RESUMEN

Palabras clave: Brucella abortus, PCR, leche, sangre, bovinos.

ABSTRACT

Objective. To evaluate the use of Polymerase Chain Reaction in the detection of Brucella abortus in cattle blood and milk samples. Materials and methods. Between 2004 and 2005 a descriptive study was carried out. One hundred and thirty six females from three different herds located in Durania, Norte de Santander, Colombia were used. The antibodies to Brucella were detected using ring test (RT). Primers B4 and B5 of internal region of gen BCSP31 (GenBank, number access M20404) were used. From those RT positive animals, blood and milk samples were obtained and along with 33 negative milk samples were evaluated by PCR. Blood samples were not analyzed for antibody detection. Different DNA extraction protocols were evaluated and a Brucella abortus gene was amplified using specific primers. Results. The 13.2% of milk samples were positive to RT (18/136), 30.3% (10/33) of negative samples for RT and 94.1% (16/17) of positive samples were both positive by PCR. It was demonstrated that PCR is an useful tool to detect Brucella abortus DNA, either in milk and blood samples. Conclusions. It was determined by PCR a DNA fragment of Brucella abortus in blood and milk of cattle. The preliminary results showed that it is possible to perform PCR as diagnostic test of brucellosis in Colombia.

Key words: Brucella abortus, PCR, milk, blood, bovines.

INTRODUCCIÓN

La brucelosis es una enfermedad que produce un impacto económico negativo en explotaciones de ganado vacuno debido a los abortos, la disminución en la producción de leche, carne y problemas de fertilidad. Se calcula que las pérdidas económicas del sector pecuario en el continente Americano ascienden a $270 millones de dólares; que se distribuyen de la siguiente manera: producción de crías (47%), producción de leche (41%) y costos de reposición (12%). En Colombia, el Instituto Colombiano Agropecuario, ICA, ha estimado pérdidas aproximadas a los $46 millones de dólares (1).

Los métodos tradicionales o comúnmente empleados en el diagnóstico de brucelosis bovina son: la demostración directa de la bacteria mediante el cultivo, considerado el estándar de oro. Sin embargo, requiere laboratorios con alto grado de bioseguridad, y las pruebas indirectas (serología) pueden dar resultados falsos positivos debido a la reacción cruzada con otras bacterias gramnegativas (2) y falsos negativos por un nivel bajo de anticuerpos. Debido a esto, es necesario buscar y aplicar métodos alternativos que contribuyan al mejoramiento del diagnóstico de la enfermedad y que se eviten los problemas relacionados con la serología. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), ha sido empleada en varios estudios para detectar la presencia de Brucella spp, en muestras de sangre, leche y otros materiales contaminados. El hecho de amplificar secuencias específicas de ADN bacteriano permite plantear que sea utilizada como un método rápido y confiable en el diagnóstico de brucelosis (3-5). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la PCR para la detección de Brucella abortus mediante la amplificación de una secuencia genómica a partir de ADN aislado de muestras de sangre y leche de ganado vacuno.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras. Se recolectaron 136 muestras de leche y 17 muestras de sangre de vacunos pertenecientes a tres fincas con antecedentes de brucelosis ubicadas en el corregimiento Hato Viejo, municipio de Durania, Norte de Santander. Los animales con cruce Pardo Suizo-Cebú, eran mayores de tres años y al momento de la toma de la muestra no presentaban síntomas clínicos de la enfermedad. Las muestras de sangre y leche se almacenaron a -20 y -80°C respectivamente hasta su uso para la PCR, y una alícuota de cada muestra de leche se almacenó a 4 °C para la detección de anticuerpos por la Prueba del Anillo en Leche (PAL).

