelos animales. Algunos de los argumentos a su favor como modelo de depresión se fundamentan en el hecho de que incluye la exposición a un estímulo estresor "inescapable" que induce comportamientos homologables con algunas manifestaciones depresivas en el humano (comportamientos del tipo "desesperanza aprendida")⁹ y por una razonable sensibilidad a los efectos de algunos fármacos antidepresivos.

Aunque se han encontrado estudios de análisis proteómico dirigido al hipocampo, que demostraron la asimetría lateral empleando un enfoque combinado de electroforesis bidimendional 2-D PAGE y espectrometría de masas¹⁰, no se ha usado la prueba del nado forzado, como modelo de depresión para determinar la relación entre magnitud del estrés y expresión proteómica en la estructura cerebral involucrada. Por esta razón, el objetivo del presente estudio fue evaluar la expresión diferencial de proteínas hipocampales en ratas Wistar-UIS, expuestas a diferentes niveles de estrés inducido por el nado forzado.

METODOLOGÍA

Material biológico
Se emplearon 30 ratas Wistar-UIS machos con un peso entre 180 y 200 gramos al comienzo de las observaciones (2 meses de edad aproximadamente), provenientes del bioterio de la facultad de salud de la Universidad Industrial de Santander; mantenidas bajo temperatura controlada (21 ± 2°C), humedad de 65% ± 5, ciclos de luz/oscuridad de 12 horas siendo encendida la luz a las 7 de la mañana, y con libre acceso de comida y agua. Las ratas fueron distribuidas al azar de acuerdo con el tratamiento (tiempo de exposición a la prueba de nado forzado) y colocadas en cajas viveros (50cm x 30cm x 15cm). Se conformaron 3 grupos experimentales con 10 animales cada uno (Grupo 1: 5 minutos de exposición; Grupo 2: 15 minutos de exposición y Grupo 3: Sin exposición al nado forzado) donde cada animal fue expuesto durante un tiempo correspondiente según la asignación aleatoria que le correspondió (Tabla 1).

A una distancia de 1.5 metros por encima de la piscina, se ubicó una cámara ligada a un circuito cerrado de televisión y grabación digital cuyos instrumentos y operador se ubicaron en un cuarto contiguo. La iluminación en el centro de la piscina fue de 296 lux y el cuarto experimental está construido con material cuyas paredes amortiguan el sonido externo.

Procedimientos
Todos los animales fueron trasladados del bioterio de reproducción al bioterio de experimentación con 72 horas de anticipación al experimento. Las condiciones ambientales de ambas dependencias son semejantes. Los animales fueron manipulados por el experimentador una vez al día durante 1 minuto como forma de adaptación previa a las pruebas de nado forzado. Veinticuatro (24) horas después de finalizada la exposición a la prueba de nado forzado, los animales fueron sacrificados por decapitación. A cada animal se le extrajo el cerebro, el cual fue colocado en una caja de Petri cubierta de papel humedecido con solución salina (NaCl 0.9% (p/v)). Una vez lavado el cerebro se extrajo la el hipocampo teniendo en cuenta la subdivisión de los hemisferios cerebrales derecho e izquierdo (Figura 2). El tejido húmedo fue pesado, rotulado y se mantuvo en nitrógeno líquido hasta su posterior uso en las pruebas de análisis proteómico.

La solubilización de las proteínas se realizó suspendiendo el tejido cerebral en un buffer de lisis (Tris base (40 mM), Solución CHAPS4% (p/v), con suplementos de Urea (7M), tiourea (2M) y PMSF (1mM) como inhibidor de proteasas. Las muestras fueron homogenizadas mediante agitación en vortex (1200 rpm) durante aproximadamente 4 horas. Posteriormente a su homogenización, las muestras se centrifugaron en un equipo IEC CL31R Multispeed (Marca: ThermoScientific): a 13000 rpm, 4°C, durante 20 min. La concentración de proteínas solubles se determinó por la metodología de Bradford¹¹.

Una vez obtenidos los extractos de proteínas totales solubles, éstas fueron separadas mediante electroforesis bidimensional (2D-SDS-PAGE). En el proceso se utilizaron tiras de rehidratación (ReadyStrip IPG strips, Bio-rad) de 7 cm de longitud con rango de pH 3-10 y se rehidrataron mediante el método de rehidratación pasiva (sin voltaje) durante 12 a 16 horas. Una vez que las proteínas fueron separadas en función de sus propiedades de carga (pI)(50 μA (microamperios)), se separaron en función de su tamaño o peso molecular mediante electroforesis SDS-PAGE en geles de poliacrilamida (12% p/v) de 12 cm. Para visualizar las proteínas en el gel éstos fueron teñidos utilizando azul de Coomassie coloidal.

