PROPAGACIÓN In vitro DE Heliconia curtispatha P, PLANTA UTILIZADA CONTRA LA MORDEDURA DE SERPIENTES POR ALGUNAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE LA REGIÓN COLOMBIANA DEL URABÁ

In vitro PROPAGATION OF Heliconia curtispatha P, PLANT USED AGAINST SNAKEBITE BY SOME RURAL COMMUNITIES OF THE COLOMBIAN REGION OF URABÁ

Juan C. ALARCÓN P.^1,2*; Diego M. MARTINEZ R.¹; Andrea SALAZAR-OSPINA^1,2

1 Programa Ofidismo/Escorpionismo. Universidad de Antioquia. A.A. 1226. Medellín, Colombia.

2 Departamento de Farmacia. Facultad de Química Farmacéutica. Universidad de Antioquia. A.A.1226. Medellín, Colombia.

Recibido: Agosto 19 de 2009
Aceptado: Septiembre 16 de 2011

RESUMEN

Heliconia curtispatha Petersen (Zingiberales) comúnmente conocida como platanillo, es usada en la medicina tradicional colombiana por su acción antiedematizante, antihemorrágica y neutralizante del veneno de Bothrops asper (mapaná) responsable del 95% de las mordeduras de serpientes en el país. Lo anterior destaca su utilidad y potencial función, como coadyuvante en el tratamiento del accidente ofídico. La propagación por cultivos in vitro, se convierte en una herramienta valiosa e interesante para su masificación, debido al difícil acceso al material vegetal en su ambiente natural y la carencia de estudios previos en multiplicación in vitro de esta especie. En el presente trabajo se obtienen plántulas a partir de semillas y se evalúa su propagación en medios de cultivo Murashige & Skoog, semisólidos y líquidos suplementados con reguladores de crecimiento tipo citoquinina. Experimentalmente, se favorece la propagación de la Heliconia (2 brotes semana^-1) cuando se utiliza medio Murashige & Skoog líquido sin adición de reguladores de crecimiento o al emplear Murashige & Skoog semisólido adicionándole 2 mg.L^-1 6-Bencilaminopurina 0.93 brotes.semana^-1. Este es el primer reporte de propagación in vitro de H. curtispatha y el primer paso para el estudio de metabolitos secundarios con potencial antiofídico que pueden producirse bajo tales condiciones.

Palabras Clave: Heliconiaceae, Zingiberales, in vitro, etnobotánica, micropropagación.

ABSTRACT

Heliconia curtispatha Petersen (Zingiberales) commonly known as platanillo, is used in colombian traditional medicine by its anti-edema, antihaemorrhagic and neutralising action of Bothrops asper (mapaná, X) venom, responsible for 95% of snakebites in the country. The previous, emphasizes its utility and potential function as helper in the treatment of the ophidian accident. The in vitro propagation techniques becomes an interesting tool for plant and metabolites production, because of the hazardous accessibility to plants in their natural environment and the deficiency of previous studies on in vitro multiplication of the specie. In the present work, plantlets are obtained from seeds and its in vitro p ropagation is evaluated in Murashige & Skoog semi-solid and liquid medium without or in combination with citokinines-like. Experimentally, it promotes the propagation of Heliconia (2 weeks outbreaks -1) when using Murashige & Skoog liquid medium without added growth regulators or by using Murashige & Skoog semisolid adding 2 mg.L^-1 6-benzylaminopurine 0.93 week outbreaks -1. This is the first report of in vitro propagation of H. curtispatha and the first step for the study of secondary metabolites with potential venom that can occur under such conditions.