Extracción de ADN. Para la obtención de ADN a partir de sangre bovina se emplearon dos métodos, un estuche comercial (Promega WI, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante y un protocolo basado en la utilización de fosfato de sodio (6) empleado en el Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET), Universidad de Antioquia, para diagnóstico de malaria, con algunas modificaciones. Brevemente, a 500 µl de sangre se le adicionaron 1 ml de agua ultra pura estéril, se mezclaron y se centrifugaron tres veces durante 2 min., a 2000 x g. El precipitado fue resuspendido en 50 µl de agua ultra pura estéril y seguido de la adición de 500 µl de solución fría de fosfato de sodio (NaH₂PO₄, pH 8), se mezcló por vortex y se centrifugo a 3000 x g. El sobrenadante se descartó y este paso se repitió dos veces. Posteriormente, se adicionaron 50 µl de solución de Chelex al 5%, se mezcló por vortex, se hirvió durante 10 minutos, y se centrifugó a 3000 x g durante 10 minutos. El ADN, contenido en el sobrenadante, se almacenó a -20°C en un tubo estéril hasta el momento de su utilización.

Para la obtención de ADN a partir de leche, se evaluaron tres métodos: dos empleando estuches comerciales (Promega WI, USA y Fermentas Glen Burnie, Maryland, USA), siguiendo las indicaciones del fabricante y un protocolo descrito por Romero y López (7). Un paso de centrifugación, previo a la extracción (8) fue incluido en este último protocolo. En este procedimiento se utilizó el precipitado y la fase grasa, obtenidos de la centrifugación de 1 ml de leche a 6000 x g por 10 min. Estos fueron disueltos en 500 µl de agua ultrapura estéril. Para la extracción, también se utilizaron 500 µl de la muestra de leche completa. En ambos casos se adicionaron 100 µl de Buffer NET (50 mM de NaCl, 125 mM de EDTA, 50 mM de Tris HCl pH 7.6) y 100 µl de solución de SDS al 24%. Estas muestras se incubaron a 80°C por 10 min., seguidas de enfriamiento en hielo. Se adicionaron 325 µg/ml de proteinasa K (Fermentas Glen Burnie, Maryland, USA), y se incubaron durante 90 min a 50°C. El ADN se extrajo empleando Fenol: cloroformo: alcohol isoamilico (25:24:1), se resuspendió en TE y se almacenó a -20°C hasta su utilización. La extracción del ADN de Brucella abortus se realizó a partir de 200 µl de la cepa vacunal equivalentes a 2x10⁹ UFC (Vacuna Cepa 19 resuspendida en 2 ml de agua equivalentes a 20x10⁹ UFC/ml de Brucella abortus viva liofilizada VECOL), utilizando un estuche comercial (Fermentas Glen Burnie, Maryland, USA).

La cuantificación del ADN total (ADN vacuno + ADN bacteriano) como reflejo de la eficacia y calidad del ADN obtenido por los métodos de extracción empleados, se llevó a cabo por espectrofotometría, a 260 y 280 nm.

Evaluación de la amplificación a partir del ADN obtenido de la leche. Para optimizar las condiciones de amplificación del ADN obtenido de la leche, se evaluaron diferentes concentraciones de EDTA: 0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mM. A 1 ml de leche estéril se le adicionaron 20 µl de la cepa vacunal equivalentes a 2x10⁸ UFC. A esta mezcla se le adicionaron 500 µl de la solución de EDTA a diferentes concentraciones. Los ensayos se realizaron por duplicado. La obtención del ADN se realizó empleando un estuche comercial (Promega WI, USA), utilizando el precipitado y el sobrenadante, luego de centrifugar la leche a 6000 x g por 10 min. El EDTA fue utilizado como un posible quelante del calcio presente en la leche, ya que hipotéticamente se planteó que el exceso de iones podría afectar la acción de la Taq polimerasa durante la PCR.

Nivel de detección del ADN de Brucella abortus en sangre y leche por PCR. Para establecer el nivel de detección de la técnica en sangre, se inocularon 4 µl de la vacuna, (4 x 10⁷ UFC), en 36 µl de una muestra de sangre de un animal previamente negativo por PAL y PCR. A partir de esta, se hicieron diluciones seriadas en base diez y la extracción se llevó a cabo con el protocolo reportado por Foley et al en 1992 (6).

Para establecer el nivel de detección de la técnica en la leche, se inocularon 100 µl de la vacuna (1 x 10⁹ UFC), en 900 µl de leche pasteurizada. Similarmente, se hicieron 9 diluciones seriadas en base diez, a partir de la dilución inicial con una concentración de 1x10⁸ UFC. La extracción de ADN se llevó a cabo empleando los protocolos reportados anteriormente por Romero y López (7) y la centrifugación previa reportada por Sreevatsan et al (8). Cada ensayo fue realizado por duplicado.