Una vez teñidas las proteínas en los geles de SDS-PAGE, éstas fueron escaneadas con un densitómetro (UMAX PowerLook 2100XL) para adquirir las imágenes de los geles teñidos. Este dispositivo digitaliza las imágenes utilizando 800 x 1600 puntos por pulgada (dpi), lo cual ofrece alta resolución y permite capturar finos detalles cuando se escanean transparencias. Las diferencias de intensidad y cantidad de manchas (spots) se analizaron con ayuda del software PDQUEST 2D (Bio-rad versión 8.0.1). Por último, aquellas proteínas expresadas, bajo los diferentes tiempos de exposición de la prueba de nado forzado, que presentaron diferencias significativas en sus intensidades, fueron identificadas con la ayuda de la base de datos bioinformática EXPASY, utilizando la herramienta bioinformática de caracterización compute pI/M correspondiente a la misma base de datos de EXPASY.

El software PDQUEST 2D, Bio-rad versión 8.0.1 cuantifica la densidad de las manchas proteicas, lo que permite obtener medidas del nivel de expresión de cada una de ellas.

Finalmente el programa emite una imagen maestra "master" que reúne todas las manchas, con una distribución gaussiana, identificadas en los geles que conforman cada grupo.

Después de realizar un examen cuidadoso y haciendo una depuración de las manchas, fueron seleccionadas solamente aquellas cuyos intervalos de confianza (95%) de las intensidades no se superpusieran asumiéndolas como probablemente diferentes. Se verificó para cada uno de los grupos (5 y 15 minutos de exposición) con respecto al grupo control, y entre los grupos estudiados, las variaciones de la expresión de las manchas de proteínas analizadas.

De manera presuntiva, y como una manera de encontrar la posible identidad de aquellas manchas que presentaron diferencias en sus niveles de expresión, se realizó una comparación entre los valores de masa molecular (PM) y punto isoeléctrico (pI) de las proteínas identificadas en el estudio (muestras experimentales) con respecto a los pesos moleculares y puntos isoeléctricos de aquellas proteínas encontradas en la base de datos bioinformática EXPASY, correspondiente a los valores teóricos. Se asignaron las identidades a aquellas proteínas que presentaron diferencias en sus valores de PM iguales o menores a ± 2.0 KDa, y diferencias en los valores de pI iguales o menores de ± 0.2 unidades con respecto a los valores de PM y pI de las bases de datos. El criterio de identificación se determinó teniendo en cuenta las variaciones que se han reportado en las proteínas identificadas, separadas por 2D-PAGE, que se encuentran reportadas en la base de datos (SWISS 2D-PAGE). Estas aplicaciones están disponibles en el sistema experto de análisis de proteínas (EXPASY). Como criterio de búsqueda para hipocampo, fueron utilizados los términos: cerebro de rata, hipocampo, Wistar (ratbrain, hippocampus, Wistar).

RESULTADOS

De acuerdo con el análisis de todos los geles que conformaron el experimento se obtuvieron inicialmente los datos de la cantidad de manchas detectadas en el hipocampo derecho e izquierdo. En el hipocampo de las ratas estudiadas se obtuvo lo siguiente: En el hemisferio derecho se detectaron 331 manchas en el grupo control (sin exposición al nado T0), 268 en el tratamiento de 5 minutos de exposición a la prueba de nado forzado (T5) y 145 en el tratamiento de 15 min de exposición (T15) (Figura 3).

De igual forma, en el hemisferio izquierdo del hipocampo se detectaron 149 manchas en el grupo control (sin exposición al nado T0), 178 en el tratamiento de 5 minutos de exposición a la prueba (T5) y 99 en el tratamiento de 15 min (T15) (Tabla 2 y figura 3).

Teniendo en cuenta los criterios enunciados anteriormente y de acuerdo con el análisis proteómico y comparándolo con la base de datos EXPASY, se encontraron 60 proteínas que presentaron diferencias en sus niveles de expresión en los grupos analizados, de las cuales 38 son comunes al hipocampo derecho e izquierdo (HD/HI); 13 se encontraron solo en el hipocampo derecho (HD) y 9 en el hipocampo izquierdo (HI), (Figura 4).