INTRODUCCIÓN

Las heliconias, plantas herbaceas que se propagan lentamente por rizomas o semillas (1), son especies distribuidas en un amplio rango de altitud (400 a 1800 m.s.n.m.), en diferentes habitats (pantanos, riberas de rios, barrancos, y bosques tropicales) (2) y con hojas grandes y peciolos casi ausentes o muy alargados. Las flores perfectas, penden como inflorescencias de numerosos colores y bracteas, mientras que los frutos contienen de 1 a 3 semillas por drupa y colores de tonalidad azul o naranja, segun el grado de madurez (3). En Colombia, concretamente en las regiones Andina y Pacifica, se encuentra una de las mayores diversidades de especies de este genero vegetal (4), incluyendo la Heliconia curtispatha Petersen, que se conoce tradicionalmente como platanillo rojo o nakutagar (en lengua Cuna). Esta especie, cuya composicion quimica no ha sido estudiada (5), alcanza alturas hasta de seis metros y posee hojas alternas con limbos largos y anchos, peciolos envolventes convertidos en vainas rojizas, frutos azules, y flores de color amarillo agrupadas en racimos planos con espatas y pedunculos rojos. En la medicina tradicional, la decoccion de rizomas y hojas se utiliza contra el reumatismo (6) y al parecer, el ''platanillo rojo'' podria constituirse en una gran alternativa terapeutica para la comunidad, pues, ademas del uso tradicional referenciado, se ha encontrado que sus componentes metabolicos resultan utiles como antiedematizantes, antihemorragicos y neutralizantes del veneno de Bothrops asper (mapana equis), especie causante del 50 al 70% de las mordeduras de serpiente en Colombia (6-10).

Por las dificultades que presentan las heliconias para su propagacion por fuera de su entorno natural, el cultivo de tejidos se constituye en una herramienta valiosa para masificar su produccion; sin embargo, su utilizacion no ha sido masiva a partir de semillas y no se han establecido para esta especie protocolos de micropropagacion. Los trabajos reportados con la propagacion han sido a partir de yemas e induccion de tejido desdiferenciado con características organogénicas para otra especie emparentada (H. pistacorum) (11-18).

Estas alternativas de micropropagación o de producción metabólica in vitro, son estrategias aún no exploradas en H. curtispatha, por lo que la realización de este trabajo encamina los esfuerzos a obtener especímenes in vitro que al provenir de las semillas garanticen la uniformidad en la producción con escasa o ninguna variación somaclonal, aún no reportadas para esta especie. Por otra parte, se busca evaluar, en forma preliminar, la desdiferenciación tisular como estrategia de potenciales suspensiones celulares generadoras de metabolitos con actividad neutralizante del veneno de serpientes y otros efectos adicionales como, el neurotóxico, el miotóxico, el cardiotóxico y el agregante plaquetario (19).

MATERIALES Y MÉTODOS

Embriones obtenidos de semillas colectadas e identificadas por el personal del Jardín Botánico Joaquín Antonio Uribe de la ciudad de Medellín, Colombia (1538 m.s.n.m.), fueron lavados con jabón iodado y abundante agua corriente antes de su desinfección por exposición a NaClO (2% V/V, 25 min.) y transferencia aséptica a frascos de cultivo dispuestos con un medio nutritivo semisólido previamente esterilizado por autoclave (121ºC / 15 psi / 15 min.) y compuesto por las sales básicas propuestas por Murashige & Skoog (MS) (20): pH (5,7-5,8), sacarosa (30 g/l) y agar (7 g/l). Una vez obtenidas las plántulas (aproximadamente 6 meses después de ser transferidas al medio citado), éstas sirvieron como material de partida para los ensayos realizados, en los que se incluyeron medios nutritivos semisólidos como el utilizado para la obtención de las plántulas (medio control), o, con adición de reguladores de crecimiento tipo citoquinina 6-Bencilaminopurina (BA), o, 6- furfurilaminopurina (Kinetina) a concentraciones de 0.5, 1, 2, 4 en mg/L (tratamientos).

Doscientos setenta plántulas distribuidas en dos repeticiones (135/ensayo: 8 tratamientos y un grupo control) se mantuvieron por cinco semanas bajo condiciones controladas de temperatura (25 ± 1^oC), con fotoperiodicidad correspondiente a dia largo (16 h de luz, 50 µmol m^-2 s^-1) y revisiones semanales de las variables dependientes del proceso (numero de hojas, cantidad de brotes nuevos y longitud de los mismos (cm), altura de las plantulas (cm), numero de raices formadas y longitud radicular (cm)), como se observa en la figura 1.