Amplificación del fragmento de 223pb del gen BCSP31 de Brucella abortus. Se emplearon los cebadores B4 (5'-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3') y B5 (5'-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3') los cuales reconocen una región interna de la secuencia del gen BCSP31 (GenBank, número de acceso M20404), de Brucella abortus, amplificando un fragmento de 223 pb. Las condiciones de la PCR empleadas, con algunas modificaciones, fueron descritas previamente en la literatura (9). La mezcla de reacción contenía 0.7 U de Taq polimerasa (Fermentas Glen Burnie, Maryland, USA), 2.5 µl de buffer 10X, 1.5 mM de MgCl₂, 0.2 mM de cada dNTP, 0.5 µM de cada cebador y 5 µl de ADN sin diluir y diluido 1:5 y 1:10 en un volumen final de reacción de 25 ml. El control positivo consistió en ADN aislado de las bacterias de la vacuna Cepa 19. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador (Perkin Elmer 9700, Applied Biosystems Foster city, California, USA). Los productos amplificados se visualizaron en gel de agarosa al 1.5%, teñido con 0,5 µg/ml de bromuro de etidio empleando el sistema GelDoc y el Software Quantity one (Bio-Rad Hercules, California, USA).

RESULTADOS

Detección de anticuerpos en leche. De las 136 muestras de leche analizadas por PAL, el 13.23% (18/136), dieron la prueba positiva (Tabla 1).

La finca 1 presentó el 7.69% (5/65) de casos positivos, la finca 2 el 10.6% (5/47) y la finca 3, el 33.3% (8/24) de los casos.

Evaluación de los métodos de extracción. Todos los métodos empleados para extraer y purificar ADN total de sangre y leche produjeron ADN en buena cantidad y calidad, de acuerdo a los resultados obtenidos por electroforesis y espectrofotometría. Sin embargo, análisis preliminares mostraron mejores resultados para la detección de Brucella por PCR cuando el ADN se obtuvo por los métodos a base de fosfatos (6) y Fenol:clorofomo (7) a partir de sangre y leche, respectivamente (Datos no mostrados). De aquí en adelante todas las muestras se procesaron por estos dos métodos.

Nivel de detección del fragmento de 223 pb del ADN de Brucella abortus por PCR. Para evaluar el nivel de detección de la técnica por los métodos seleccionados, se corrieron PCRs empleando ADN aislado de sangre inoculada con diferentes diluciones de la cepa bacteriana. Se encontró que la PCR era positiva en sangre que fue inoculada hasta con 4 x 10² UFC, en geles coloreados con bromuro de etidio (Figura 1).

Similar análisis a partir de muestras de leche pasteurizada y contaminada experimentalmente, mostró un nivel de detección de hasta 10 UFC (Figura 2).

Evaluación de la amplificación a partir del ADN obtenido de la leche. Al variar algunas de las condiciones de extracción del ADN a partir de leche, interesantemente se observó un incremento en la positividad cuando el ADN era extraído a partir del precipitado, independiente de la concentración de EDTA empleado y se observó amplificación con el ADN purificado a partir tanto del precipitado como del sobrenadante de las muestras, si no se incluía EDTA en la extracción (Datos no mostrados).

Correlación de la detección de anticuerpos y del ADN de Brucella abortus. De acuerdo a los resultados obtenidos, el 94.1% (16/17) de las muestras de sangre provenientes de animales positivos a la PAL, fueron también positivos por PCR y el 5.8% (1/17) resultó negativo por PCR (Tabla 2).

En este caso, 16 resultados positivos por serología coincidieron con los resultados de la PCR.

DISCUSIÓN

La Prueba del Anillo en Leche (PAL), es una técnica empleada rutinariamente en el tamizaje y monitoreo de la Brucelosis en ganado lechero (10). Aunque su sensibilidad es confiable (11), su especificidad ha sido cuestionada (12). En las fincas incluidas en el estudio se encontraron animales positivos a la PAL. Sin embargo, los resultados de animales positivos a la PAL fueron más altos en la finca 3 con respecto a las otras dos fincas (Tabla 1).