Las 60 proteínas detectadas por técnicas bioinformáticas se encuentran en las Tablas 3, 4 y 5. Estas son proteínas que participan en la estructura del citoesqueleto, en las vías de señalización celular, enzimas relacionadas con el metabolismo,transporte y el tráfico endocítico, neuroplasticidad, procesamiento, plegamiento y degradación de proteínas, proceso de transcripción y proteínas receptoras.

Del total de las proteínas expresadas en el análisis proteómico, se destacaron las asociadas con la plasticidad neuronal. La Figura 5Figura 5 representa algunos ejemplos de esas proteínas ilustrando la relación entre la intensidad del estímulo estresor y su nivel de expresión.

De acuerdo a los resultados obtenidos, además de la lateralización del hipocampo con respecto al número de manchas detectadas inicialmente por el programa, se observó una asimetría en el hipocampo derecho con relación a las proteínas asociadas con la neuroplasticidad, presentándose un 23% de expresión de proteínas en el hipocampo derecho con relación a un 11,11% en el hipocampo izquierdo como se muestra en la comparación de la Figura 6 y 7.

DISCUSIÓN

Del total de las proteínas obtenidas en el análisis proteómico, aproximadamente el 20% intervienen en la neuroplasticidad cerebral entre las cuales podemos mencionar a manera de ejemplos: la proteína hipocalcina neuronal especifica de unión a calcio, la cual juega un papel fundamental en la depresión a largo plazo (tipo de plasticidad neuronal en el que hay una reducción de la eficacia de la sinapsis neuronal). La proteína LCHN, interviene en la neuritogénesis, así como en la recuperación neuronal y/o reestructuración de la isquemia transitoria cerebral tras el hipocampo. El receptor de nociceptina, que es un ligando natural acoplado a la proteína G, anteriormente llamado receptor de opiode¹², y juega un papel fundamental en la neuroplasticidad del hipocampo, en el aprendizaje y la memoria. El Antígeno de superficie de los leucocitos CD47, el cual participa en la formación de la memoria y la plasticidad sináptica. La Contactina-4, interviene en la sinaptogénesis. La Proteína homologa ¹, juega un papel importante en los cambios estructurales que se producen en las sinapsis durante el desarrollo y plasticidad neuronal de larga duración. La Neurogranina, que juega papel en la plasticidad sináptica y aprendizaje espacial. El Factor activador de plaquetas acetilhidrolasa IB, es una proteína importante durante el desarrollo del cerebro y las neuronas del hipocampo. La Proteína 39 de señalización RING, participa en la potenciación a largo plazo: transmisión de señales entre dos neuronas en forma duradera. La Gamma-sinucleína, a pesar de que originalmente caracterizaron a esta proteína en el núcleo y citoplasma, micrografías electrónicas evidenciaron que en la región CA3 del hipocampo de la rata esta proteína se encuentra restringida al citoplasma de las terminaciones presinápticas¹³, donde desempeña un papel en la integridad de la red de neurofilamentos e interviene en la modulación de la arquitectura axonal durante el desarrollo y en el adulto y la Proteína de unión a calcio beta P23K, interviene en la proliferación axonal y plasticidad sináptica.

Con respecto a la relación expresión proteica vs intensidad del estímulo de las proteínas asociadas con la neuroplasticidad, se observó que la proteína hipocalcina neuronal especifica de unión a calcio, elreceptor de nociceptina, la gamma-sinucleína y el antígeno de superficie de los leucocitos CD47, disminuyeron a medida que aumentó la intensidad del estímulo (dosisefecto decreciente), siendo esta la tendencia de la mayor parte de las proteínas expresadas según el análisis proteómico general. En el caso específico de la proteína receptora de nociceptina, algunos estudios indican que juega un papel fundamental en la neuroplasticidad, así como en el aprendizaje y memoria dependientes del hipocampo. Además, se ha demostrado que inhibe la inducción de la potenciación a largo plazo (LTP)¹², modula una serie de funciones cerebrales, incluyendo las emociones y los comportamientos instintivos. Los resultados obtenidos en nuestros experimentos indicarían que al aumentar el tiempo de exposición al estímulo de nado forzado, las ratas no sólo disminuyen su expresión de proteínas en el hipocampo, sino que también se afecta la capacidad de aprendizaje y memoria dependiente del hipocampo, tal como se observó.