Adicionalmente y para establecer los efectos de los tratamientos en cada variable de estudio se utilizo la prueba de Newman-Keuls, el test de esfericidad de datos de Mauchley y la prueba multivariada de Pillai-Bartlett. Los datos se procesaron en el paquete STATISTICA 7.0 (StatSoft^® Inc., Tulsa, OK, USA) y las pruebas se consideraron significativas con una probabilidad de error α < 0,05.

Finalmente, la tasa de velocidad de multiplicacion- TVM- (en medios semisolidos y liquidos) se calculo como la diferencia entre el numero de brotes obtenidos al final del ciclo y el numero de explantes introducidos al ciclo de multiplicacion, dividida por el tiempo de duracion del ciclo:

TVM = (numero de brotes finales - numero de brotes iniciales) / tiempo.

RESULTADOS Y DISCUSION

Aunque la propagacion mediante cultivo ''in vitro'' de Heliconia curtispatha no ha sido descrita previamente se dispone de informacion acerca de los factores que pueden estar involucrados en la micropropagacion de especies relacionadas (12, 13, 16), en la que al parecer, la inclusion de citoquininas (BAP o kinetina) en los medios nutritivos tiende a promover un mayor desarrollo de brotes en las plantas (12-14, 16, 21-28).

Por su parte, se ha observado en este trabajo con respecto a otros (21-23, 27) que no hay diferencias significativas en el numero de brotes generados como consecuencia de la adicion de estos reguladores de crecimiento en los medios semi-solidos como se ilustra en la tabla 1; sin embargo, al igual que en los estudios citados, el mayor numero de brotes y la mayor tasa de multiplicacion se obtiene con el tratamiento que incluyen BAP a una concentracion de 2 mg/L. Adicionalmente, un estudio (13) concluye que con concentraciones altas de kinetina se logra un mayor numero de brotes con respecto al control e igualmente se ha reportado en especies vegetales relacionadas como la Renealmia alpinia (Rottb) (29), no presentandose diferencias significativas sobre esta variable.

Los resultados llevan a pensar posiblemente en un eventual efecto promotor consecuente con la adicion de este regulador a una concentracion de 4 mg/L (tabla 1, tratamiento 8), comparable al conocido para otras familias afines, como las Musaceas y Zingiberaceae, en las que el empleo de altas concentraciones de este regulador favorece la generacion de brotes (25-27); sin embargo, esta aseveracion resulta diferente a lo observado en otras especies de Heliconia (16) en las que las altas concentraciones causan disminucion en la frecuencia de regeneracion de brotes. Es necesario destacar el efecto contradictorio observado en la tabla 1 con respecto a la utilizacion de reguladores de crecimiento, donde una concentracion de 2 mg/L de BAP promueve una buena generacion de brotes en contraste con la kinetina (2,0 mg/L Kin), en la que se evidencia una disminucion en el numero de brotes con relacion al control, sin que esta pueda asociarse a un efecto de dosis inversa, pues una concentracion mayor de este regulador lograria promover la aparicion de un mayor numero de brotes (tratamiento 8).

Con relacion a la longitud de los brotes obtenidos ilustrados en la tabla 1 o al numero de raices formadas como se muestra en la tabla 2, no hay diferencias estadisticamente significativas (p = 0,40) entre los tratamientos empleados, o de estos con el control, y en consecuencia ninguno de los tratamientos utilizados muestra un efecto promotor o inhibidor a destacar. Asimismo, la longitud de las raices recien formadas no es consecuencia de la accion de un regulador en particular, pues aunque algunos tratamientos presentan un aparente efecto promotor comparado con las plantulas expuestas al medio de cultivo utilizado como control, como se muestra en la tabla 2, en los tratamientos 5 y 6; ninguno de estos alcanza una significancia estadistica (p = 0,80) que permita suponer que la utilizacion del mismo, es promotor de una mayor elongacion de estas estructuras.