En este trabajo, se evaluaron 17 muestras de sangre de animales positivos por PAL, de las cuales el 94.1% resultaron igualmente positivas por PCR (Tabla 2).

Interesantemente, al evaluar 33 muestras de leche de animales con prueba de PAL negativa, el 30.3%, resultaron positivos por PCR (Tabla 3). Estos resultados concuerdan con los hallazgos obtenidos por otros investigadores como Hamdy y Amin (3), quienes obtuvieron PCR positivas en muestras previamente positivas por el cultivo y/o por la PAL. Leal-Klevezas et al (13) obtuvieron PCR positivas en muestras que habían sido previamente negativas por la prueba Rosa de Bengala y el cultivo. En Colombia, Rivera et al (1), reportaron reacciones inespecíficas de la PAL, al obtener resultados falsos negativos que fueron confirmados como positivos utilizando la PCR.

En el caso del resultado positivo por la PAL el cual fue negativo por PCR, y asumiendo la mayor sensibilidad de la PCR, permite sugerir que posiblemente podría tratarse de una reacción cruzada con anticuerpos generados por infecciones contra otras bacterias gramnegativas presentes en el animal y que fueron detectados por la PAL. Se han descrito reacciones cruzadas con bacterias gramnegativas tales como Escherichia coli O 157:H7 y Yersinia enterocolitica 0:9 (2).

La detección del ADN de Brucella abortus en muestras de animales negativos por la PAL, indica que la bacteria está presente en el organismo del animal, pero que los niveles de anticuerpos al momento de la toma de la muestra no era lo suficientemente altos para ser detectados por la PAL. En el trabajo realizado por Leal-Klevezas et al (13) encontraron casos de animales clínicamente sanos, negativos a las pruebas serológicas y positivos por PCR en los cuales el ADN de la bacteria fue amplificado a partir de muestras tomadas en los primeros 10 días post-infección, mientras que la serología mostró resultados positivos solo después de 18 días postinfección. Basados en las anteriores evidencias experimentales es posible proponer que la PCR podría detectar el microorganismo durante la etapa temprana de la enfermedad, cuando los animales no presentan aun síntomas clínicos. Estos resultados falsos negativos favorecen la permanencia latente de la brucelosis en las fincas, ya que los animales pueden continuar transmitiendo la infección a los animales sanos, además de que también ponen en riesgo la salud de las personas.

La extracción del ADN es considerada una de las etapas críticas en la detección no solo de Brucella en la leche o en la sangre sino para cualquier microorganismo que pueda ser detectado en estos tipos de muestras, ya que parte del éxito de la detección por amplificación está relacionado con la calidad y cantidad del ADN obtenido. En este trabajo se evaluaron diferentes métodos de extracción de ADN a partir de sangre y leche, con el fin de establecer cual era el más eficiente en cada fluido.

Al determinar las mejores condiciones para la amplificación del ADN de la leche, se encontró que todas las muestras amplificaron cuando el ADN era extraído a partir del precipitado, independiente de la concentración de EDTA empleado. En contraste, en las muestras de leche a la cual no se le adicionó EDTA, se observó amplificación en el ADN purificado a partir tanto del precipitado como del sobrenadante (Datos no mostrados). Debido a estos resultados, las muestras de leche de los animales se procesaron sin la adición de EDTA ya que según lo observado, el calcio presente en la leche no afectó la amplificación.

Se conoce que en los animales infectados, las bacterias pueden localizarse en la glándula mamaria (16). Por lo tanto, el microorganismo puede ser excretado en la leche la cual en muchos casos es consumida sin un adecuado proceso de pasteurización, teniendo como consecuencia el aumento del número de casos de esta zoonosis en los humanos. Otra de las características de Brucella spp., es su afinidad por la grasa de la leche. Según lo reportado por Rijpens et al (15), la utilización de la fase grasa para el cultivo es un método clásico aplicado a la prueba bacteriológica para la detección de brucelosis. En el presente trabajo, al realizar las amplificaciones del fragmento de 223 pb del gen BCSP31 de Brucella abortus a partir del ADN obtenido del precipitado, más la grasa de la leche que fueron sometidas a un paso de centrifugación adicional, previo a la extracción, se observaron amplificaciones del fragmento en las muestras de ADN sin diluir y una banda más intensa al utilizar una dilución de las mismas (Figura 4).