Lo anterior demuestra que la exposición a la prueba del nado forzado origina cambios neurobiológicos asociados al estímulo estresor, y que dichos cambios son más marcados a medida que se aumenta la intensidad del estresor. Estudios llevados a cabo in vivo e in vitro indican que la magnitud del estrés (en duración e intensidad) deteriora la memoria en el hipocampo, lo cual interferiría con la inducción de la potenciación a largo plazo (LTP) hipocámpica (o procesos relacionados)¹⁴. En el equivalente experimental de la indefensión aprendida (donde las ratas no pueden realizar ninguna respuesta adaptativa para escapar del estímulo estresor), se produce un deterioro de la memoria y el aprendizaje¹⁴. Por esta razón, el efecto del estrés pareciera afectar el rango fisiológico de la plasticidad sináptica de manera que se favorecería el desarrollo de la depresión sobre la potenciación.

De acuerdo con los resultados obtenidos en el presente estudio se detectó la expresión de proteínas asociadas con la neuroplasticidad, con un claro efecto dosis-dependiente decreciente, indicando que la intensidad del estímulo estresor a que fue sometido el animal durante la prueba de nado forzado, probablemente podría afectar la memoria y el aprendizaje.

La liberación de neurotransmisores y algunas otras funciones cerebrales, modulan a corto y largo plazo la eficacia sináptica y éstos son regulados por los iones de calcio, el cual, a su vez es regulado por las proteínas de unión a calcio¹⁵. En el presente estudio se expresaron dos proteínas que están relacionadas con la unión a calcio y que juegan un papel fundamental en la plasticidad neuronal, entre ellas están la proteína hipocalcina neuronal específica de unión a calcio y la Proteína de unión a calcio beta P23K. En la primera se observó una expresión de dosis efecto decreciente mientras que la segunda, no se detectó en el grupo control, pero si una baja expresión en los otros grupos (T5 y T15), como se muestra en la figura 5.

Estudios previos indican que el calcio juega un papel principal en la mediación de distintos eventos intracelulares, que incluyen la plasticidad neuronal, la supervivencia y la muerte celular^16,17. La falta de movilización de calcio citosólico sería responsable de cambios en la excitabilidad sináptica, cambios que probablemente conforman la "memoria de aprendizaje"¹⁶. De acuerdo con la expresión decreciente de estas proteínas ocasionadas por la intensidad del estímulo estresor, se provocarían cambios neurobiológicos que podrían influir sobre la memoria y el aprendizaje.

Otro grupo de proteínas que se encontraron en el análisis proteómico con un alto nivel de expresión son aquellas que forman parte del citoesqueleto y la envoltura nuclear; dentro de las cuales destacamos la Ezrina, proteína que actúa como un intermediario entre la membrana plasmática y el citoesqueleto de actina. Esta proteína se expresa en el hipocampo y desempeña un papel clave en la adhesión a la superficie celular, la migración, la organización y morfogénesis de células epiteliales. Otra proteína es la ADP- proteína factor 2 de ribosilación, que funciona como regulador del tráfico vesicular y en la organización del citoesqueleto de actina.

Se encontraron diferencias en la expresión de proteínas entre el hipocampo derecho e izquierdo del tipo dosis dependientes decrecientes después de haber sometido a los animales a diferentes niveles de estrés inducido por la prueba de nado forzado. Se encontró una lateralidad funcional importante entre el hipocampo derecho e izquierdo con relación a la expresión de las proteínas asociadas a la neuroplasticidad.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece al Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología y al Laboratorio de Neurociencias y Comportamiento de la Universidad Industrial de Santander. Se agradece también el apoyo financiero de Colciencias a través del Proyecto N° 201124300099092.

CONFLICTO DE INTERÉS

Los autores manifestamos no tener conflictos de interés.

CONSIDERACIONES ÉTICAS

El presente proyecto de investigación se rigió de acuerdo con todas las disposiciones y normas éticas, científicas y técnicas previstas (artículos 87 a 93) de la Resolución 008430 de 1993 del Ministerio de Salud. Los animales de experimentación usados, fueron aportados por el bioterio de la facultad de Salud y cumplen con la normatividad vigente del ministerio de Salud y las disposiciones de la ley 84 de 1989 referente a la investigación biomédica con animales. Adicionalmente, el presente proyecto cuenta con la aprobación del comité de ética de la Facultad de Salud de la Universidad Industrial de Santander.

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