Estos resultados son contrarios a algunos trabajos en los que se muestra un efecto negativo de los medios liquidos en condiciones estaticas (30, 31), al parecer consecuente con una mayor facilidad de absorcion de nutrientes e hiperhidricidad que pueden afectar el desarrollo normal de los explantes. El medio liquido sin ningun regulador del crecimiento es suficiente para inducir en buena proporcion la generacion de brotes con una TVM de 2,0 brotes/semana, superando incluso, en buena medida, los resultados obtenidos en los tratamientos dispuestos con BAP en los que en el mejor de los casos se logró una TVM de 1,22 brotes/ semana. Lo observado en los resultados ilustra un grado de superioridad a los obtenidos en medios semisólidos, en los cuales se percibe la necesidad de suplementarlos con BAP. Lo anterior ofrece una ventaja adicional, ya que la ausencia de reguladores de crecimiento en los medios de cultivo puede contribuir a disminuir la variación somaclonal que podría ser causada por la acción de los mismos.

En este trabajo es adecuado resaltar el suplemento de los medios de cultivo semisolidos con una concentracion de 2 mg/L de BA el cual presenta una TVM de 0,93 brotes/semana o de 4 mg/L de kinetina con TVM de 0,86 brotes/semana, sin que los efectos atribuidos a estos reguladores sean efectos de dosis, o con relacion entre si, pues como se ha observado en otros trabajos (13) al utilizar concentraciones altas de kinetina se logra un mayor numero de brotes que al utilizar la misma concentracion de BAP (24). Esto significa comparativamente que las concentraciones utilizadas podrian no ser elevadas; de hecho, concentraciones altas causan disminucion en la frecuencia de regeneracion de brotes en diferentes heliconias, como Heliconia psittacorum (16), aunque en algunos casos esto no se constituye una constante, pues de manera opuesta se ha conocido que en diversas plantas de esta familia o familias afines, como la Musaceae y Zingiberaceae, es necesario emplear altas concentraciones de este regulador para favorecer la generacion de brotes (25-27).

CONCLUSIONES

La tardanza en produccion metabolica, sumada a diversos factores como variacion en la expresion, dependencia de condiciones climaticas o medioambientales y la alta exigencia de suelos, son razones suficientemente poderosas para considerar que las tecnicas de manipulacion in vitro son las principales estrategias a desarrollar en masificacion, micropropagacion y produccion metabolica de numerosas plantas. Adicionalmente, la Heliconia curtispatha constituye una gran alternativa terapeutica de atencion primaria en accidentes ofidicos o en una fuente generadora de moleculas con importancia farmaceutica. Este es el primer reporte de propagacion in vitro de Heliconia curtispatha y adquiere mayor importancia pues con el se encaminan los esfuerzos a obtener especimenes in vitro y a generar plantas que con escasa variacion somaclonal garanticen uniformidad en la produccion y se conviertan en un mecanismo alterno de generacion de metabolitos secundarios con potencial efecto inhibitorio de la accion del veneno de Bothrops asper que pueden producirse bajo tales condiciones. Por su parte se observa que el medio liquido sin la adicion de reguladores de crecimiento es suficiente para la propagacion de Heliconia curtispatha en condiciones in vitro.

AGRADECIMIENTOS

Al Jardin Botanico Joaquin Antonio Uribe de la ciudad de Medellin, Colombia por la coleccion e identificacion de las semillas que sirvieron como material de partida para los ensayos realizados y al Comite para el Desarrollo de la Investigacion (CODI) de la Universidad de Antioquia por la financiacion del proyecto EO1018.