En contraste, en las muestras que no fueron centrifugadas previamente, no se observaron amplificaciones. Sin embargo, en la dilución de una de estas muestras se observó el fragmento, pero la señal fue débil al compararla con las anteriores (Figura 4).

Esto permite sugerir que el paso extra de centrifugación incrementa el chance o la posibilidad de detectar la bacteria ya que según los resultados obtenidos, muchas de las muestras sometidas al paso de centrifugación previo adicional y que dieron la prueba positiva hubieran podido ser consideradas negativas. Por lo tanto y basado en estos resultados, se sugiere la centrifugación adicional previa de las muestras, la utilización de diluciones del ADN y el protocolo de extracción recomendado en la literatura (7,8) para el diagnostico de la brucelosis por PCR. La amplificación del fragmento de 223 pb a mayores diluciones y no amplificación en las muestras poco diluidas o sin diluir podría ser el resultado de contaminantes presentes en las muestras, que por el efecto de dilución se pierden o se disminuyen permitiendo la amplificación (Figura 4).

Adicionalmente, el ADN de los bovinos presente quizás en mayor cantidad que el ADN bacteriano en algunos animales podría tener efecto negativo sobre la eficiencia de la PCR.

En este trabajo, los cebadores B4 y B5 utilizados en la PCR, amplificaron el fragmento del tamaño esperado, en la vacuna, la sangre y la leche. Según lo reportado por Baily et al (9), estos cebadores produjeron los mejores resultados luego de la evaluación de diferentes secuencias. Estos investigadores también realizaron ensayos con diferentes muestras de ADN de bacterias gramnegativas relacionadas con el género Brucella spp., y no se presentaron amplificaciones inespecíficas confirmando la especificidad de los cebadores.

Un 50% de las muestras que resultaron positivas por PCR en sangre (Tabla 2), resultaron negativas por PCR en la leche. Una probable explicación es que la bacteria no estaba siendo excretada por la leche en el momento de la toma de muestras.

El nivel de detección de la PCR a partir del ADN obtenido de la leche contaminada experimentalmente se considera aceptable, llegando a detectar el equivalente a 10 UFC/ ml. (Figura 4). Este nivel de detección coincide con el reportado por Leal-Kevezas et al (13). Por otra parte, Romero y Lopez-Goñi (7) reportaron un nivel entre 5 - 50 UFC/ml de leche y Hamdy y Amin (3) reportaron un nivel de 100 UFC/ml en leche. A pesar de detectar el fragmento de ADN de Brucella abortus aislado de muestras de sangre, este no se consideró lo suficientemente bueno, lo que sugiere evaluar otro método de extracción con el fin de mejorar aun mas el nivel de detección en sangre o evaluar otros cebadores o condiciones de PCR (Figura 1).

Los resultados en general sugieren que la PCR podría ser una prueba de diagnóstico confiable para el diagnostico de Brucella ya que los resultados positivos de la PCR coincidieron en un alto porcentaje con los de la PAL y se encontraron casos positivos por PCR en muestras negativas inicialmente por PAL. Sin embargo, se necesita ampliar este estudio, empleando un mayor número de muestras, animales de diferentes regiones con diferentes prevalencias de brucelosis y empleo de ELISA competitiva para la evaluación de anticuerpos en sangre.

Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales - PECET. Universidad de Antioquia. Grupo de Biotecnología. Universidad de Antioquia. Dr. Javier Esteban López, Miriam Suárez Galán, auxiliar técnico de epidemiología y Dra. Ángela Sánchez Pérez; funcionarios del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) Seccional Norte de Santander, por su colaboración en el desarrollo de la etapa inicial del trabajo. Al Dr. Francisco Javier Pabón, funcionario de la Secretaria de Agricultura de Antioquia.

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