1. Maza VM, Atehortua L. Fenologia y ecologia de Heliconia laxa (Heliconiaceae) en un bosque pluvial [Tesis de pregrado]. [Medellin, Colombia]: Universidad de Antioquia; 1992. 91 p.        [ Links ]

2. Kress WJ. Systematics of Cent ral American Heliconia (Heliconiaceae) with Pendant inf lorescences. J Arnold Arbor. 1984; 65 (4): 429-532.        [ Links ]

3. Wagner WL, Herbst DR, Sohmer SH. Manual of the flowering plants of Hawaii. rev ed. Bishop Museum special publication Pub. 83. Honolulu, United States: Univ Hawaii and Bishop Museum Press; 1999. 1919 p.        [ Links ]

4. Atehortua L, Maza V, Urrea AI. Advances in the introduction into cultivation of two wild species of the genus Heliconia. H. marginata and H. platystachys. Ecology, Phenology and in vitro regeneration. HSI Bull. 1995; 7 (3): 7-9.        [ Links ]

5. NAPRALERT Database. Heliconia curtispatha [Internet]. Chicago, USA: University of Illinois at Chicago: 2008. [citado: 2009 Mar 10]. Disponible en: http://www.napralert.org/.        [ Links ]

6. Otero R, Fonnegra R, Jimenez S. Plantas utilizadas contra mordedura de serpientes en Antioquia y Choco. Medellin, Colombia: Grandacolor; 2000. 402 p.        [ Links ]

7. Otero R, Fonnegra R, Jimenez SL, Nunez V, Evans N, et al. Snakebites and ethnobotany in the northwest region of Colombia: Part I: traditional use of plants. J Ethnopharmacol. 2000 Aug; 71 (3): 493-504.        [ Links ]

8. Otero R, Nunez V, Jimenez SL, Fonnegra R, Osorio RG, et al. Snakebites and ethnobotany in the northwest region of Colombia: Part II: neutralization of lethal and enzymatic effects of Bothrops atrox venom. J Ethnopharmacol. 2000 Aug; 71 (3): 505-511.        [ Links ]

9. Otero R, Nunez V, Barona J, Fonnegra R, Jimenez SL, et al. Snakebites and ethnobotany in the northwest region of Colombia. Part III: neutralization of the haemorrhagic effect of Bothrops atrox venom. J Ethnopharmacol. 2000 Nov; 73 (1-2): 233-241.        [ Links ]

10. Nunez V, Otero R, Barona J, Saldarriaga M, Osorio RG, et al. Neutralization of the edema-forming, defibrinating and coagulant effects of Bothrops asper venom by extracts of plants used by healers in Colombia. Braz J Med Biol Res. 2004 Jul; 37 (7): 969-277.        [ Links ]

11. Loaiza AM, Villegas JH. Adaptacion de las tecnicas de micropropagacion clonal in-vitro de ave del Paraiso Strelitzia reginae y el platanillo Heliconia psittacorum Propagacion in vitro de H. psittacorum y Strelitzia reginae [Tesis de pregrado]. [Rionegro, Colombia]: Universidad Catolica de Oriente; 1991. 77 p.        [ Links ]

12. Mora BE. Regeneracion de Heliconia wagneriana mediante el cultivo in vitro de apice terminal de la inflorescencia [Tesis de pregrado]. [Medellin, Colombia]: Universidad de Antioquia; 1995. 115 p.        [ Links ]

13. Urrea AI. Cultivo in vitro de dos especies de Heliconia latispatha y H. wagneriana para conservacion del germoplasma [Tesis de pregrado]. [Medellin, Colombia]: Universidad de Antioquia; 1992. 88 p.        [ Links ]

14. Nathan MJ, Goni CJ, Kumar PP. In vitro propagation of Heliconia psittacorum by bud cultura. Hort Sci. 1992 May; 27 (5): 450-452.        [ Links ]

15. Nathan MJ, Kumar PP, Goh CJ. High frecuency plant regeneration in Heliconia psittacorum. Plant Sci. 1993 Jan; 90 (1): 63-71.        [ Links ]

16. Goh C, Nathan M, Kumar P. Direct organogenesis and induction of morphogenic callus through thin section culture of Heliconia psittacorum. Sci Hortic. 1995 Apr; 62 (1-2): 113-120.        [ Links ]

17. Shiau YJ, Hseu SH, Wang TY, Tsay HS. Studies on tissue culture of Heliconia psitacorum 'Rhizomatosa' I. Identification and control of bacterial contamination of explants cultured. J Agric Res China. 1998; 47 (4): 346-363.        [ Links ]

18. Shiau YJ, Wang TY, Tsay HS. Studies on tissue culture of Heliconia psittacorum cv. Rhizomatosa III. Effect of cefotaxime and plant growth regulators on growth of shoot tip explants in vitro. J Agric Res China. 1999; 48 (4): 42-51.        [ Links ]

19. Kini RM (Editor). Venom Phospholipa se A₂ Enzymes. Chichester: Willey; 1997. Gowda TV. Interaction of snake venom phospholipases A₂ with plant isolates; p. 205-221.        [ Links ]

20. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol. 1962 Jul; 15 (3): 473-479.        [ Links ]

21. Machado P, Agramante D, Almanza N, Diaz D, Gomez L. Micropropagacion ''in vitro'' de la Gerbera Jamenssonii H Bolus. Biotecnologia vegetal. 2002 Jul-Sep; 2 (3): 169-178.        [ Links ]

22. Olivera Z, Gutierrez A, Gutierrez J, Rodriguez M. Cultivo ''in vitro'' de Gerbera (Gerbera Jamesonii H. Bolus) y su aclimatizacion en invernaderos. BIOAGRO. 2000; 12 (3): 75-80.        [ Links ]

23. Marulanda ML, Isaza L. Establecimiento ''in vitro'' de Heliconias con fines de produccion masiva. Sci Tech. 2004 Dic; 10 (26): 193-198.        [ Links ]

24. Gutierrez LF, Perea M, Torres O. Regeneracion de Borojoa patinoi mediante cultivo in vitro de apices caulinares. ACECIV Boletin Cientifico. 1990; 2 (3): 23-41.        [ Links ]

25. Zeng SJ, Guo SC, Wu KL, Zhang YQ, Chen GH, Duan J. In vitro propagation of Heliconia plants. J Trop Subtrop Bot. 2004 Jun; 12 (2): 153-158.        [ Links ]

26. Diniz JD, Gomes SO, Innecco R, Almeida JL, Costa JT. Evaluation of the apical dominante break and the BAP actions on in vitro multiplication of Heliconia stricta Huber. Rev Cienc Agron. 2004; 35 (Numero especial): 232-237.        [ Links ]

27. Martinez L. Desarrollo y estandarizacion de protocolo para el cultivo in vitro de gallito (Heliconia psittacorum L). Notas de Investigacion en proceso. 2009 Feb; 13 (3): 1-8.        [ Links ]

28. Sosa FM, Ortiz RS, Hernandez RP, Armas PM, Guillen DS. Propagacion in vitro de Heliconia standley Macbride en Cuba. Rev Chapingo. Serie horticultura 2009 Ene - Abr; 15 (2): 17-23.        [ Links ]

29. Alarcon JC, Martinez D, Quintana JC, Jimenez S, Diaz A, Jimenez I. Propagacion in vitro de Renealmia alpinia (Rottb), planta con actividad antiofidica. Vitae. 2008 Ene-Abr; 15 (1): 61-69.        [ Links ]

30. Perez JN. Propagacion y mejora genetica de plantas por biotecnologia (Editor). Santa Clara, Cuba: Instituto de Biotecnologia de las Plantas; 1998. Orellana P. Introduccion a la propagacion masiva; p. 125-132.        [ Links ]

31. Albany N, Vilchez J, Leon de Sierralta S, Molina M, Chacin P. Una metodologia para la propagacion in vitro de Aloe vera L. Rev. Fac. Agron. 2006 Abr-Jun; 23 (2) 213-222.        [ Links ]